UNIVERSIDAD DE JAÉN
ESCUELA POLITÉCNICA SUPERIOR DE LINARES
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FÍSICA Y
ANALÍTICA
TESIS DOCTORAL CON MENCIÓN INTERNACIONAL
ACEITES DE OLIVA VÍRGENES EXTRA
ENRIQUECIDOS CON NUEVOS
ANTIOXIDANTES PROCEDENTES DE
MICROALGAS. CARACTERIZACIÓN FÍSICO-
QUÍMICA, COLORIMÉTRICA Y ENSAYOS DE
ESTABILIDAD
PRESENTADA POR:
PIEDAD MARÍA LIMÓN VILLAREJO
DIRIGIDA POR:
Dr. D. RUPERTO BERMEJO ROMÁN
Dr. D. MANUEL MELGOSA LATORRE
JAÉN, JULIO 2017
UNIVERSIDAD DE JAÉN
Departamento de Química Física y Analítica
ESCUELA POLITÉCNIA SUPERIOR DE LINARES
TESIS DOCTORAL CON MENCIÓN INTERNACIONAL
ACEITES DE OLIVA VÍRGENES EXTRA ENRIQUECIDOS
CON NUEVOS ANTIOXIDANTES PROCEDENTES DE
MICROALGAS. CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA,
COLORIMÉTRICA Y ENSAYOS DE ESTABILIDAD.
Piedad María Limón Villarejo
Linares, 2017
D. RUPERTO BERMEJO ROMÁN
D. MANUEL MELGOSA LATORRE
CERTIFICAN:
Que el trabajo desarrollado en la presente Memoria, con el título “ACEITES DE
OLIVA VÍRGENES EXTRA ENRIQUECIDOS CON NUEVOS ANTIOXIDANTES
PROCEDENTES DE MICROALGAS. CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA,
COLORIMÉTRICA Y ENSAYOS DE ESTABILIDAD”, que presenta Dª PIEDAD
MARÍA LIMÓN VILLAREJO para optar al Grado de Doctora con Mención Internacional
por la Universidad de Jaén, ha sido realizado bajo nuestra dirección en los laboratorios
del Departamento de Química Física y Analítica, de la Escuela Politécnica Superior de
Linares perteneciente a la Universidad de Jaén.
Y para que así conste, firmamos el presente certificado en Linares, a 7 de Abril
de 2017.
Fdo.: Dr. D. Ruperto Bermejo Román Fdo.: Dr. D. Manuel Melgosa Latorre
Profesor Titular de Química Física Catedrático de Óptica
Universidad de Jaén Universidad de Granada
Tesis Doctoral presentada por Dª Piedad María Limón Villarejo, Ingeniera
Química Industrial, para optar al grado de Doctora con Mención Internacional por la
Universidad de Jaén.
La presente Memoria se enmarca en el Programa Oficial de Doctorado en
Ciencias (Real Decreto 1393/2007) y muestra parte de los resultados dentro del
Proyecto de Investigación titulado “Obtención de aceites de oliva enriquecidos en
luteína de microalgas marinas para prevención de enfermedades degenerativas,
caracterización físico-química y colorimétrica”, Proyecto de Investigación
UJA2011/13/09 financiado por Caja Rural (Universidad de Jaén).
Fdo.: Dª Piedad María Limón Villarejo
Ingeniera Química Industrial
ÍNDICES
TESIS DOCTORAL
ACEITES DE OLIVA VÍRGENES EXTRA ENRIQUECIDOS CON NUEVOS
ANTIOXIDANTES PROCEDENTES DE MICROALGAS. CARACTERIZACIÓN FÍSICO-
QUÍMICA, COLORIMÉTRICA Y ENSAYOS DE ESTABILIDAD.
ÍNDICE GENERAL
1.- INTRODUCCIÓN. JUSTIFICACIÓN ........................................................................ 1
2.- ANTECEDENTES ................................................................................................... 5
2.1.- LAS MICROALGAS COMO FUENTE DE PRODUCTOS DE ALTO VALOR ......... 5
2.1.1.- Las microalgas frente a cultivos convencionales .................................... 8
2.1.2.- Aplicaciones ......................................................................................... 12
2.1.3.- Cultivo y producción de Scenedesmus almeriensis .............................. 22
2.2.- CAROTENOIDES-ANTIOXIDANTES ................................................................. 26
2.2.1.- Generalidades ...................................................................................... 26
2.2.2.- Importancia nutricional ......................................................................... 28
2.2.3.- Estabilidad en los alimentos ................................................................. 33
2.2.4.- Degeneración macular asociada a la edad ........................................... 34
2.2.5.- La luteína como agente antioxidante y preventivo ................................ 35
2.2.6.- Fuentes para la obtención de luteína y otros antioxidantes .................. 39
2.3.- EL ACEITE DE OLIVA VIRGEN ......................................................................... 42
2.3.1.- Antioxidantes presentes en el aceite de oliva virgen ............................. 44
2.3.1.1.- Compuestos Fenólicos ........................................................... 45
2.3.1.2.- Tocoferoles ............................................................................ 46
2.3.1.3.- Pigmentos .............................................................................. 47
2.3.2.- Importancia de la dieta mediterránea.................................................... 49
2.3.3.- Parámetros de calidad de los aceites de oliva ...................................... 50
2.3.4.- El color del aceite de oliva .................................................................... 53
2.4.- FUNDAMENTOS DE CIENCIA DEL COLOR ..................................................... 55
2.4.1.- Especificación del color ........................................................................ 55
2.4.2.- Espacios de color ................................................................................. 61
2.4.3.- Medida de la diferencia de color ........................................................... 67
2.4.4.- Emociones y preferencias suscitadas por el color ................................ 70
2.5.- FACTORES QUE INFLUYEN EN EL COLOR Y AFECTAN A LA PRESENCIA
DE ANTIOXIDANTES EN EL ACEITE DE OLIVA ....................................................... 74
2.5.1.- Factores agronómicos .......................................................................... 75
2.5.1.1.- Factores agronómicos intrínsecos .......................................... 76
2.5.1.2.- Factores agronómicos extrínsecos ......................................... 78
3.- OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS ACEITES DE OLIVA VÍRGENES
EXTRA ENRIQUECIDOS CON ANTIOXIDANTES..................................................... 84
3.1.- INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 84
3.2.- MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................... 84
3.2.1.-Microalga Scenedesmus almeriensis .................................................... 84
3.2.2.-Aceites de oliva vírgenes extra .............................................................. 85
3.2.3.-Extracción y purificación del extracto de antioxidantes .......................... 87
3.2.4.-Obtención de aceites enriquecidos con antioxidantes ........................... 89
3.2.5.-Caracterización del color de los AOVE´s ............................................... 92
3.3.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................... 92
3.3.1.- Extracción y purificación de antioxidantes ............................................ 92
3.3.2.- Obtención y caracterización colorimétrica de AOVE´s enriquecidos con
antioxidantes ................................................................................................... 94
3.4.- CONCLUSIONES ............................................................................................. 103
4.- MEJORA DE LA ESTABILIDAD Y DE LA FRACCIÓN DE CAROTENOIDES EN
ACEITES DE OLIVA VÍRGENES EXTRA MEDIANTE LA ADICIÓN DE EXTRACTOS
PROCEDENTES DE LA MICROALGA SCENDESMUS ALMERIENSIS ................. 104
4.1.- INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 104
4.2.- MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................. 106
4.2.1.- Producción de la microalga Scenedesmus almeriensis ..................... 106
4.2.2.- Métodos de extracción ....................................................................... 106
4.2.3.- Preparación de las muestras de aceite de oliva ................................. 107
4.2.4.- Parámetros físicos y de calidad evaluados ......................................... 107
4.2.4.1.- Determinación de color ........................................................ 107
4.2.4.2.- Determinación de parámetros de calidad ............................. 108
4.2.5.- Determinación de los valores de p-anisidina....................................... 108
4.2.6.- Estabilidad oxidativa ........................................................................... 108
4.2.7.- Composición en ácidos grasos ........................................................... 108
4.2.8.- Composición en tocoferoles ............................................................... 109
4.2.9.- Composición de los pigmentos ........................................................... 110
4.2.10.- Análisis estadístico ........................................................................... 110
4.2.10.1.- Análisis de la varianza ........................................................ 110
4.2.10.2.- Análisis de los componentes principales (PCA) .................. 111
4.2.10.3.- Análisis discriminante lineal (LDA) ..................................... 111
4.3.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................... 112
4.3.1.- Parámetros de color ........................................................................... 112
4.3.2.- Parámetros de calidad ........................................................................ 113
4.3.3.- Perfil de ácidos grasos ....................................................................... 114
4.3.4.- Composición en tocoferoles ............................................................... 115
4.3.5.- Composición de pigmentos ................................................................ 115
4.3.6.- Estabilidad oxidativa ........................................................................... 116
4.3.7.- Discriminación de los aceites de oliva por la adición de extracto de
Scenedesmus almeriensis ............................................................................ 117
4.3.8.- Incorporación de S. almeriensis y consumo de aceite de oliva ........... 118
4.4.- CONCLUSIONES ............................................................................................. 120
5.- ESTUDIOS DE ESTABILIDAD DE ACEITES DE OLIVA VÍRGENES EXTRA
ENRIQUECIDOS CON ANTIOXIDANTES ............................................................... 127
5.1.- INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 127
5.2.- MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................. 128
5.3.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................... 131
5.3.1.- Estabilidad en función de la radiación incidente: foto-estabilidad ........ 131
5.3.2.- Estabilidad en función de la temperatura: termo-estabilidad ............... 136
5.3.3.- Estabilidad en función del tiempo: consumo preferente ...................... 139
5.3.4.- Estudios específicos de estabilidad .................................................... 140
5.3.4.1.- Foto-estabilidad en función del índice de maduración del fruto
........................................................................................................... 141
5.3.4.2.- Foto-estabilidad en función de la variedad del fruto ............. 143
5.3.4.3.- Termo-estabilidad en función del índice de maduración del fruto
........................................................................................................... 145
5.3.4.4.- Termo-estabilidad en función de la variedad del fruto .......... 147
5.4.- CONCLUSIONES ............................................................................................. 149
6.- EMOCIONES Y PREFERENCIAS DE COLOR EN ACEITES DE OLIVA
VÍRGENES EXTRA ENRIQUECIDOS CON ANTIOXIDANTES. ESTUDIOS DE
APRECIACIÓN VISUAL DE POBLACIONES ACOSTUMBRADAS O NO AL
CONSUMO DE ACEITE DE OLIVA ......................................................................... 150
6.1.- INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 150
6.2.- MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................. 151
6.3.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................... 154
6.3.1.- Muestras usadas en el experimento de emociones de color ............... 154
6.3.2.- Variabilidad inter-observador e intra-observador ................................ 163
6.3.2.1.- Escalas emocionales ........................................................... 164
6.3.2.2.- Correlación entre diferentes emociones ............................... 166
6.3.2.3.- Dependencia entre valores z y cantidad de antioxidantes .... 168
6.4.- CONCLUSIONES ............................................................................................. 180
7.- CONCLUSIONES GENERALES ......................................................................... 181
8.- BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................... 184
9.- ANEXOS ............................................................................................................. 212
Anexo I ..................................................................................................................... 212
9.1.- ESTUDIOS DE ESTABILIDAD DE TODOS LOS ACEITES ENSAYADOS ....... 212
9.1.1.- Estabilidad en función de la radiación electromagnética: foto-estabilidad .
...................................................................................................................... 212
9.1.2.- Estabilidad en función de la temperatura: termo-estabilidad ............... 224
9.1.3.- Estabilidad en función del tiempo: consumo preferente ...................... 238
9.2.- ESTUDIOS ESPECÍFICOS DE ESTABILIDAD DE TODOS LOS ACEITES
ENSAYADOS ........................................................................................................... 245
9.2.1.- Foto-estabilidad en función del índice de maduración del fruto.......... 245
9.2.2.- Foto-estabilidad en función de la variedad del fruto ............................ 249
9.2.3.- Termo-estabilidad en función del índice de maduración del fruto ....... 255
9.2.4.- Termo-estabilidad en función de la variedad del fruto ......................... 259
Anexo II .................................................................................................................... 264
9.3.- EXPERIMENTO DE EMOCIONES SUSCITADAS POR EL COLOR ................ 264
9.3.1.- Resultados con población acostumbrada al consumo de aceite de oliva ..
...................................................................................................................... 266
9.3.2.- Resultados con población no acostumbrada al consumo de aceite de
oliva ......................................................................................................................... 286
10.- SUMMARY ........................................................................................................ 294
11.- PUBLICACIONES Y COMUNICACIONES ........................................................ 336
Índice de Ecuaciones
ÍNDICE DE ECUACIONES
Página
Ecuación 2.1 Expresión para calcular los valores triestímulo X ................................................ 63
Ecuación 2.2 Expresión para calcular los valores triestímulo Y ................................................ 63
Ecuación 2.3 Expresión para calcular los valores triestímulo Z ................................................ 63
Ecuación 2.4 Expresión para calcular coordenadas de motricidad en x ................................... 63
Ecuación 2.5 Expresión para calcular coordenadas de motricidad en y ................................... 63
Ecuación 2.6 Expresión para calcular el valor del croma ∗ .................................................... 66
Ecuación 2.7 Expresión para calcular el valor del ángulo del tono ..................................... 66
Ecuación 2.8 Expresión para calcular la diferencia de color en CIELAB .................................. 68
Ecuación 2.9 Otra expresión para calcular la diferencia de color en CIELAB ........................... 68
Ecuación 2.10 Expresión para calcular la diferencia de tono H*ab .......................................... 68
Ecuación 2.11 Expresión correspondiente a la emoción “fuerte-débil” ..................................... 72
Ecuación 3.1 Cálculo de los µl de extracto que hay que añadir a los AOVE´s para conseguir una
concentración de 0,05 mg luteína/ml aceite en los estudios de foto-estabilidad ........................ 91
Ecuación 3.2 Cálculo de los µl de extracto que hay que añadir a los AOVE´s para conseguir una
concentración de 0,1 mg luteína/ml aceite en los estudios de foto-estabilidad .......................... 91
Ecuación 4.1 Expresión para calcular la diferencia de color en CIELAB ................................ 107
Ecuación 4.2 Expresión para calcular el índice de amarilleamiento YI ................................... 107
Ecuación 5.1 Cálculo de los µl de extracto que hay que añadir a los AOVE´s para conseguir una
concentración de 0,05 mg luteína/ml aceite en los estudios de termo-estabilidad ................... 130
Ecuación 5.2 Cálculo de los µl de extracto que hay que añadir a los AOVE´s para conseguir una
concentración de 0,1 mg luteína/ml aceite en los estudios de termo-estabilidad ..................... 130
Índice de Figuras
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 2.1 Estructura del retinol ................................................................................................. 29
Figura 2.2 Estructura del β-caroteno .......................................................................................... 30
Figura 2.3 Estructura química de la luteína ................................................................................ 36
Figura 2.4 Espectro electromagnético ........................................................................................ 56
Figura 2.5 Rueda del color ......................................................................................................... 58
Figura 2.6 Diferentes representaciones de los atributos del color en el sólido de color. ........... 60
Figura 2.7 Representación de las 40 cartas o tonos (Hue) del atlas Munsell ............................ 60
Figura 2.8 Diagrama de cromaticidad CIE x, y basado en el espacio de color XYZ ................. 64
Figura 2.9 Espacio de color CIELAB y Plano CIELAB ............................................................... 65
Figura 2.10 Vista del espacio de color L*a*b* ............................................................................ 66
Figura 2.11 Parámetros del espacio de color L* C* h ............................................................... 67
Figura 2.12 Diferencias de color en el espacio L*a*b* ............................................................... 69
Figura 2.13 Términos para describir diferencias de color en claridad y croma CIELAB............ 69
Figura 3.1 Coordenadas CIELAB de los 15 AOVE’s ................................................................. 86
Figura 3.2 Cromatogramas del AOVE “C”. ................................................................................. 90
Figura 3.3 Representación del % de luteína recuperada frente al nº de extracciones .............. 93
Figura 3.4 Cambios de color en el plano a*b* para los 4 aceites considerando diferentes adiciones
de extracto ................................................................................................................................... 96
Figura 3.5 Evolución del color de los 4 aceites con diferentes adiciones de extracto, en el plano
CIELAB con coordenadas ángulo de tono y claridad.................................................................. 97
Índice de Figuras
Figura 3.6 Evolución del color de los 4 aceites con diferentes adiciones de extracto, en el plano
CIELAB con coordenadas ángulo de tono y croma .................................................................... 98
Figura 3.7 Diferencias de color CIELAB en 4 AOVE´s en función del enriquecimiento con extracto
de antioxidantes de los mismos ................................................................................................ 100
Figura 4.1 Diferencias de color (ΔE*ab) y el índice de amarilleamiento (YI) de los AOVE´s .... 121
Figura 4.2 Contenido en β-caroteno, luteína y estabilidad oxidativa de los AOVE´s............... 122
Figura 4.3 Análisis del PCA y LDA de los AOVE´s .................................................................. 123
Figura 5.1 Distribución espectral de potencia de la fuente de luz ultravioleta de la cabina Verivide
CAC 60 ...................................................................................................................................... 129
Figura 5.2 Diferencias de color CIELAB producidas en AOVE´s sin enriquecer, como
consecuencia de exposición continua a luz ultravioleta ........................................................... 132
Figura 5.3 Diferencias de color CIELAB producidas en AOVE´s enriquecidos con extracto de
antioxidantes de concentración 0,05 mg luteína/ml .................................................................. 133
Figura 5.4 Diferencias de color CIELAB producidas en AOVE´s enriquecidos con extracto de
antioxidantes de concentración 0,1 mg luteína/ml .................................................................... 133
Figura 5.5 Foto-estabilidad del AOVE “B” (Santuario de Mágina) bajo condiciones de iluminación
controlada con lámpara ultravioleta .......................................................................................... 134
Figura 5.6 Foto-estabilidad del AOVE “C” (Oro Bailén) bajo condiciones de iluminación controlada
con lámpara ultravioleta ............................................................................................................ 135
Figura 5.7 Diferencias de color CIELAB de los AOVE´s sin enriquecer en función del tiempo de
calentamiento a 120 ºC ............................................................................................................. 136
Figura 5.8 Diferencias de color CIELAB de los 5 AOVE´s enriquecidos con extracto de
antioxidantes (0,05mg luteína/ml), en función del tiempo de calentamiento a 120 ºC ............. 137
Figura 5.9 Diferencias de color CIELAB de los 5 AOVE´s enriquecidos con extracto de
antioxidantes (0,1mg luteína/ml), en función del tiempo de calentamiento a 120 ºC ............... 137
Figura 5.10 Diferencias de color CIELAB en el AOVE “L” ....................................................... 138
Índice de Figuras
Figura 5.11 Estabilidad temporal de 5 AOVE´s bajo condiciones de almacenamiento seco, en
oscuridad y a temperatura ambiente (20 ºC) (Datos sin enriquecer) ........................................ 139
Figura 5.12 Estabilidad temporal de 5 AOVE´s bajo condiciones de almacenamiento seco, en
oscuridad a temperatura ambiente (20 ºC) (0,05 mg luteína/ml) .............................................. 140
Figura 5.13 Foto-estabilidad de los AOVE´s “CCP”, procedentes de frutos con 3 grados distintos
de maduración (Datos sin enriquecer) ...................................................................................... 141
Figura 5.14 Foto-estabilidad de los AOVE´s “CCP”, procedentes de frutos con 3 grados distintos
de maduración (0,05 mg luteína/ml) ......................................................................................... 142
Figura 5.15 Foto-estabilidad de los AOVE´s procedentes de frutos de 4 variedades diferentes
(Datos sin enriquecer) ............................................................................................................... 143
Figura 5.16 Foto-estabilidad de los AOVE´s procedentes de frutos de 4 variedades diferentes
(0,05 mg luteína/ml) .................................................................................................................. 144
Figura 5.17 Termo-estabilidad de los AOVE´s “CCP”, procedentes de frutos con 3 grados distintos
de maduración (Datos sin enriquecer) ..................................................................................... 145
Figura 5.18 Termo-estabilidad de los AOVE´s “CCP”, procedentes de frutos con 3 grados distintos
de maduración (0,05 mg luteína/ml) ......................................................................................... 146
Figura 5.19 Termo-estabilidad de los AOVE´s procedentes de frutos de 4 variedades diferentes
(Datos sin enriquecer) ............................................................................................................... 147
Figura 5.20 Termo-estabilidad de los AOVE´s procedentes de frutos de 4 variedades diferentes
(0,05 mg luteína/ml) .................................................................................................................. 148
Figura 6.1 Evolución del color con las dos adiciones de extracto de antioxidantes para cada una
de las 6 muestras de aceite ...................................................................................................... 157
Figura 6.2a Cambios de claridad descritos mediante la coordenada CIELAB L* .................... 158
Figura 6.2b Cambios de croma descritos mediante la coordenada CIELAB C*ab. .................. 158
Figura 6.2c Cambios de tono descritos mediante la coordenada CIELAB hab ....................... 159
Índice de Figuras
Figura 6.3a Diferencias de color para cada uno de los 6 aceites en los procesos A-B y A-C, en
unidades CIELAB (E*ab) .......................................................................................................... 161
Figura 6.3b % promedios de cambio en claridad (%L*), croma (%C*ab) y tono (%H*ab) CIELAB
de los AOVE´s con una primera adición de extracto (proceso A-B) ......................................... 162
Figura 6.3c % promedios de cambio en claridad (%L*), croma (%C*ab) y tono (%H*ab) CIELAB
de los AOVE´s con una segunda adición de extracto (proceso A-C) ....................................... 162
Figura 6.4 Representación de los valores de frontera calculados para las 9 escalas emocionales y
los 2 grupos de observadores (acostumbrados y no acostumbrados) ..................................... 166
Figura 6.5 Resultados promedio (valores z) para la emoción “Inodoro/Aromático” en los sujetos
acostumbrados y no acostumbrados ........................................................................................ 169
Figura 6.6 Resultados promedio (valores z) para la emoción “Dulce/Amargo” en los sujetos
acostumbrados y no acostumbrados ........................................................................................ 170
Figura 6.7 Resultados promedio (valores z) para la emoción “Rancio/Fresco” en los sujetos
acostumbrados y no acostumbrados ........................................................................................ 172
Figura 6.8 Resultados promedio (valores z) para la emoción “No saludable/Saludable” en los
sujetos acostumbrados y no acostumbrados ............................................................................ 173
Figura 6.9 Resultados promedio (valores z) para la emoción “No gusta/Gusta” en los sujetos
acostumbrados y no acostumbrados ........................................................................................ 175
Figura 6.10 Resultados promedio (valores z) para la emoción “Artificial/Natural” en los sujetos
acostumbrados y no acostumbrados ........................................................................................ 176
Figura 6.11 Resultados promedio (valores z) para la emoción “No picante/Picante” en los sujetos
acostumbrados y no acostumbrados ........................................................................................ 177
Figura 6.12 Resultados promedio (valores z) para la emoción “Suave/Áspero” en los sujetos
acostumbrados y no acostumbrados ........................................................................................ 178
Figura 6.13 Resultados promedio (valores z) para la emoción “Insípido/Sabroso” en los sujetos
acostumbrados y no acostumbrados ........................................................................................ 179
Índice de Imágenes
ÍNDICE DE IMÁGENES
Página
Imagen 2.1 Imágenes de las microalgas Spirulina y Chlorella ..................................................... 6
Imagen 2.2 Diferentes fotobiorreactores utilizados para el cultivo de microalgas ..................... 11
Imagen 2.3 Matraces de mantenimiento y precultivo de la microalga ....................................... 23
Imagen 2.4 Fotobiorreactores tubulares empleados para la producción de biomasa de la microalga
Scenedesmus almeriensis. ......................................................................................................... 24
Imagen 2.5 Imagen de la biomasa liofilizada de Scenedesmus almeriensis ............................. 25
Imagen 2.6 Cambios que provoca la degeneración macular senil (DMAE) en la retina y sus
correspondientes consecuencias en la visión humana ............................................................... 37
Imagen 2.7 Algunos productos comerciales basados en luteína. .............................................. 38
Imagen 2.8 Flor de Marigold o caléndula (Tagetes erecta) ........................................................ 40
Imagen 3.1 Imágenes de S. almeriensis tomadas mediante microscopio óptico y electrónico. 85
Imagen 3.2 Algunos de los AOVE´s empleados en las experiencias de enriquecimiento en
antioxidantes: G, B, H y E ........................................................................................................... 87
Imagen 3.3 Esquema global para la obtención del extracto de antioxidantes ........................... 88
Imagen 3.4 Extracto de antioxidantes (2,3 mg/ml de luteína) en AOVE tras la eliminación de
disolvente en rotavapor ............................................................................................................... 88
Imagen 5.1 Muestras de aceites irradiadas en la cabina de control de iluminación CAC 60 Verivide
y detalle de la fuente de luz ultravioleta de dicha cabina .......................................................... 129
Imagen 5.2 Muestras de AOVE´s sometidas a 120 ºC en un baño termostático y detalle del
termostato .................................................................................................................................. 130
Imagen 6.1 Detalle de una de las botellas utilizadas para el experimento de emociones suscitadas
por el color de los AOVE´s ........................................................................................................ 153
Índice de Tablas
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla 2.1 Superficie de terreno necesaria para producir 1 kg de proteína .................................. 8
Tabla 2.2 Agua necesaria para producir 1 kg de proteína ........................................................... 9
Tabla 2.3 Comparación de la composición de alimentos y microalgas ...................................... 14
Tabla 2.4 Aminoácidos esenciales del huevo entero, caseína y algunas especies de microalgas.
(Valores en g por 100 g de proteína) .......................................................................................... 15
Tabla 2.5 Composición del medio Mann & Myers (1968) ........................................................... 23
Tabla 2.6 Distribución de carotenoides mayoritarios presentes en diversos alimentos ............. 27
Tabla 2.7 Contenido en luteína de algunas microalgas a nivel de laboratorio y escala semi-
industrial ...................................................................................................................................... 41
Tabla 2.8 Composición de la microalga Scenedesmus almeriensis .......................................... 42
Tabla 2.9 Composición del aceite de oliva virgen ...................................................................... 44
Tabla 3.1 AOVE´s utilizados en las experiencias de enriquecimiento con extracto de antioxidantes
procedente de la microalga S. almeriensis ................................................................................. 86
Tabla 3.2 Parámetros colorimétricos en la adición de extracto de antioxidantes sobre el AOVE
“Santuario de Mágina” ................................................................................................................. 95
Tabla 3.3 Parámetros colorimétricos en la adición de extracto de antioxidantes sobre el AOVE
“Hojiblanca”. ................................................................................................................................ 99
Tabla 3.4 Parámetros colorimétricos en la adición de extracto de antioxidantes sobre el AOVE
“Carbonell” ................................................................................................................................... 99
Tabla 3.5 Parámetros colorimétricos en la adición de extracto de antioxidantes sobre el AOVE
“Melgarejo” ................................................................................................................................ 100
Índice de Tablas
Tabla 3.6 Parámetros colorimétricos de los AOVE´s originales y enriquecidos con luteína (0,1
mg/ml) ........................................................................................................................................ 102
Tabla 4.1 Parámetros de calidad, valor de p-anisidina, índice de TOTOX, y parámetros de color (a*
b* y L*) de los AOVE´s sin (I) y con extracto de S. almeriensis ................................................ 124
Tabla 4.2 Composición detallada de ácidos grasos expresada en (g/100 g de ácidos grasos) de los
AOVE´s sin (I) y con extracto de S. almeriensis ....................................................................... 125
Tabla 4.3 Composición de tocoferoles expresada en (mg/kg de aceite de oliva) de AOVE´s sin (I) y
con extracto de S. almeriensis .................................................................................................. 126
Tabla 6.1 Coordenadas de color CIELAB (fuente D65, observador patrón CIE 1964)
correspondientes a los seis AOVE´s originales (A) y sus dos adiciones de extracto de
antioxidantes para obtener concentraciones de 0,05 mg/ml (B) y 0,1 mg/ml (C) ..................... 155
Tabla 6.2 Desviaciones típicas de las coordenadas CIELAB correspondientes a las tres medidas
espectrorradiométricas de color realizadas para cada muestra, cuyos resultados promedio
aparecen en la Tabla 6.1 ........................................................................................................... 156
Tabla 6.3 Cambios de color entre aceites puros (A), y con adiciones de extracto para lograr
concentraciones de luteína de 0,05 mg/ml (B) y 0,1 mg/ml (C), en unidades CIEDE2000 (E00) y
CIELAB (E*ab) .......................................................................................................................... 160
Tabla 6.4 Resultados de variabilidad inter-observador e intra-observador para las 9 emociones
consideradas y los dos grupos de observadores participantes en nuestro experimento ........ 164
Tabla 6.5 Valores (Bi) para cada emoción en sujetos con tradición en el uso de AOVE´s y sin
ella ............................................................................................................................................. 165
Tabla 6.6 Coeficientes de correlación de Pearson (r) obtenidos mediante los valores z para cada
emoción y grupo de sujetos ...................................................................................................... 167
Abreviaturas
ABREVIATURAS
AIC: Asociación Internacional del Color
AMD: Age Macular Degeneration
ANOVA: Analysis of Variance
AOVE: Aceite de oliva virgen extra
CCA: Aceite de oliva virgen extra “Castillo de Canena” de la variedad Arbequina
CCF: Aceite de oliva virgen extra “Castillo de Canena” de la variedad Frantoio
CCP: Aceite de oliva virgen extra “Castillo de Canena” de la variedad Picual
CCR: Aceite de oliva virgen extra “Castillo de Canena” de la variedad Royal
CDC: Center for Disease Control and Prevention
CE: Color Emotion
CEE: Comunidad Económica Europea
CIE: Commission Internationale de l'Éclairage
CIELAB: Espacio de color L*a*b*
COI: Comité Oleícola Internacional
CSIC: Consejo Superior de Investigaciones Científicas
DMAE: Degeneración Macular Asociada a la Edad
DOP: Denominación de Origen Protegida
EFA: Essential Fatty Acids
e.g: exempli gratia (for example, for instance), por ejemplo
EUFIC: European Food Information Council
EVOO: Extra Virgin Olive Oil
FA: Free Acidity
Abreviaturas
FAO: Food and Agriculture Organization
FR: Aceite de oliva virgen extra: Fuenroble
HDL: High Density Lipoproteins
HPLC: High Performance Liquid Chromatography
IM: Índice de Madurez
LDA: Linear Discriminant Analysis
LDL: Low Density Lipoproteins
MUFA: Monounsaturated fatty acids
OB: Aceite de oliva virgen extra: Oro Bailén
OECD: Organisation for Economic Co-operation and Development
OG: Aceite de oliva virgen extra: Oro de Génave
p-AV: Para-anisidina
PC: Principal Component
PCA: Principal Component Analysis
PUFA: Polyunsaturated Fatty Acids
PV: Peroxide Value
RMSE: Root-mean-square error (error cuadrático medio)
SCOTDIC: Textile Color System
SFA: Saturated Fatty Acids
T: Tonelada métrica
UV: Ultravioleta
VIH: Virus Inmunodeficiencia Humana
YI: Yellowness index
1. INTRODUCCIÓN. JUSTIFICACIÓN
1.- Introducción. Justificación
1.-INTRODUCCIÓN. JUSTIFICACIÓN
Actualmente existe un interés creciente en el desarrollo de alimentos funcionales,
que son aquellos capaces de proporcionar efectos beneficiosos para la salud,
adicionalmente a su valor nutritivo o energético. Estos productos, son usualmente
alimentos tradicionales enriquecidos en uno o varios componentes, que ejercen o
promueven un efecto beneficioso para la salud humana.
El interés por los carotenoides ha crecido recientemente en base a estudios que
sugieren el efecto protector que resulta de una ingesta adecuada de estos compuestos
en la prevención y evolución de enfermedades degenerativas humanas, entre las que
destacan las de tipo oftalmológico y dermatológico. En la actualidad no existen fármacos
que puedan corregir estas enfermedades, por lo que la única estrategia viable es la
prevención de las mismas. Sin embargo, la dosis de carotenoides recomendada para
grupos de riesgo, difícilmente puede ser cubierta por modificaciones en la dieta. Por este
motivo una de las vías de prevención con mejores perspectivas, es la ingesta de
alimentos enriquecidos en antioxidantes.
Por otro lado, es bien conocido que el aceite de oliva posee, debido a su
composición química, importantes propiedades que lo hacen un alimento muy saludable y
recomendado, presentando además un alto factor de digestibilidad, parámetro muy
importante en alimentación. Son muchos los trabajos científicos que avalan la importancia
de su incorporación en una dieta equilibrada, mostrando efectos muy beneficiosos para la
salud, entre los que se pueden citar: reducción del nivel del colesterol; disminución del
riesgo de infarto y de trombosis arteriales; eficacia en la lucha contra úlceras, gastritis y
acidez en general; regulación del tránsito intestinal y estimulación del crecimiento óseo y
prevención de muchas enfermedades degenerativas humanas.
El aceite de oliva virgen extra es un alimento muy equilibrado que está constituido
por una gran variedad de moléculas: compuestos hidrocarbonados, esteroles,
compuestos diterpénicos y triterpénicos, alcoholes alifáticos, tocoferoles, pigmentos,
clorofilas y carotenoides.
Dentro de la familia de los carotenoides, la luteína y el β-caroteno, se encuentran
en cantidades muy pequeñas en el aceite de oliva en su composición original, estando
por debajo de los valores recomendados para la prevención de enfermedades
Tesis Doctoral
1
1.- Introducción. Justificación
degenerativas humanas (por ejemplo, la Degeneración Macular Senil, DMAE). Sin
embargo, es importante resaltar que por sus características y por contener pequeñas
cantidades de estos carotenoides, el aceite de oliva podría constituir un medio adecuado
de transporte de éstos, pues aumentar la concentración de componentes previamente
existentes, no debe generar problemas de estabilidad severos, hecho que sí podría
ocurrir al tratar de añadir compuestos químicos totalmente ajenos al medio receptor.
En el estado actual de las investigaciones sobre el papel de antioxidantes como la
luteína en la prevención de la DMAE, una de las principales preocupaciones es
determinar en qué medida es digerida y adsorbida la luteína suministrada por las
diferentes fuentes dietarias (estudios de digestibilidad-bioaccesibilidad). Esta
preocupación se extiende a los extractos comerciales que actualmente se usan en los
complementos nutricionales que contienen luteína. En este sentido, sólo productos de
digestibilidad conocida y adecuada son útiles como aporte de luteína en la dieta humana.
Más aún, únicamente productos de digestibilidad conocida serán útiles en futuros
estudios del papel de la luteína en la prevención de enfermedades como las oculares.
Así, existen trabajos que describen estudios realizados in vitro, en los que se pone de
manifiesto que las matrices alimenticias ricas en grasas, como son el aceite de oliva y
otras similares, pueden facilitar y/o beneficiar el proceso de bioasimilación de este tipo de
carotenoides (Rangaswamy et al., 2007; Granado et al., 2009, 2010; Nidhi y Baskaran,
2011). También hay estudios de degradación térmica de carotenoides en aceites de oliva
y similares, que pueden afectar a las propiedades físico-químicas y de coloración de los
aceites y por tanto a su apariencia y aceptabilidad por el consumidor (Aparicio et al.,
2011). En una patente previa, se ha propuesto la incorporación al aceite de oliva de
diferentes carotenoides mediante el uso de la flor de Marigold (European Patent, 2006).
En este contexto, la presente Memoria de Tesis Doctoral tiene por objetivo
principal la obtención de nuevos alimentos funcionales basados en aceites de oliva
vírgenes extra, enriquecidos con antioxidantes procedentes de microalgas marinas, para
la prevención de enfermedades degenerativas asociadas al déficit de antioxidantes.
Así, se ha puesto a punto la metodología necesaria para la obtención de extractos
de carotenoides procedentes de la microalga marina Scenedesmus almeriensis (especie
rica en luteína y β-caroteno), que han sido utilizados para enriquecer con carotenoides
diferentes tipos de AOVE´s. Estos aceites constituyen un potencial medio para la
incorporación de carotenoides en las dosis adecuadas al organismo humano, a través de
un alimento tan importante y característico de la dieta mediterránea.
Tesis Doctoral
2
1.- Introducción. Justificación
Por tanto, se persigue dotar a los aceites de un valor añadido superior al que ya
de por sí tienen y se ha comprobado que el enriquecimiento con antioxidantes, mejora las
características de estabilidad de los aceites frente a variables típicas de degradación en
los alimentos, como son la exposición a la luz, la temperatura y el paso del tiempo.
Los aceites de oliva vírgenes extra enriquecidos con carotenoides, se han
caracterizado físico-químicamente, para conocer todos sus parámetros y así poder
evaluar el efecto de la mejora de la fracción antioxidante en los mismos. Inicialmente se
ha evaluado la concentración de carotenoides más idónea a alcanzar en los aceites
ensayados realizando diferentes experimentos en los que se ha ido aumentando
progresivamente la cantidad de extracto de antioxidantes adicionado.
Posteriormente, los aceites enriquecidos en los nuevos antioxidantes han sido
sometidos a diferentes caracterizaciones de tipo físico-químico para compararlos con los
mismos aceites sin enriquecer, los cuales han sido usados como control. Así, se ha
realizado un completo análisis de parámetros químicos: referentes a la calidad de los
aceites (acidez libre, compuestos de oxidación primaria y secundaria, índice de
peróxidos, K232, K270, p-anisidina,..), referentes a la propia composición (perfil de ácidos
grasos, tocoferoles, pigmentos,….) y parámetros referentes a la bioactividad (compuestos
fenólicos totales, DPPH y ABTS). En lo que se refiere a estudios de tipo físico, se han
realizado monitorizaciones midiendo el color de aceites, que han permitido obtener
información sobre la estabilidad de las muestras frente a las principales variables de
degradación comentadas: el tiempo, la temperatura y la exposición a la luz.
Adicionalmente, se ha estudiado la estabilidad de los aceites enriquecidos en función del
índice de maduración del fruto y de la variedad del mismo.
Otra parte de esta Memoria se ha dedicado a los estudios de emociones
suscitadas por el color de las muestras y los cambios de color que sufren los aceites
cuando son enriquecidos con antioxidantes. Así, se pretende conocer si estos cambios de
color son aceptados y en qué medida, por los potenciales consumidores, aspecto muy
importante si se quiere abordar el desarrollo industrial de la idea de negocio
fundamentada en la obtención y comercialización de estos nuevos alimentos funcionales
basados en aceites de oliva.
Estos resultados, apoyan la idea de poder utilizar el aceite de oliva virgen extra
como medio de incorporación en el organismo de las cantidades necesarias de
Tesis Doctoral
3
1.- Introducción. Justificación
carotenoides, dotando al aceite de oliva de un valor añadido superior al que ya tiene de
por sí y ofrecer una alternativa diferente a las actuales, en la lucha contra determinadas
enfermedades degenerativas humanas.
Finalmente, es importante resaltar la aplicabilidad de los resultados obtenidos, la
cual produciría una línea de aceites de oliva enriquecidos con nuevos antioxidantes que
vendría a sumar, tanto en estrategias de lucha contra enfermedades degenerativas
humanas, así como en el desarrollo del tejido industrial y social de nuestro entorno.
Tesis Doctoral
4
2. ANTECEDENTES
2.- Antecedentes
En este capítulo se va a realizar un resumen del estado del arte en los principales
temas que se han trabajado durante la elaboración de esta Tesis Doctoral. Así, en cada
apartado se realizará una breve introducción y se notarán las investigaciones
precedentes que se han tenido en cuenta a la hora de dirigir el curso de la investigación
realizada.
2.1.- LAS MICROALGAS COMO FUENTE DE PRODUCTOS DE ALTO VALOR
Las microalgas son microorganismos unicelulares fotoautótrofos, capaces de
obtener energía de la radiación luminosa y de sintetizar sus biomoléculas a partir de
dióxido de carbono y agua. Han colonizado casi todos los hábitats conocidos, aunque la
mayor parte se han adaptado mejor al ambiente acuático, tanto marino como
dulceacuícola. Así, los mares y los océanos contienen grandes cantidades de microalgas,
estimándose que el 40% de la fotosíntesis total del planeta es realizada por estos
microorganismos acuáticos, siendo claves en la dinámica del dióxido de carbono en la
tierra y constituyendo la base de las cadenas tróficas (Muller y Tobin, 1986). En la
actualidad representan un recurso poco explorado, ya que, de las más de 30.000
especies descritas, solo unas 50 han sido estudiadas con detalle desde el punto de vista
fisiológico y bioquímico, y menos de 10 están siendo explotadas comercialmente.
Los primeros estudios científicos sobre el cultivo de microalgas datan de 1890,
cuando el microbiólogo holandés Beijerinck establece cultivos puros de la microalga de
agua dulce Chlorella vulgaris. El primer trabajo sistemático sobre estos microorganismos,
en el que se trasladaban métodos y datos de laboratorio a especificaciones ingenieriles,
se realizó en la Universidad de Standford (California, 1948-1950) utilizando Chlorella
como especie de cultivo. En esta misma época ya surgen en Alemania las primeras
plantas de producción comercial de microalgas, en las que se producían diatomeas bajo
condiciones controladas (Harder y Von Witsch, 1942). Sin embargo, la producción
comercial a gran escala comenzó a principios de los sesenta cuando se comercializó
Chlorella como alimento dietético en Japón y Taiwán (Tsukada et al., 1997).
Paralelamente al establecimiento de los primeros procesos industriales de
producción de Chlorella, otras microalgas eran también cultivadas a gran escala en
diversas partes del mundo, como es el caso de Spirulina en el lago Texcoco (México),
cuya producción era llevada a cabo por Sos Texcoco S.A. (Durand-Chastel, 1980). Desde
entonces han surgido numerosas empresas de producción de microalgas llegando
Tesis Doctoral
5
2.- Antecedentes
actualmente a una producción de más de 10.000 T, principalmente de Spirulina y
Chlorella (Imagen 2.1), pero también de otras especies como Dunaliella, Haematococcus
y Nannochloropsis, entre otras (Spolaore, 2006).
Las microalgas pueden cultivarse en reactores a gran escala bajo condiciones
controladas, y su elevada velocidad de crecimiento permite obtener grandes
productividades (Pulz y Scheibenbogen, 1998). El carbono fijado por las microalgas es
incorporado a proteínas, carbohidratos y lípidos, de forma que a partir de la biomasa
microalgal se puede obtener una gran diversidad de productos químicos (Kishimoto et al.,
1994; Yanagi et al., 1995). Debido a estas razones, los procesos basados en el uso de
microalgas están recibiendo un interés creciente y hoy en día se siguen investigando.
Uno de los aspectos más interesantes en el campo de la biotecnología de microalgas es
la explotación de la capacidad de las microalgas para generar biomasa constituida por
biomoléculas complejas como vitaminas, enzimas y sustancias bioactivas de elevado
valor comercial (Arad y Yaron, 1992; Apt y Behrens, 1999; Shimizu, 2000; Shi et al.,
2002). Además, muchas de las moléculas que generan son específicas y no pueden ser
sintetizadas por otros organismos o plantas superiores (Richmond, 1990; Bajpai y Bajpai,
1993; De la Noue y De Pauw, 1998).
Spirulina Chlorella
Imagen 2.1
Imágenes de las microalgas Spirulina y Chlorella.
Derivado de esta composición tan rica de las microalgas, sus principales
aplicaciones se centran en la alimentación humana, nutrición animal, y la obtención de
compuestos de interés como carotenoides, ácidos grasos, etc. El consumo de microalgas
como alimento humano se ha practicado desde antiguo, y se encuentra extendido por
todo el mundo. Se tiene constancia del consumo de un tipo de algas verde-azuladas del
Tesis Doctoral
6
2.- Antecedentes
género Nostoc (Nostoc pruriforme y Nostoc comune) desde las primeras civilizaciones
aztecas en Sudamérica. Los antiguos nativos del lago salado de Chad (África central)
utilizaron la microalga Spirulina de forma regular en su alimentación. Este consumo se ha
dado principalmente en especies resistentes a condiciones ambientales extremas, lo que
permitía la proliferación de elevadas concentraciones en zonas geográficas
determinadas, como la acumulación de Spirulina en el lago Chad (África) o en Maracaibo
(Venezuela). Hoy día, las microalgas más extensamente cultivadas para fines
alimenticios son especies de Spirulina y Chlorella. La microalga Spirulina se vende como
alimento dietético o funcional, y se ha utilizado como alimento de alto valor proteico en
México y África central. Los mayores productores de Spirulina para consumo humano son
China, Taiwán, Estados Unidos, Tailandia, Japón e Israel. La microalga Chlorella se
comercializa como preparado multivitamínico en Japón y Taiwán, y como alimento
dietético en otros países occidentales.
En cuanto a la nutrición animal, las microalgas son una importante fuente
alimenticia y de aditivos en la cría comercial de muchas especies acuáticas,
especialmente de larvas y rotíferos. Estos últimos son empleados en la crianza de
crustáceos y peces, aunque existen otras alternativas a las algas como las levaduras y
los alimentos microencapsulados (Jones et al., 1987; Heras et al., 1994; Nell et al., 1996).
El cultivo de microalgas para este fin es una industria de alto valor y con un importante
tamaño de mercado. Las microalgas no son solamente consideradas como fuentes
esenciales de alimentación en acuicultura sino que también juegan un papel importante
en el incremento de la calidad de las especies animales cultivadas. El contenido en
aminoácidos, ácidos grasos, así como otras biomoléculas, influye de forma determinante
en el desarrollo de larvas y bivalvos (Fujimura et al., 1972; Cohen et al., 1976; Malecha,
1983). Hoy en día existen más de 40 especies diferentes utilizadas en acuicultura,
seleccionadas según su aporte nutricional y la facilidad de su producción masiva.
Respecto a la producción de compuestos de alto valor, las microalgas se
caracterizan por tener una composición bioquímica compleja, rica en sustancias de
protección frente a factores ambientales adversos, lo que las hace especialmente
interesantes para la producción de este tipo de compuestos. Actualmente existe un
amplio abanico de productos de interés que se obtienen comercialmente de microalgas,
como es el caso de ficobiliproteínas, carotenoides, ácidos grasos poliinsaturados y
polisacáridos, empleando para ello especies como Spirulina, Dunaliella, Porphyridium,
Chlorella, Scenedesmus, Muriellopsis o Haematococcus.
Tesis Doctoral
7
2.- Antecedentes
2.1.1.- LAS MICROALGAS FRENTE A CULTIVOS CONVENCIONALES
Las microalgas, constituyen un grupo de microorganismos fotosintéticos
extraordinariamente eficientes en lo que se refiere a la conversión de energía luminosa
en energía química almacenada. Así, son más eficientes que las plantas oleaginosas en
la captura de la energía solar, pudiendo llegar a alcanzar rendimientos fotosintéticos muy
altos (hasta el 5%) con una organización celular más simple.
La producción de biomasa a partir de microalgas es notablemente superior a la de
los cultivos agrícolas convencionales, del orden de 50 a 200 toneladas (peso seco) por
hectárea y año. Los requerimientos para su crecimiento como luz, azúcares, dióxido de
carbono, nitrógeno, fósforo y potasio son bajos y tienen alta capacidad para producir
sustancias como lípidos, proteínas y carbohidratos en grandes cantidades y en cortos
periodos de tiempo (Brennan y Owende, 2010).
Por otro lado, los cortos tiempos de generación permiten un rápido crecimiento y
la rápida recuperación del cultivo en caso de que se produzca algún contratiempo o
invasión del zooplancton, precisando su cultivo de una superficie muy pequeña en
comparación con otros como la soja, maíz, etc. (Tabla 2.1).
Tabla 2.1
Superficie de terreno necesaria para producir 1 kg de proteína (Henrikson, 1994).
Superficie Calidad del
Cultivo
(m2) Terreno
Alga Spirulina
0,5 Estéril
(65% proteína)
Soja (34% proteína) 16 Fértil
Maíz (9% proteína) 22 Fértil
Buey alimentado con
193 Fértil
grano (20% proteína)
Tesis Doctoral
8
2.- Antecedentes
Por otra parte, las microalgas presentan la posibilidad de crecer en aguas
salobres o marinas (Verma et al., 2010), e incluso con residuos orgánicos, pudiéndose
así aprovechar aguas no aptas para la agricultura tradicional ya que el consumo de
nutrientes que necesitan es pequeño en comparación al gran aporte que de ellos precisa
dicha agricultura (como ejemplo, el cultivo de microalgas necesita una cantidad de agua
cinco veces menor que los tradicionales cultivos de alfalfa y maíz) (Tabla 2.2).
Tabla 2.2
Agua necesaria para producir 1 kg de proteína (Henrikson, 1994).
Cultivo Litros Calidad del agua
Alga Spirulina
2.498 Salobre
(65% proteína)
Soja (34% proteína) 8.860 Dulce
Maíz (9% proteína) 12.416 Dulce
Buey alimentado con
104.000 Dulce
grano (20% proteína)
El cultivo comercial de microalgas a gran escala comenzó al inicio de la década de
los 60 en Japón con el cultivo de Chlorella, seguido por el establecimiento de mejoras en
el cultivo y cosecha de Arthrospira en el lago Texcoco a principios de los 70. En 1980 ya
había en Asia 46 fábricas de producción a gran escala, capaces de producir 1000 kg de
microalgas (principalmente Chlorella) por mes. En 1986, la producción comercial de
Dunaliella salina como fuente de -caroteno, por las empresas Western Biotechnology
(Hutt Lagoon, Australia) y Betatene (Whyalla, Australia), llegó a ser la tercera industria
microalgal más importante. Poco después se establecieron plantas en Israel y EE.UU., a
la vez que en India comenzó la producción a gran escala de cianobacterias (Spolaore et
al., 2006).
La biodiversidad de microalgas es enorme, existiendo actualmente miles de
especies distintas. Esa gran diversidad y consecuente variabilidad en la composición
bioquímica de la biomasa obtenida de cultivos de microalgas, unida a la mejora genética
y al establecimiento de tecnología de producción masiva que se han producido en los
Tesis Doctoral
9
2.- Antecedentes
últimos 30 años, han permitido cultivar comercialmente varias especies, siendo la
producción actual de biomasa microalgal de 5.000 T (peso seco). En este sentido, el
objetivo del cultivo de microalgas no es sólo la elaboración de alimentos, sino también la
obtención de compuestos naturales con alto valor biotecnológico en el mercado: ácidos
grasos poliinsaturados, carotenoides, ficobiliproteínas, polisacáridos, vitaminas, esteroles,
antioxidantes, compuestos reductores de colesterol, etc., (Olaizola, 2003; Derner et al.,
2006; Cadoret y Bernard, 2008).
Con fines comerciales, las microalgas se cultivan en sistemas abiertos o en
fotobiorreactores cerrados. Los sistemas abiertos presentan problemas de contaminación
de cultivos y dificultad de control de las variables de funcionamiento y por estas razones
la producción masiva de microalgas se lleva a cabo en fotobiorreactores cerrados que
operan en condiciones controladas, con el fin de obtener productividades elevadas y una
biomasa más uniforme en su composición y ritmo de producción (Imagen 2.2.). En los
últimos años se han producido avances significativos en el desarrollo y diseño de
fotobiorreactores cerrados, consiguiéndose sistemas más baratos, productivos y estables.
Hoy en día, debido a la mejora en los diseños con la introducción de nuevos materiales y
al abaratamiento de las materias primas, existen en operación reactores cerrados de gran
capacidad, con elevadas productividades de hasta 2 g.L-1.día-1 (Acién et al., 1998; Pulz,
2001; Verma et al., 2010).
Tesis Doctoral
10
2.- Antecedentes
a)
b)
c)
Imagen 2.2
Diferentes fotobiorreactores utilizados para el cultivo de microalgas:
a) Fotobiorreactor tubular en columna de burbujeo; b) Fotobiorreactor vertical plano;
c) Fotobiorreactor tubular horizontal. (Gentileza Dpto. Ingeniería Química, Universidad de Almería).
Tesis Doctoral
11
2.- Antecedentes
2.1.2.- APLICACIONES
Durante siglos se han aprovechado limitadamente las ventajas de las poblaciones
naturales de microalgas. Sólo recientemente (segunda mitad del siglo XX), se ha
intensificado su estudio científico y se ha llegado a desarrollar parcialmente el potencial
de la biotecnología microalgal, introduciéndose nuevos procesos y obteniéndose una
gran variedad de productos de alto valor.
Hoy en día una de las principales áreas de investigación en ciencia y tecnología
de la alimentación, es la extracción y caracterización de nuevos productos naturales con
actividad biológica, por ejemplo antioxidantes, antivirales, antihipertensivos, etc., que
pueden contribuir al bienestar de los consumidores como parte de nuevos alimentos
funcionales o nutraceúticos (Ruiz, 2012).
En este sentido, el gran potencial de la biotecnología de microalgas se extiende a
la producción de una serie enorme de productos, entre los que se incluyen alimentos
saludables, productos químicos industriales y compuestos con aplicaciones terapeúticas,
aunque para la mayoría de esas aplicaciones el mercado está todavía en desarrollo y el
uso biotecnológico de microalgas se extenderá probablemente a nuevas áreas (Olaizola,
2003; Mendiola et al., 2008; Raja et al., 2008).
Como ejemplo, cabe destacar a las cianobacterias o algas verde-azuladas, que
son organismos procariotas fotosintéticos y se han venido utilizando como alimento para
humanos en determinadas regiones del planeta. Así, son reconocidas como fuente de
vitaminas y proteínas y como tal se distribuyen como comida saludable en todo el mundo.
También es conocido que son fuente de compuestos para química fina, combustibles
renovables y compuestos bioactivos que poseen propiedades antivirales, antitumorales,
antibacteriales y como aditivos alimentarios (Singh et al., 2005).
Tesis Doctoral
12
2.- Antecedentes
Utilización en alimentación
El primer uso conocido de microalgas data de hace unos 2000 años, cuando en
China se empleaba la especie Nostoc para combatir la hambruna (Spolaore et al., 2006).
El alga verde-azulada Spirulina, que crece espontáneamente en los lagos de Chad (África
central) y Texcoco (México) entre otros, se recolecta desde tiempo inmemorial para su
consumo, después de secada al sol y mezclada con granos de cereales, por los pueblos
Kanenbou y Azteca. También existen referencias del consumo humano de algas verde-
azuladas fijadoras de nitrógeno (como Aphanizomenon) en otros países como Chile, Perú
y Filipinas.
Las microalgas poseen excelentes cualidades para ser empleadas en la
alimentación animal así como en la humana. La calidad de la biomasa de microalgas
viene dada por la ausencia de tejidos y órganos no aprovechables, así como por el bajo
contenido en materiales estructurales. Algunas especies no tienen celulosa dura en la
pared celular, lo que facilita la digestión y asimilación de las proteínas por el organismo
humano, y contienen cantidades favorables de ácidos grasos insaturados, muy poco
colesterol y una cantidad moderada de carbohidratos, factores que reducen las
afecciones coronarias y la obesidad, objetivos importantes en la sociedad actual (Durand-
Chastel, 1980).
Por otro lado, algunas especies de microalgas poseen un alto contenido en
proteínas (pudiendo alcanzar valores de proteína bruta del orden del 50 al 70% del peso
seco), carbohidratos y lípidos. Así, poseen porcentajes comparables e incluso superiores
a los de otras fuentes tradicionales de proteínas (Tabla 2.3).
Las proteínas de microalgas presentan un aminograma bastante equilibrado,
similar al de la harina de soja o de pescado, así como al estándar de la FAO, siendo
únicamente algo deficientes en aminoácidos azufrados (Tabla 2.4). Los estudios de
digestibilidad llevados a cabo con distintas especies de microalgas en diversos grupos de
animales (peces, moluscos, aves, rumiantes, etc.), han arrojado resultados satisfactorios.
Tesis Doctoral
13
2.- Antecedentes
Tabla 2.3
Comparación de la composición de alimentos y microalgas (% peso seco)
(Spolaore et al., 2006; Bruton et al., 2009).
MATERIA PROTEÍNAS CARBOHIDRATOS LÍPIDOS
Levadura 39 38 1
Carne 43 1 34
Leche 26 38 28
Arroz 8 77 2
Soja 37 30 20
Alga Anabaena cilíndrica 43-56 25-30 4-7
Alga Chlamidonomas rheinhardii 48 17 21
Alga Chlorella vulgaris 51-58 12-17 14-22
Alga Chlorella pirenoidosa 57 26 2
Alga Eugleria gracilis 39-61 14-18 14-20
Alga Tetraselmis maculata 52 15 3
Alga Dunaliella bioculata 49 4 8
Alga Dunaliella salina 57 32 6
Alga Porphyridium cruentum 28-39 40-57 9-14
Alga Scenedesmus obliquus 50-56 10-17 12-14
Alga Scenedesmus dimorphus 8-18 21-52 16-40
Alga Spirulina platensis 46-63 8-14 4-9
Alga Spirulina máxima 60-71 13-16 6-7
Alga Synechococcus sp. 63 15 11
Tesis Doctoral
14
2.- Antecedentes
Tabla 2.4
Aminoácidos esenciales del huevo entero, caseína y algunas especies de microalgas.
(Valores en g por 100 g de proteína). a) Durand-Chastel, 1980; b) Barbarino y Lourenco, 2005.
Huevo Caseína Spirulina Chlorella Porphyra Pterocladiella
Aminoácidos entero Máxima Pyrenoidosa Acanthophora capillacea
(a) (a) (a) (a) (b) (b)
Isoleucina 6,6 9,7 5,8 3,4 4,1 3,7
Leucina 8,8 9,7 8,3 6,0 8,1 6,8
Lisina 4,6 2,6 4,5 4,5 6,3 7,9
Metionina 3,1 3,6 1,8 2,0 1,1 1,1
Fenilanalina 5,8 3,9 5,2 7,2 4,7 5,3
Treonina 5,1 3,9 4,6 5,2 5,8 5,2
Triptófano 1,6 2,2 1,1 1,1 -- --
Valina 7,3 7,9 6,6 6,2 6,4 5,5
Por otra parte, el contenido en vitaminas y minerales se suma al interés
alimenticio de las microalgas. Representan una fuente de casi todas las vitaminas
esenciales (A, B1, B2, B6, B12, C, E, biotina, ácido fólico y ácido pantoténico (B5)). Además
son ricas en pigmentos como clorofila, carotenoides y ficobiliproteínas (Spolaore et al.,
2006). Por ejemplo, la especie Porphyridium cruentum, contiene carotenos, vitaminas,
hidratos de carbono y elementos tales como sodio, potasio, magnesio, hierro, cobre, zinc,
cromo, manganeso y cobalto (Rebolloso et al., 2000). La especie Spirulina platensis
también contiene aminoácidos esenciales, vitaminas, sustancias minerales, ácidos grasos
indispensables, polisacáridos, -caroteno y otros pigmentos (Blinkova et al., 2001).
Actualmente las microalgas para alimentación humana se presentan en el
mercado en diferentes formatos comerciales como tabletas, cápsulas y líquidos. También
se encuentran incorporadas a pastas, aperitivos, bebidas, golosinas o chicles
(Yamaguchi, 1997; Liang et al., 2004).
Aplicaciones clínicas
En cuanto a las aplicaciones clínicas de las microalgas, se han realizado
numerosos estudios que demuestran sus beneficios terapéuticos. Así, la especie
Spirulina platensis se usa como nutraceútico alimenticio por sus beneficios terapéuticos
en una serie de afecciones tales como enfermedades cardiovasculares, inflamatorias,
hipercolesterol, hiperglucemia, cáncer y enfermedades virales. Los beneficios
Tesis Doctoral
15
2.- Antecedentes
cardiovasculares de Spirulina son el resultado de sus actividades hipolipídicas,
antioxidantes y antiinflamatorias (Deng y Chow, 2010). Además, produce efectos
inmunoestimulantes aumentando la resistencia de seres humanos, mamíferos, gallinas y
pescado a infecciones, estimulando la producción de anticuerpos y contribuyendo a la
preservación de la microflora intestinal (Blinkova et al., 2001).
Por otro lado, porciones sulfolipídicas presentes en los glucolípidos de algunas
algas como Lyngbya, Oscillatoria, Anabaena y Spirulina, han demostrado ser efectivas
contra el virus del sida (Gustafson, 1989; Blinkova et al., 2001).
Estudios farmacológicos de extractos hidrosolubles de Chlorella stigmatophora y
Phaeodactylum tricornutum, indican que ambas especies muestran actividad
antiinflamatoria, analgésica y antirradicales libres (Guzmán et al., 2001). La especie
Arthrospira aporta varios beneficios a la salud como alivio de la hiperlipidemia, supresión
de la hipertensión, protección contra enfermedades renales, promoción del crecimiento
del Lactobacillus intestinal y supresión de los niveles elevados de glucosa en sangre.
Otro ejemplo es la especie Chlorella, que se muestra eficaz contra la úlcera gástrica, las
heridas y el estreñimiento, previene la arteriosclerosis y el colesterol, reduce los lípidos
en sangre y tiene acción antitumoral (Yamaguchi, 1997; Liang et al., 2004; Jong-Yuh y
Mei-Fen, 2005).
Alimentación animal
Las microalgas pueden ser utilizadas como alimento para una gran variedad de
animales, que van desde peces (acuicultura), hasta mascotas o animales de granja. De
hecho, el 30% de la producción mundial de microalgas se vende para alimentación
animal (Becker, 2004). Por ejemplo, la especie Arthrospira se usa como alimento para
muchos tipos de animales como gatos, perros, peces de acuario, pájaros ornamentales,
caballos, vacas y crías de toro. Así, aporta vitaminas naturales, minerales y ácidos grasos
esenciales, mejorando la respuesta inmunitaria, la fertilidad y el control de peso, así como
la apariencia externa a través de una piel saludable (Certik y Shimizu, 1999).
La acuicultura es una de las áreas de mayor crecimiento en el campo de la
producción de alimentos en los últimos años. Ésta va aumentando su producción cada
día, tanto en cantidad como en variedad de nuevas especies, siendo una parte cada vez
más importante respecto al volumen de capturas en el mar.
Tesis Doctoral
16
2.- Antecedentes
En este sentido, la demanda actual de pescado es más grande de la que el
océano puede aportar, por lo que las predicciones sugieren que la acuicultura puede ser
muy necesaria en un futuro inmediato (Arthur, 2009).
La importancia del cultivo de microalgas en acuicultura estriba en la posición basal
que éstas ocupan en la pirámide alimenticia. La capacidad que poseen de convertir sales
inorgánicas en compuestos orgánicos con la ayuda de la luz (fotosíntesis), las hace
imprescindibles en la producción de alimentos (Tamiya, 1957; Starr, 1971). En este
sentido y dado que las microalgas son el punto de inicio biológico del flujo de energía a
través de las más importantes cadenas alimenticias acuáticas, puede entenderse el
hecho de que la obtención y manipulación de estos microorganismos, sea una parte
fundamental dentro del diagrama de operaciones acuícolas.
En 1999 la producción de microalgas para acuicultura alcanzó las 1.000 T (62%
para moluscos, 21% para camarones y 16% para pescado) como parte de una
producción mundial de acuicultura de 43∙106 T (Muller-Feuga, 2000).
Las microalgas juegan un papel muy importante para el desarrollo de peces,
moluscos y crustáceos, al menos durante las fases larvaria y post-larvaria. Su presencia
influye también en el contenido de oxígeno y anhídrido carbónico del medio, lo cual afecta
de forma directa al crecimiento de la fauna de los ecosistemas acuáticos (Pruder, 1983).
Existen varias posibilidades para la utilización de microalgas en la alimentación de las
larvas de peces, moluscos y crustáceos, así como de los animales adultos. Lo más usual
es la aplicación directa de las microalgas a estos consumidores. En este sentido, se
utilizan determinadas especies cultivadas para este fin y que resultan imprescindibles en
la dieta de muchos moluscos marinos bivalvos (e.g. ostras y almejas), larvas de algunos
crustáceos y gasterópodos (abalone), larvas de gambas (Penaeus y Metapenaeus),
algunos peces (e.g. Tilapia y carpas), rotíferos y zoopláncton (Kanazawa et al., 1985;
Lavens et al., 1995; Reitan et al., 1997; Knauer y Southgate, 1999).
Aunque para algunos peces y moluscos las algas pueden no ser esenciales, el
aporte de las mismas como nutriente aumenta significativamente su supervivencia,
debido probablemente a que añaden un factor de crecimiento o producen una acción
bactericida en el medio (Cohen et al., 1976; Malecha, 1983). Hoy en día existen más de
40 especies diferentes de microalgas de aplicación práctica en acuicultura, aisladas en
diferentes partes del mundo y cuyo tamaño oscila desde unos pocos µm hasta más de
100 µm. Para su uso en acuicultura, las microalgas deben cumplir varios criterios como
Tesis Doctoral
17
2.- Antecedentes
facilidad de cultivo, forma y tamaños adecuados, altos valores nutricionales y
digestibilidad de sus células para facilitar el acceso a los nutrientes (Brown et al., 1999).
Las microalgas son incluso utilizadas en el refinamiento de la acuicultura, y así,
por ejemplo, se utiliza Haslea ostrearia para dar color verde-azulado a las agallas y el
apéndice móvil de las ostras (técnica francesa), lo que incrementa el valor del producto
en un 40% (Muller-Feuga, 2000).
Fuente de productos químicos naturales
Otra importante utilidad de las microalgas es la obtención de productos químicos
naturales. Las algas de tamaño macroscópico se cosechan por su contenido en
polisacáridos, incluido el agar y el ácido algínico, los cuales se extraen comercialmente a
gran escala.
Las microalgas han desarrollado diferentes estrategias para su supervivencia en
condiciones extremas de forma que, mediante simulación de estas condiciones en los
sistemas de cultivo, el metabolismo celular puede dirigirse hacia la biosíntesis de las
sustancias cuya producción se persigue (Gudin y Thepenier, 1986).
Obtención de proteínas
La obtención de proteínas a partir de microalgas fue una de las primeras
aplicaciones en desarrollarse dentro de este campo, al igual que se hacía con cultivos de
bacterias o levaduras, utilizados desde hace tiempo como fuentes de proteínas de origen
unicelular. Hay que considerar que el contenido en proteínas de las microalgas varía en
función de la especie y puede llegar a ser superior al 50% de la biomasa seca.
Obtención de vitaminas
Las vitaminas sintetizadas por las microalgas que pueden dar lugar a un
aprovechamiento comercial, son principalmente la B12 y la vitamina E (Tocoferol). Sin
embargo, son capaces de sintetizar la mayoría de las vitaminas y los contenidos
observados de las mismas, son perfectamente comparables a los encontrados en otros
microorganismos, como levaduras y bacterias.
Tesis Doctoral
18
2.- Antecedentes
Numerosas vitaminas hidrosolubles han sido detectadas en el sobrenadante de
los cultivos de microalgas, pudiendo ser excretadas por estos microorganismos de forma
activa como resultado de su metabolismo, o bien pasar a formar parte del sobrenadante
una vez que la microalga ha muerto y su biomasa se ha desintegrado. En algunas
ocasiones, la proporción de vitaminas que son excretadas al medio, puede llegar a ser
muy elevada. Por ejemplo, Koptera (1970) señala que la microalga verde-azulada
Anabaena hassali, excreta hasta el 94% de su contenido en biotina. La microalga
Phaeodactylum tricornutum, cuenta en su composición bioquímica con determinadas
vitaminas, como pueden ser la B1 y la biotina (ambas segregadas al medio), así como la
B12, la cual permanece en el interior celular.
Obtención de pigmentos
Como organismos fotosintéticos, las microalgas contienen pigmentos antena que,
bajo ciertas condiciones fisiológicas, pueden acumularse en la célula, alcanzando
notables concentraciones. El principal pigmento son las clorofilas, compuestos esenciales
en muchos productos diarios. Así, se usan como aditivos en productos cosméticos y
farmacéuticos, pero también como biocolorantes en alimentación y tienen propiedades
antioxidantes y antimutagénicas (Hosikian et al., 2010).
Además de las clorofilas, los pigmentos más importantes desde el punto de vista
económico son las biliproteínas como ficocianinas y ficoeritrinas, así como una gran
variedad de carotenoides, de los que existen unos 400 tipos diferentes. Sin embargo, de
éstos sólo se explotan comercialmente unos pocos, entre los que se encuentran: -
caroteno, zeaxantina, astaxantina y luteína. Estos pigmentos tienen aplicación en las
industrias farmaceútica y alimentaria como colorantes naturales, potenciadores de la
pigmentación de aves de corral, en cosmética, como precursores de la vitamina A, etc.
(Borowitzka, 1988). El organismo más utilizado para la producción de -caroteno es la
especie Dunaliella salina con un 14% de su peso seco (Metting, 1996).
La astaxantina es usada como pigmento en la industria del salmón y se extrae
principalmente de la microalga Haematococcus pluvialis, donde puede alcanzar
contenidos entre 1,5 y 3% de peso seco (Todd Lorenz y Cysewski, 2000). Aunque por su
mayor precio no puede competir con su forma sintética, para ciertas aplicaciones como la
alimentación de carpas, pollos y bremas rojos se utiliza la astaxantina procedente de
microalgas por las exigencias reguladoras y por la preferencia de los consumidores hacia
los productos naturales (Cysewski y Todd Lorenz, 2004).
Tesis Doctoral
19
2.- Antecedentes
Obtención de polisacáridos
Otros productos obtenidos de las microalgas, que encuentran gran aplicación en
la industria, son los polisacáridos. Las especies comercialmente más prometedoras son
las algas rojas unicelulares Porphyridium cruentum y Porphyridium aerugineum, que bajo
determinadas condiciones de crecimiento pueden producir cantidades importantes de
polisacáridos extracelulares, constituidos por los siguientes monómeros: D-glucosa, D- y
L-galactosa, 3-0-metilxilosa, 3- y 4-0-metilgalactosa y ácido D-glucurónico (Richmond,
1990). Su competencia la encuentran en las macroalgas que sintetizan polisacáridos,
principalmente alginatos, carragenatos, agarosa, así como en ciertas bacterias y hongos.
La particularidad desde el punto de vista químico de los polisacáridos producidos por
Porphyridium es que están sulfatados, como ocurre con los carragenatos, compuestos de
xilosa, glucosa y galactosa. Así, estos compuestos son considerados antiinflamatorios
efectivos para uso tópico (Matsui et al., 2003).
Obtención de lípidos
Los lípidos contenidos en las microalgas son fundamentalmente ésteres de la
glicerina y ácidos grasos, con un número de átomos de carbono comprendidos entre 12 y
24. Casi todos los ácidos grasos encontrados en los lípidos de las microalgas, están
formados por cadenas moleculares lineales, con un número par de átomos de carbono.
Los más interesantes comercialmente son los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA´s), en
general, y los ácidos grasos esenciales (EFA´s), en particular. Los EFA´s para nutrición
humana son los ácidos linoleico, araquidónico, linolénico y eicosapentaenoico. Excepto el
linoleico, estos ácidos grasos son poco frecuentes en los animales y plantas superiores,
estando presentes en cantidades relativamente grandes en algunas especies de
microalgas.
Obtención de isótopos bioquímicos estables
Las microalgas son fuente de compuestos marcadores isotópicos estables. La
habilidad para llevar a cabo la fotosíntesis les permite incorporar isótopos estables (13C,
15N y 2H) de moléculas inorgánicas de bajo coste (13CO2,
15NO3 y
2H2O) a compuestos
orgánicos de alto valor como aminoácidos, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos. Los
isótopos estables se usan para dos fines: la incorporación dentro de proteínas,
carbohidratos y ácidos nucleicos para facilitar su determinación estructural a nivel
Tesis Doctoral
20
2.- Antecedentes
atómico y para estudios metabólicos a través del incremento de masa de los compuestos
etiquetados (Apt y Behrens, 1999; Acién et al., 2003).
Obtención de biocombustibles
Las algas, particularmente las microalgas unicelulares verdes, se vienen
proponiendo desde hace tiempo como potenciales fuentes de biofuel (Oswald y Golueke,
1960; Benemann et al., 1977).
En la actualidad existen numerosos proyectos de investigación que utilizan los
cultivos de microalgas para la producción de biocombustibles. Así, mediante este tipo de
cultivos se obtiene biodiesel, bioetanol, biohidrógeno y biogás (Chisti, 2007; Seefeldt,
2007; Li et al., 2008).
Según las predicciones tecnológicas, la tercera generación de biocombustibles
derivará de las microalgas, ya que no presentan algunas de las desventajas de los de
primera y segunda generación, como son la necesidad de gran superficie de cultivo y de
agua (Costa y De Morais, 2011). Así, numerosos estudios argumentan que la producción
de biofuel a partir de microalgas, particularmente la producción de biodiesel, es
económica y medioambientalmente sostenible (Huntley y Redalje, 2007; Chisti, 2008;
Brune et al., 2009; Stephen et al., 2010) aunque también existen algunos puntos de vista
escépticos sobre su viabilidad (Reijnders, 2008; Walker, 2009; Van Beilen, 2010).
Este tipo de investigaciones han cobrado mucha importancia, ya que, además de
producir biocombustibles, suelen tener como objetivo paralelo y complementario, la
reducción de problemas ambientales. Así, uno de los problemas ambientales actuales es
el progresivo avance y acumulación en la atmósfera de los gases de efecto invernadero,
de los cuales el más importante es el CO2. En este sentido, se están desarrollando los
cultivos de microalgas y utilizando el CO2 procedente de las líneas efluentes industriales,
como fuente de gas nutriente (Chang y Yang, 2003; González et al., 2009; Stephen et al.,
2010).
Otra aplicación cada vez más utilizada es la eliminación de compuestos químicos
contaminantes en aguas residuales mediante el cultivo en las mismas de microalgas, las
cuales a través de su metabolismo pueden eliminar distintos elementos como nitrógeno y
fósforo (Hoffmann, 1998; Mallick, 2002; Aslan y Kapdan, 2006; Hernández et al., 2006;
Hameed, 2007; De-Bashan y Bashan, 2010; Pittman et al., 2011).
Tesis Doctoral
21
2.- Antecedentes
Utilización en cosmética
Algunas especies de microalgas son utilizadas en la formulación de ciertos
productos para el cuidado de la piel, como, por ejemplo, cremas antiedad, productos
refrescantes, antirritantes, regenerantes de la piel y emolientes. Entre ellas destacan
Arthrospira y Chlorella (Stolz y Obermayer, 2005). También se encuentran microalgas en
productos para el cuidado del cabello y protectores solares.
Algunas empresas cosméticas han invertido en su propio sistema de producción
de microalgas (Spolaore et al., 2006).
2.1.3.- CULTIVO Y PRODUCCIÓN DE SCENDESMUS ALMERIENSIS
El alga utilizada en esta Tesis ha sido Scenedesmus almeriensis, cultivada en el
Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Almería (Sánchez et al.,
2008a).
Para el crecimiento y mantenimiento de esta microalga se ha empleado como
medio de cultivo el propuesto por Mann & Myers (1968) (Tabla 2.5), modificado para
prepararlo empleando fertilizantes agrícolas comerciales en lugar de productos químicos
puros. El medio Mann & Myers consta de macronutrientes, cuya adición se realiza por
pesada directa de sales y micronutrientes, en los que la baja concentración obliga a
preparar una disolución stock concentrada. Para la preparación del medio de cultivo se
emplea agua, y una vez añadidas todas las sales, se esteriliza en autoclave a 120 ºC
durante 20 minutos.
El cultivo de la microalga Scenedesmus almeriensis se realiza en fase líquida, en
medio de cultivo Mann & Myers, en matraces esféricos de 1 L de capacidad, cerrando la
parte superior con algodón hidrofóbico para facilitar el intercambio gaseoso (Imagen 2.3).
Este cultivo no dispone de control de pH y se mantiene a una temperatura de 25 ºC. El
caudal de aireación empleado es de 1 L/min (1 v/v/min) y luz continua de 540 µE/(m2·s)
que proporcionan dos lámparas Philips TLD W/54. Al tratarse de cultivos discontinuos es
necesario renovar los mismos de forma periódica cada cinco o seis días con medio nuevo
y estéril. Esta operación se lleva a cabo en una campana de flujo laminar, para evitar la
contaminación de los cultivos.
Tesis Doctoral
22
2.- Antecedentes
Tabla 2.5
Composición del medio Mann & Myers (1968).
Macronutrientes Concentración, g·L-1
MgSO4·7H2O 1,20
NaNO3 1,00
CaCl2 0,30
K2HPO4 0,10
Micronutrientes Concentración, g·L-1
Na2EDTA 0,030000
H3BO3 0,006000
FeSO4·7H2O 0,002000
MnCl2 0,001400
ZnSO4·7H2O 0,000330
Co(NO3)2·6H2O 0,000007
CuSO4·5H2O 0,000002
Imagen 2.3
Matraces de mantenimiento y precultivo de la microalga.
(Gentileza Dpto. Ingeniería Química, Universidad de Almería)
Para la producción de biomasa de Scenedesmus almeriensis se han empleado
fotobiorreactores tubulares tipo valla de 3 m3, disponibles en la Estación Experimental Las
Palmerillas (Fundación Cajamar, Almería) (Imagen 2.4). Los reactores constan de un lazo
de tubo de metacrilato de 90 mm de diámetro y una longitud de 400 m, a través del cual
se recircula el cultivo desde una columna de burbujeo que se emplea para la eliminación
de oxígeno, refrigeración, cosechado y aporte de medio. El diámetro de la columna de
burbujeo es de 400 mm y en su interior dispone de un cambiador de calor por el que se
Tesis Doctoral
23
2.- Antecedentes
hace circular agua fría para mantener la temperatura del cultivo por debajo del valor límite
para la microalga. El fotobiorreactor está equipado con los sistemas auxiliares necesarios
para su adecuado funcionamiento como bomba centrífuga para la impulsión del cultivo a
través del lazo, sistema de inyección de aire para la eliminación de oxígeno, suministro
de CO2 al inicio del lazo, sistema de aporte de solución nutritiva y de cosechado del
cultivo, sensores de pH, oxígeno disuelto y temperatura para el seguimiento del estado
del cultivo, etc.
Imagen 2.4
Fotobiorreactores tubulares empleados para la producción de biomasa de la microalga
Scenedesmus almeriensis. (Gentileza Dpto. Ingeniería Química, Universidad de Almería).
Estos reactores se inoculan con cultivo procedente de laboratorio y operan en
modo continuo a una velocidad de dilución de 0,3 día-1. Para ello, el medio de cultivo se
prepara añadiendo fertilizantes agrícolas a agua de riego y filtrándola mediante
ultrafiltración (0,02 micras) antes de entrar a cada uno de los reactores a un caudal de
200 L/min en las horas centrales del día. El volumen de medio de cultivo añadido
desplaza fuera del reactor un volumen idéntico que sale a través de una válvula en la
parte superior del reactor, a modo de rebosadero. Este cosechado se recoge en un
tanque de donde se centrifuga en continuo empleando una centrífuga de cámara y discos
a un caudal de 1 m3/h. Se obtiene un agua clarificada que se emplea para riego agrícola,
y un concentrado de microalgas con una concentración de 200 g/L. Este concentrado se
liofiliza durante 24 h, obteniéndose la biomasa seca (Imagen 2.5), que a continuación se
moltura y pasa a la etapa de extracción de antioxidantes o carotenoides.
Tesis Doctoral
24
2.- Antecedentes
a) b)
Imagen 2.5
Imagen de la biomasa liofilizada de Scenedesmus almeriensis.
a) Biomasa liofilizada fragmentada en porciones sin triturar.
b) Biomasa liofilizada y posteriormente molturada en molino de bolas.
Los resultados obtenidos por el Departamento de Ingeniería Química de la
Universidad de Almería (Acién et al., 2012a) demuestran que es posible la producción a
gran escala de Scenedesmus almeriensis en fotobiorreactores tubulares de gran
volumen. La tecnología desarrollada resulta operativa y el rendimiento del sistema se
ajusta a lo predicho por los modelos desarrollados, aunque con diferencias por las
variaciones entre los sistemas de cultivo utilizados. Concretamente, existe una planta
semi-industrial, compuesta de 10 fotobiorreactores de 3 m3, que ha operado de forma
estable durante más de un año con una productividad de biomasa de 7 T·año-1. Este
sistema es similar a otro desarrollado en Alemania, que con un volumen total de 700 m3
tiene una capacidad de producción de 130 T·año-1 de Chlorella (Pulz, 1998). Ambos
sistemas son de los más grandes que existen actualmente para la producción de
microalgas basada en tecnología tubular, aunque se están construyendo nuevas plantas,
lo que pone de manifiesto la viabilidad técnica y económica alcanzada ya con este tipo de
sistemas (Ruiz, 2012).
Tesis Doctoral
25
2.- Antecedentes
2.2.- CAROTENOIDES-ANTIOXIDANTES
2.2.1.- GENERALIDADES
Los carotenoides son compuestos tetraterpenoides, formados por ocho unidades
de isoprenos y biosintetizados a partir del precursor isopentenil pirofosfato, el cual
proviene del ácido mevalónico. La cadena isoprenoide de los carotenoides es obtenida
por la unión de cuatro unidades de isopentenil pirofosfato, seguido de la unión de dos
unidades de geranil-geranil pirofosfato para dar el primer producto de cuarenta átomos de
carbono, el fitoeno (Britton y Hornero-Méndez, 1997; Oliver y Palou, 2000). Este
compuesto sufre reacciones de deshidrogenación que dan lugar a la formación de
licopeno. Así, todos los carotenoides se consideran derivados del licopeno por reacciones
de hidrogenación, ciclización, inserción de oxígeno, y migración de dobles enlaces y
metilos, entre otras (Delgado-Vargas et al., 2000). Así, su estructura presenta muchos
dobles enlaces conjugados y varias ramificaciones con grupos metilo.
Los carotenoides se clasifican principalmente en dos grupos: carotenos y
xantófilas. Los carotenos presentan una estructura que solo contiene carbono e
hidrógeno; en tanto que las xantófilas, además de poseer carbono e hidrógeno, contienen
oxígeno, en forma de grupos sustituyentes como hidroxilo, carbonilo y epóxido.
Adicionalmente, existen otros carotenoides de menor tamaño denominados
apocarotenoides, obtenidos a partir de rupturas de los tetraterpenoides en los carbonos 6,
9, 6´ o 9´; por ejemplo, la crocetina y la bixina (Britton, 1995; Krinsky y Johnson, 2005).
En general, los carotenoides en sus extremos pueden ser lineales o cíclicos; por
lo tanto, diferentes combinaciones de estas características estructurales han llevado a
detectar más de 600 carotenoides distintos presentes en las plantas (González, 2010).
Entre los carotenoides más comunes se encuentran el β-caroteno, licopeno,
cantaxantina, astaxantina, β-criptoxantina, capsantina, zeaxantina y luteína, entre otros.
La Tabla 2.6 muestra los principales carotenoides presentes en diferentes alimentos
(González, 2010).
Tesis Doctoral
26
2.- Antecedentes
Tabla 2.6
Distribución de carotenoides mayoritarios presentes en diversos alimentos (González, 2010).
Alimento Carotenoides mayoritarios
Aceite (Olea europaea) Luteína, β-caroteno
Albaricoque (Prunus armeniaca) β-caroteno
Anacardo (Anacardium occidentale) β-criptoxantina, β-caroteno
Brócoli (Brassica oleracea) Luteína, luteína epóxido, neoxantina
Calabaza (Cucurbita moschata) α- y β-caroteno
Ciruela (Spondias lutea) β-criptoxantina
Guayaba (Psidium guajava) Licopeno, β-caroteno
Lechuga (Lactuca sativa) β-caroteno, luteína, violaxantina, lactucaxantina
Maíz (Zea mays) Luteína, zeaxantina
Mango (Mangifera indica) Violaxantina, β-caroteno
Melocotón (Prunus pérsica) β-criptoxantina, luteína
Naranja (Citrus sinensis) Violaxantina, β-criptoxantina, luteína,
Ortiga (Urtica dioica) Luteína, β-caroteno
Papaya (Carica papaya) β-criptoxantina, β-caroteno
Patata (Solanum tuberosum) Violaxantina, anteraxantina, luteína, lactucaxantina
Pimiento rojo (Capsicum anuum) Capsantina, capsorrubina
Pomelo (Citrus paradisi) Licopeno, β-caroteno
Tomate (Lycopersicum esculentum) Licopeno, β-caroteno
Yema de huevo Luteína
Zanahoria (Daucus carota) α- y β-caroteno
En general, los carotenoides no se encuentran muy presentes en los animales, ya
que estos no son capaces de biosintetizarlos; sin embargo, estos pigmentos son
fundamentales en su alimentación, pues son fuente de vitamina A. Existen algunas
excepciones, como es el caso de la trucha y algunos crustáceos que deben su color
rojizo a la presencia de astaxantina. Los carotenoides son los responsables de los
colores amarillos, anaranjados y rojos que presentan los alimentos, los tallos, las flores y
hojas de las plantas, las bacterias y algunos animales invertebrados marinos (Goodwin,
1965). En los tejidos verdes se localizan en los cloroplastos, y en los tejidos rojos,
anaranjados y amarillos se encuentran en los cromoplastos (Britton y Hornero-Méndez,
1997).
Tesis Doctoral
27
2.- Antecedentes
Los carotenoides, junto con las antocianinas y clorofilas, son los pigmentos
vegetales de mayor abundancia en la naturaleza. Por su diversidad estructural y
numerosas funciones, están involucrados en la fotosíntesis y previenen y protegen la
salud de los seres humanos, por su significativa actividad antioxidante. También se ha
demostrado que los carotenoides intervienen en la respuesta inmune y en la
comunicación celular in vivo, ya que regulan la expresión de algunos genes, como es el
caso de los genes que producen el γ-interferón, el cual es responsable de regular las
respuestas inflamatorias e inmunes. Solo algunos de los carotenoides presentes en los
alimentos son precursores de la vitamina A1, como es el caso del β-caroteno y otros
carotenoides que poseen anillo β no sustituido. Esta vitamina es importante en el proceso
de la visión, mantenimiento epitelial, secreción de la mucosa y reproducción (Delgado-
Vargas et al., 2000).
Varios estudios epidemiológicos han mostrado una relación entre el alto consumo
de frutas y vegetales, y una disminución en el riesgo de contraer enfermedades
degenerativas como el cáncer, enfermedades cardiovasculares y degeneración macular,
debido principalmente a la presencia de compuestos carotenoides con actividad
antioxidante (Su et al., 2002).
2.2.2.- IMPORTANCIA NUTRICIONAL
Además de la contribución de los carotenoides al color atractivo de las frutas y
verduras, destaca, por su importancia a nivel fisiológico y dietético, la propiedad de tener
actividad provitamina A (Isler, 1971; Simpson, 1983).
La vitamina A es esencial para la visión nocturna y necesaria para mantener sana
la piel. Puede aportarse como tal vitamina, llamada retinol, como algunos análogos
menos activos, o como sus precursores, los carotenoides. El retinol es un alcohol cíclico,
insaturado, de veinte átomos de carbono, compuesto por un núcleo de β-ionona y una
cadena lateral insaturada. En la molécula de retinol (Figura 2.1) existen cinco dobles
enlaces conjugados, incluido el doble enlace del anillo de β-ionona que está conjugado
con los de la cadena lateral.
Tesis Doctoral
28
2.- Antecedentes
Figura 2.1
Estructura del retinol.
La capacidad de los carotenos para actuar como provitamina A depende de la
conversión en retinol por los animales, así como de la presencia de β-ionona. Los
carotenos que contienen como mínimo un anillo de β-ionona pueden convertirse en
retinol en los animales. De esta forma, el carotenoide más importante al respecto es el β-
caroteno, que contiene dos de estos anillos (Figura 2.2). El α- y el γ-caroteno, sin
embargo, no pueden convertirse en retinol en los animales con la misma eficacia que el
β-caroteno, ya que el anillo α del γ-caroteno no puede convertirse en el organismo en β-
ionona, y la estructura abierta de la cadena del γ-caroteno no puede hacerse cíclica en
los animales. Por esta razón el α-caroteno y el γ-caroteno se transforman en retinol con la
mitad de eficiencia que el β-caroteno. La actividad biológica del anillo de β-ionona en los
carotenos cesa por la introducción de un grupo hidroxilo. La β-criptoxantina, con un anillo
de β-ionona sustituido por un hidroxilo y el otro intacto, tiene la misma actividad
provitamínica A que el α- y γ-caroteno. La zeaxantina tiene dos anillos de β-ionona
hidroxilados, por lo que no actúa como provitamina A (Meléndez-Martínez et al., 2004a).
En la actualidad el término provitamina A se usa para todos los carotenoides que
presentan cualitativamente la actividad del β-caroteno. Nutricionalmente el carotenoide
provitamínico más importante es el β-caroteno, que se definía hasta hace poco como el
que tenía 1/6 de la actividad del retinol. En realidad, resulta bastante difícil hacer una
estimación exacta de los equivalentes de retinol, ya que la biodisponibilidad de los
carotenoides, provitamínicos o no, depende de una serie de factores, como, por ejemplo,
el tipo de carotenoide, la matriz en la que se encuentran, el procesado del alimento,
interacción con otros carotenoides así como con la grasa y la fibra, estatus nutricional,
edad e infección por parásitos, etc. Debido a todo ello, existe una importante controversia
en torno a la utilidad de estos equivalentes. No obstante, en la actualidad, el comité que
fija los niveles de ingesta de referencia (Dietary Reference Intake Committee) considera
que un equivalente de retinol equivale a 12 µg de β-caroteno o a 24 µg de otros
carotenoides provitamínicos. La molécula de β-caroteno es, en realidad, una estructura
doble de retinol y, teóricamente, su división debería dar lugar a dos moléculas de retinol.
La disparidad entre la estructura química y la actividad biológica del β-caroteno se debe,
Tesis Doctoral
29
2.- Antecedentes
por una parte, a la absorción incompleta y, por otra parte, a la falta de estequiometría de
la reacción, debido a la formación de metabolitos oxidados de retinol. En relación con
esto cabe decir que, por ejemplo, los carotenoides ingeridos con los alimentos se
absorben en menor grado que los carotenoides puros, por lo que los factores de
conversión van a depender de la procedencia de los carotenoides. Así, por ejemplo, se
considera que 2 µg de β-caroteno en solución oleosa equivalen a 1 µg de retinol.
Además, en estos pigmentos cabe la posibilidad de isomería cis/trans, presentando los
isómeros cis menor actividad como provitamina A que las formas trans. Es, por tanto,
muy importante evitar la formación de isómeros cis durante el procesado de alimentos
ricos en carotenoides.
Figura 2.2
Estructura del β-caroteno.
Por otra parte, desde hace tiempo se viene postulando que los carotenoides
actúan como potenciadores positivos de la respuesta inmune. En este sentido, parece ser
que elevadas dosis de β-caroteno aumentan el ratio entre los linfocitos CD4 y CD8, que
es muy bajo en enfermos de VIH (Olson, 1999).
Sin embargo, el hecho de que los carotenoides estén suscitando últimamente un
gran interés, se debe en buena parte a una serie de estudios que demuestran su
actividad antioxidante. Desde un punto de vista nutricional, se puede definir un
antioxidante como aquella sustancia presente en los alimentos que disminuye
significantemente los efectos adversos de especies reactivas como las del oxígeno y el
nitrógeno, en condiciones fisiológicas normales en humanos (Food and Nutrition Board,
2000).
La actividad antioxidante de estos pigmentos depende de una serie de factores,
como su estructura química (tamaño, número de sustituyentes, configuración cis o trans,
etc.), su concentración, la presión parcial de oxígeno o su interacción con otros
antioxidantes, sobre todo las vitaminas C y E. En un principio los estudios se llevaron a
cabo basándose principalmente en el β-caroteno; el mecanismo de la actividad
antioxidante de este compuesto está relacionado con su carácter hidrofóbico y con su
Tesis Doctoral
30
2.- Antecedentes
capacidad para "retirar" el oxígeno singlete y desactivar radicales libres. Se ha sugerido
asimismo que el β-caroteno puede pasar de ser antioxidante a pro-oxidante en función de
la concentración y la presión de oxígeno, entre otros factores. Existen estudios in vitro
que apuntan que la actividad antioxidante de este compuesto es mayor que la del α-
tocoferol (Jialal et al., 1991; Nakagawa, 1996). También se ha demostrado que otros
carotenoides, como la astaxantina, responsable del color de la carne de salmón, son
buenos antioxidantes (Tanaka, 1995; Naguib, 2000). Otros carotenoides con actividad
antioxidante son la luteína, zeaxantina, cantaxantina y licopeno. En este punto, cabe
comentar que en muchas ocasiones los resultados obtenidos en relación con la actividad
antioxidante de los carotenoides son poco precisos y en algunos casos incluso
contradictorios, debido a la gran variedad de métodos y experimentos diseñados. Así, por
ejemplo, algunos ensayos indican que la actividad antioxidante de la astaxantina es
superior a la de otros carotenoides (Naguib, 2000), mientras que en otros estudios se
llega a la conclusión contraria (Woodall, 1997).
En un interesante ensayo en el que participaron voluntarios de cinco países, se ha
puesto de manifiesto que la suplementación con carotenoides no implica un aumento de
la resistencia de las lipoproteínas de baja densidad frente a la oxidación; no obstante, los
resultados de dicho ensayo demostraron que el consumo de frutas y verduras ricas en
carotenoides sí implicaba un aumento de resistencia frente a los procesos oxidativos
(Southon, 2000). De igual forma se observó que el incremento de los niveles plasmáticos
de carotenoides estaba asociado con un menor daño del ADN y una mayor actividad
reparadora. De forma previa, se había sugerido que el enriquecimiento de lipoproteínas
de baja densidad con β-caroteno y licopeno mejora la defensa frente al oxígeno singlete.
Este enriquecimiento de las proteínas de baja densidad se consiguió sometiendo a
voluntarios sanos a suplementación alimentaria con zumo de tomate. En otro estudio, se
ha llegado a la conclusión de que, tanto los carotenoides del pimentón como el β-
caroteno, inhiben la peroxidación lipídica in vivo (Seppanen y Csallany, 2002).
Todo esto ha llevado a que se investigue el papel de estos compuestos en la
prevención de enfermedades degenerativas como aterosclerosis, cáncer, envejecimiento,
cataratas, degeneración macular relacionada con la edad, etc. Se ha evaluado el papel
protector para las células humanas frente a la radiación ultravioleta de diversos
antioxidantes como β-caroteno, α-tocoferol y ácido ascórbico, llegándose a la conclusión
de que el primero es el más eficiente, probablemente debido a su localización en la
membrana celular. Luteína y zeaxantina, dos de los carotenoides mayoritarios en el suero
humano, se localizan en cantidades apreciables en la retina, protegiéndola debido a sus
Tesis Doctoral
31
2.- Antecedentes
propiedades antioxidantes (Snodderly, 1995). En cuanto al licopeno, se ha demostrado in
vivo que una dieta rica en tomate mantenida durante dos semanas protege a los linfocitos
frente al radical dióxido de nitrógeno y al oxígeno singlete (Böhm et al., 1995). De forma
previa se comprobó que era más efectivo que el β-caroteno en la protección celular frente
al radical dióxido de nitrógeno. El papel del β-caroteno en la prevención de enfermedades
coronarias ha sido también objeto de una serie de estudios que proporcionan unos datos
a veces contradictorios, por lo que se postula que dicha prevención se debe más al
consumo de alimentos ricos en β-caroteno que a dicho pigmento en particular (Tavani y
La Vecchia, 1999). Por lo que respecta al efecto en el estatus antioxidante de fumadores,
se ha comprobado que la suplementación con una combinación de β-caroteno y
vitaminas C y E aumenta los niveles plasmáticos de antioxidantes y la actividad de
enzimas antioxidantes en fumadores varones con hiperlipemia (Chao et al., 2002).
Hay estudios que relacionan la aparición de algunos tipos de cáncer con la
carencia de ciertos carotenoides en la dieta, por lo que son considerados compuestos
anticancerígenos (Bendich, 1989; Krinsky, 1989; Ziegler, 1989). Varias investigaciones
epidemiológicas han mostrado que el riesgo de padecer cáncer es inversamente
proporcional al consumo de vegetales y frutas ricos en carotenoides. Si bien muchos de
estos estudios se han centrado en el β-caroteno, otros carotenoides eficaces en la
prevención de la enfermedad son β-criptoxantina, zeaxantina, astaxantina e incluso el
carotenoide no coloreado fitoeno (Nishino et al., 1998). En un estudio reciente, se ha
demostrado una relación inversa entre el consumo de alimentos ricos en luteína (como
espinaca o lechuga) y el cáncer de colon, tanto en hombres como en mujeres (Slattery et
al., 2000). De igual forma se ha demostrado que los carotenoides típicos del pimiento rojo
(Capsicum annuum L.) como capsantina y sus ésteres y capsorrubina, entre otros, son
efectivos agentes antitumorales (Maoka et al., 2001). La protección de los pigmentos
carotenoides frente al cáncer y a otras enfermedades crónicas podría deberse, además
de a sus propiedades antioxidantes, a otros efectos como la inhibición de la proliferación
de células, mejora de la diferenciación celular, estimulación de la comunicación
intercelular y filtración de la luz azul, entre otros (Olson, 1999).
Como se deduce de lo anteriormente expuesto, en la actualidad son muchos los
investigadores que trabajan en las propiedades antioxidantes y antitumorales de estos
compuestos, por lo que continuamente se están aportando nuevos datos al respecto y
poniéndose de manifiesto estas beneficiosas propiedades en otros carotenoides. Cabe
señalar que la mayoría de los estudios sobre la actividad antioxidante de los carotenoides
Tesis Doctoral
32
2.- Antecedentes
se han llevado a cabo in vitro, aunque en los últimos años el número de ensayos in vivo
ha aumentado considerablemente (Meléndez-Martínez et al., 2004a).
Actualmente no existe una recomendación de ingesta diaria de carotenoides,
aunque se ha propuesto un valor de referencia de 6 mg/día, basado en el aporte de los
carotenoides con actividad de provitamina A (Krinsky et al., 2003).
La importancia del resto de funciones fisiológicas (actividades antioxidantes y no
antioxidantes) demanda un estudio más profundo de las mismas y de la correlación
dosis-efecto, para poder establecer unos valores de ingesta diaria para estos
componentes (Mínguez-Mosquera et al., 2005).
2.2.3.- ESTABILIDAD EN LOS ALIMENTOS
Los carotenoides son pigmentos estables en su ambiente natural, pero cuando los
alimentos se calientan, o cuando son extraídos en disolución en aceites o en disolventes
orgánicos, se vuelven mucho más lábiles. Así, se ha comprobado que los procesos de
oxidación son más acusados cuando se pierde la integridad celular, de forma que en
alimentos vegetales triturados, la pérdida de compartimentación celular pone en contacto
sustancias que pueden modificar estructuralmente, e incluso destruir los pigmentos. No
todos los tipos de cocinado afectan en la misma medida a los carotenoides, de forma que
la pérdida de estos pigmentos aumenta en el siguiente orden: cocinado con microondas <
cocinado al vapor < hervido < salteado.
Los carotenoides, excepto algunas excepciones, son insolubles en agua y por lo
tanto las pérdidas por lixiviación durante el lavado y procesamiento de frutos son
mínimas. Otros tratamientos empleados en las industrias alimentarias, como, por
ejemplo, el tratamiento a alta presión, parecen no afectar significativamente a los niveles
de carotenoides en diversos productos vegetales. El escaldado industrial de los alimentos
puede producir pérdidas de carotenoides, si bien la inactivación enzimática que produce
previene pérdidas posteriores durante el procesado y almacenamiento. En cambio, la
congelación, la adición de antioxidantes y la exclusión del oxígeno (e.g. vacío, envases
impermeables al oxígeno, atmósfera inerte) disminuyen las pérdidas durante el
procesado y almacenamiento de los alimentos (Rodríguez-Amaya, 1997).
La destrucción de estos pigmentos reduce el valor nutritivo de los alimentos e
induce una decoloración y una pérdida de sus características organolépticas. El grado de
Tesis Doctoral
33
2.- Antecedentes
decoloración va a depender fundamentalmente de la presencia de agentes oxidantes en
el medio (sobre todo oxígeno molecular) y de que se comunique energía suficiente para
que la reacción de degradación tenga lugar. La energía se aporta en forma de luz o calor.
La reacción de decoloración supone la pérdida de conjugación de la molécula y, en
principio, no tiene por qué implicar la rotura del esqueleto hidrocarbonado, por lo que
cualquier factor capaz de interrumpir la deslocalización electrónica existente, podría
producir pérdida de color. Si las condiciones oxidantes son débiles y la energía
suministrada no es suficiente, se vuelve a restaurar el orbital molecular con la posibilidad
de que la estructura adopte la configuración cis o trans, en función de que haya habido
rotación en el enlace. Si las condiciones son muy severas, el grado de degradación
progresa, fragmentándose entonces el pigmento (Mínguez-Mosquera, 1997).
En resumen, puede decirse que los factores que influyen en la degradación de
carotenoides en sistemas modelo son varios: estructura del carotenoide, exposición a la
luz, actividad del agua, temperatura, presencia de oxidantes o antioxidantes, presencia
de sulfitos, etc. Estos estudios de estabilidad, son aún más complejos en alimentos,
debido a sus diferencias estructurales y de composición, diferentes tipos de procesados
industriales, etc. (Meléndez-Martínez et al, 2004b).
2.2.4.- DEGENERACIÓN MACULAR ASOCIADA A LA EDAD
Es muy importante mantener la integridad del área macular retiniana. La mácula
es una zona de la retina de unos 5 mm de diámetro, en cuyo centro se encuentra la
fóvea. La mácula está especializada en la visión de los detalles finos y, por ejemplo, nos
permite leer o distinguir las caras de las personas. La alta concentración de
fotorreceptores en esta área requiere un aporte vascular exquisito para mantener una
función correcta. Esta circunstancia la hace más susceptible a alteraciones patológicas. A
veces los deterioros de la mácula pueden predecirse y así evitar pérdidas de visión
central.
La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es la causa número uno de
ceguera en los EE.UU. en personas de más de 60 años. El estudio de Framingham indica
que la DMAE afecta hasta a un 7% de la población de la tercera edad (Leibowitz et al.,
1980). En España, el porcentaje de personas que sufren esta enfermedad en mayores de
65 años es del 13%, y entre los mayores de 75 años, el 30 % está afectado en alguna
proporción (http://www.icoftalmologia.es/es/enfermedades-de-los-ojos/dmae). Existen dos
formas diferenciadas de DMAE: la forma seca o atrófica y la forma húmeda o exudativa.
Tesis Doctoral
34
2.- Antecedentes
La DMAE seca es la más común (90% de los casos) y su progresión es lenta (años),
mientras que la DMAE húmeda es muy agresiva y puede conducir a la pérdida de la
visión central en poco tiempo (semanas o meses). Los pacientes con la forma seca
pueden pasar a la húmeda y viceversa. Los pacientes en los que se observan drusas
(acumulaciones de material extracelular de color amarillento) en la mácula son más
propensos a la DMAE, independientemente de que sea de tipo seca o húmeda.
La DMAE seca consiste en una desorganización granular del epitelio pigmentario
con hiperplasia de éste en el área macular y formación de drusas. Así, se degeneran las
capas más externas de la retina. La pérdida de visión es variable según el grado. La
visión del color se ve afectada, así como también la adaptación a la luz. Es bilateral,
aunque no simétrica. Rara vez, sin embargo, la pérdida de visión es realmente severa. En
la DMAE de tipo seca, el paciente suele referir pérdida de agudeza visual y
metamorfopsia (desdibujamiento de las líneas rectas). En ella se pueden observar
alteraciones del epitelio pigmentario de la retina en el área macular, con zonas de hipo e
hiperpigmentación, siendo los patrones de presentación impredecibles.
En la DMAE húmeda, el paciente manifiesta disminución de la visión central con
su escotoma correspondiente y metamorfopsia. No tiene un patrón típico de aparición,
pero se puede producir desde un edema macular hasta una hemorragia en dicha zona. El
manejo clínico consiste en evitar la exudación si se puede aplicando láser sobre la
membrana neovascular antes de que ésta se rompa.
2.2.5.- LA LUTEÍNA COMO AGENTE ANTIOXIDANTE Y PREVENTIVO
La luteína es un pigmento carotenoideo liposoluble del grupo de las xantófilas que
presenta la fórmula C40H56O2 (Figura 2.3). La luteína presenta dos grupos hidroxilo,
aunque en las plantas superiores se encuentra generalmente en forma esterificada
formando mono o diésteres. El sistema de dobles enlaces conjugados que contiene esta
molécula le confiere su color y el carácter antioxidante. La luteína es un potente
antioxidante que se encuentra presente en el cuerpo humano (Zhang et al., 1991;
Palozza y Krinsky, 1992). La luteína está muy relacionada con otros carotenoides como el
β-caroteno, zeaxantina o astaxantina, con los que comparte numerosas propiedades
químicas, incluida la capacidad antioxidante. De cualquier forma, las diferencias
estructurales de los distintos carotenoides les otorgan un diferente potencial antioxidante
en humanos (Simic, 1992).
Tesis Doctoral
35
2.- Antecedentes
Figura 2.3
Estructura química de la luteína.
Según numerosos estudios epidemiológicos, un consumo apropiado de luteína en
la dieta disminuye el riesgo de contraer enfermedades asociadas con la formación de
radicales libres (Granado et al., 2009, 2010). Así, la luteína es capaz de proteger a las
células, y prevenir o finalizar las reacciones en cadena originadas por los radicales libres.
La luteína es acumulada principalmente junto con la zeaxantina en la zona de la retina
humana denominada mácula o mácula lútea. Esta zona es rica en ácidos grasos
poliinsaturados que son atacados por los radicales libres y sufren un proceso de
oxidación que se ve atenuado por la presencia de luteína. De este modo, la luteína
funciona como un filtro de los rayos ultravioleta del sol y como antioxidante que atrapa
radicales libres y especies de oxígeno reactivo (Silva, 2004).
La luteína es el único carotenoide detectado en la retina y en el cristalino
humanos, y a su vez constituye el principal pigmento macular. Tiene un papel protector
de las células del epitelio retiniano y de los fotorreceptores frente a la agresión oxidativa
producida por la exposición a la luz azul y el intenso metabolismo celular. Todos los
estudios hasta la fecha coinciden en que la luteína reduce el riesgo de padecer DMAE, y
puede mejorar la función visual en los pacientes de esta enfermedad.
La luteína es, junto con la zeaxantina, uno de los carotenoides más importantes
para los humanos, siendo detectada en el plasma humano y en la leche materna y más
significativamente en la mácula de la retina humana donde juega un importante papel en
la protección de la misma. Estudios clínicos han revelado los beneficios que supone la
ingesta adecuada de luteína en la protección contra la aparición y/o progresión de
enfermedades de elevada incidencia en países desarrollados, como son cáncer (Astorg,
1997; Demming-Adams y Adams III, 2002; Heber y Lu, 2002), enfermedad cardiovascular
(Dwyer et al., 2001), cataratas y degeneración macular senil (Olmedilla et al., 2001; Shi et
al., 2002; Mares-Perlman et al., 2002; Granado et al., 2003; Krinsky et al., 2003). Este
tipo de enfermedades tienen que ver con el déficit de luteína en el organismo y la
correspondiente pérdida de protección antioxidante (Kijilstra et al., 2012).
Tesis Doctoral
36
2.- Antecedentes
En particular, la degeneración macular senil o degeneración macular asociada a la
edad (DMAE) es la primera causa de pérdida de visión, que puede culminar en ceguera
en personas de edad superior a 50 años, siendo una enfermedad degenerativa que
afecta a la mácula lútea, responsable de la visión central directa. La Imagen 2.6 muestra
el deterioro progresivo de la mácula lútea en personas afectadas por esta enfermedad y
los efectos sobre la visión que esto produce.
Los beneficios de la utilización de luteína se han constatado especialmente en el
caso de la degeneración macular senil, trastorno de la visión central caracterizado por la
pérdida de la agudeza visual como consecuencia de la degeneración que se produce en
la mácula o parte central de la retina. Se ha demostrado que el consumo de una dieta rica
en luteína reduce el riesgo de sufrir degeneración macular senil y otras dolencias
asociadas a la edad (Dwyer et al., 2001; Schünemann et al., 2002). Aunque el
mecanismo de la acción protectora que desempeña este pigmento no es totalmente
conocido, se le atribuye la capacidad de filtrar la luz azul o de neutralizar los radicales
libres que genera esta radiación, etc.
Imagen 2.6
Cambios que provoca la degeneración macular senil (DMAE) en la retina (parte superior de la
imagen) y sus correspondientes consecuencias en la visión humana (parte inferior de la imagen).
Tesis Doctoral
37
2.- Antecedentes
Imagen 2.7
Algunos productos comerciales basados en luteína.
Aunque la luteína se encuentra ampliamente distribuida en alimentos como frutas,
verduras y yema de huevo, la ingesta de este pigmento se encuentra en torno a 1,5 mg
por día en países como Canadá, cifra que podría considerarse representativa para una
población occidental media (Jonson-Down et al., 2002). Siguiendo recomendaciones
dietarias como elevación del consumo de alimentos ricos en luteína, particularmente
frutas y verduras, es posible conseguir una ingesta de luteína próxima a los 3 mg por día,
si bien el mantenimiento de estos niveles requiere una disciplina difícil de seguir. Para la
prevención de las enfermedades degenerativas mencionadas previamente, la ingesta
recomendada de luteína es de 6 mg por día, lo cual es difícil de alcanzar por
modificaciones en la dieta (Krinsky et al., 2003; Silva, 2004). Por tanto, especialmente en
grupos de riesgo, no es suficiente con el seguimiento de una dieta rica en luteína y se
deben de administrar suplementos que aumenten la cantidad de este carotenoide
(Imagen 2.7).
Lo expuesto anteriormente pone de manifiesto el interés y los potenciales
beneficios de disponer de fuentes de luteína para su aportación como suplemento en los
casos mencionados. Concretamente, una de las vías más interesantes de cara a
desarrollar una estrategia preventiva de la DMAE es una adecuada ingestión de luteína
en la dieta.
Otras aplicaciones de la luteína
Otro de los usos actuales más extendidos de la luteína es como colorante natural
en alimentación humana, en productos tales como mantequilla, margarina, quesos,
bebidas refrescantes y pasta. Además, al igual que otros carotenoides, se añade a
piensos de acuicultura para incrementar la coloración de los salmónidos, y de otros tipos
Tesis Doctoral
38
2.- Antecedentes
de peces y mariscos. También se usa ampliamente en la alimentación avícola para
mejorar la pigmentación tanto de la piel, como de la carne y de las yemas de huevos
(Alam et al., 1968; Livingston, 1986).
Las ventas de luteína como aditivo de piensos en EE.UU. superaron los 150
millones de dólares en 1994 (Johnson y Schroeder, 1995). El hecho de que los ésteres
de luteína sean más solubles en aceites vegetales que los carotenoides sintéticos es un
factor favorable para el uso de este compuesto como colorante alimenticio (Philip y Berry,
1975). Por otro lado, la luteína también es usada en la industria cosmética, aumentando
de este modo su valor comercial.
2.2.6.- FUENTES PARA LA OBTENCIÓN DE LUTEÍNA Y OTROS ANTIOXIDANTES
La luteína se encuentra ampliamente presente en plantas superiores.
Generalmente, este pigmento es producido por verduras y hortalizas de color verde
oscuro, como coles de Bruselas, guisantes, espinacas, lechuga o judías, considerándose
éstas como las principales fuentes de luteína que pueden aportarse en la dieta. Además,
la luteína presenta la ventaja de que se encuentra más disponible en los alimentos que
otros carotenoides como el β-caroteno (Shoefs et al., 2002).
La fuente comercial más importante de producción de luteína pura son los pétalos
de la flor de Marigold o caléndula (Tagetes erecta) (Imagen 2.8). Esta planta, también
denominada “clavelón de la India”, es de las fuentes naturales más ricas en xantófilas,
principalmente luteína (Navarrete-Bolaños et al., 2005). Se han referenciado contenidos
de luteína en los pétalos de Marigold de hasta 5.000 ppm como mezcla de ésteres,
generalmente en forma de mono o diésteres de los ácidos palmítico o mirístico, lo que
corresponde a unas 2.500 ppm de luteína pura (Piccaglia et al., 1998). Además, junto a
este carotenoide aparece la zeaxantina, representando ambos pigmentos un 88-92 % del
total de xantófilas en Marigold, siendo la luteína el componente mayoritario (Delgado-
Vargas et al., 1997).
Tesis Doctoral
39
2.- Antecedentes
Imagen 2.8
Flor de Marigold o caléndula (Tagetes erecta).
De la flor de caléndula se extrae gran parte de la luteína comercializada
actualmente, siendo esta la mayor fuente de este pigmento, que se comercializa
generalmente como oleorresina (Imagen 2.7). El extracto saponificado de este pigmento
es utilizado ampliamente como aditivo en complementos dietéticos, en la industria
farmacéutica, o como suplemento en piensos para mejorar la pigmentación de la piel de
aves de corral y la coloración de los huevos. Sin embargo, el contenido de luteína en
Marigold varía entre cosechas, estimándose el contenido medio de las flores de Marigold
(botones y pétalos tal como se cosechan) en 300 ppm. En cuanto a la productividad, con
Marigold se puede llegar a obtener un máximo 22 Kg/(Ha·año) de luteína, considerando
la realización de cuatro cosechas anuales en las mejores condiciones de cultivo (Bosma
et al., 2003). Esta variabilidad, que dificulta los procesos industriales, así como la baja
producción por unidad de superficie, hace que resulte interesante buscar fuentes
alternativas de luteína.
En este sentido, algunas microalgas han sido referenciadas como potencialmente
útiles para la producción de luteína por su elevado contenido en este compuesto. Entre
ellas cabe citar, por ejemplo, Muriellopsis sp., Chlorella zofigiensis, Chlorella
protothecoides, y Scenedesmus almeriensis (Del Campo et al., 2000, 2001; Shi et al.,
2002; Sánchez et al., 2008a). Los contenidos en luteína en estas microalgas varían en
función de las condiciones de cultivo (Tabla 2.7). En muchos casos, la producción de
luteína está ligada a la irradiancia que el cultivo recibe, de modo que la acumulación de
este pigmento puede incrementarse al aumentar la irradiancia. Esto está relacionado con
el papel fotoprotector que ejercen las xantófilas (Niyogi et al., 1997). Así pues, cuando
microalgas productoras de luteína como Muriellopsis sp., Chlorella zofigiensis o
Scenedesmus son expuestas a una irradiancia mayor, dentro de unos límites que no
resulten dañinos para el aparato fotosintético celular, se produce un incremento en la
Tesis Doctoral
40
2.- Antecedentes
acumulación de este pigmento (Senger et al., 1993; Del Campo et al., 2000, 2001;
Sánchez et al., 2008b).
Tabla 2.7
Contenido en luteína de algunas microalgas a nivel de laboratorio y escala semi-industrial
(Molina et al., 1994; Del Campo et al., 2000, 2001; Shi et al., 2002).
Microalga Luteína (mg·g-1) Condiciones y productividad de luteína
Chorella zofigiensis 3,42 Escala de laboratorio
Fotobiorreactor tubular externo
Muriellopsis zp. 4,30
(50 L): 170 mg·m-2·día-1
Cultivo heterotrófico, escala de
Chlorella protothecoides 5,35
laboratorio: 49 mg·L-1·día-1
Fotobiorreactor tubular externo
Scenedesmus almeriensis 11
(3000 L): 387 mg·m-2·día-1
Aunque la luteína puede actuar como protección del aparato fotosintético celular,
frente al daño causado por el exceso de irradiancia u otros tipos de estrés (Demming-
Adams y Adams III, 2002), en las microalgas consideradas como potenciales productoras
de luteína, la concentración de biomasa sigue siempre una tendencia paralela a la
acumulación de luteína, y por tanto es considerada un metabolito primario, asociado al
crecimiento. Por tanto, la máxima productividad de luteína se alcanza para las
condiciones que optimizan la productividad de biomasa de la especie considerada. En
este sentido, con Scenedesmus almeriensis se han referenciado productividades de
luteína de hasta 1.400 Kg/(Ha·año) empleando un fotobiorreactor tubular de 3.000 L
(Sánchez et al., 2008a), muy superiores a los 22 Kg/(Ha·año) obtenidos a partir de
Marigold (Bosma et al., 2003).
Dado su papel esencial en el metabolismo vegetal y concretamente en la
estructura y función del aparato fotosintético, la luteína se encuentra muy presente en
plantas superiores como se ha mencionado anteriormente, contándose frutas y verduras
entre sus fuentes principales para consumo humano, y siendo especialmente ricas las de
hoja verde. Sin embargo, ninguna de estas fuentes es suficiente para complementar la
ingesta habitual de la población hasta la dosis de luteína recomendada para la
prevención de enfermedades degenerativas (6 mg/día). Para esto, habitualmente se
recurre al uso de extractos enriquecidos con luteína que, en su mayoría, proceden de
flores de caléndula (Imagen 2.8) y sirven para suplementar dietas de los grupos de
riesgo.
Tesis Doctoral
41
2.- Antecedentes
A pesar de la abundante presencia de la luteína en plantas superiores y algunos
productos que se usan para la alimentación animal (harina de alfalfa, gluten de maíz y
flores de caléndula), la reducida concentración de luteína en estas materias primas hace
que se estén buscando otras fuentes en las que el pigmento se encuentre en mayores
concentraciones. Así, se están realizando esfuerzos considerables para hacer posible la
producción comercial de este carotenoide a partir de microalgas (Del Campo et al., 2001;
García-González et al., 2005). La biomasa de microalgas es una fuente ventajosa de
luteína debido a su elevado contenido en este pigmento con respecto a las fuentes
tradicionales anteriormente mencionadas, y a que aparece como molécula libre en lugar
de la mezcla de ésteres que habitualmente se encuentra en los extractos comerciales
procedentes de fuentes tradicionales.
Es importante resaltar en este punto, la existencia de la microalga Scenedesmus
almeriensis, una nueva especie descubierta y patentada por el Departamento de
Ingeniería Química de la Universidad de Almería, que contiene una elevada cantidad de
luteína (hasta 7.000 ppm), constituyendo ésta el carotenoide mayoritario (Tabla 2.8)
(Fernández et al., 2010). Este elevado contenido en luteína, hace que esta microalga sea
una alternativa importante a la obtención de luteína mediante la flor de caléndula.
Tabla 2.8
Composición de la microalga Scenedesmus almeriensis (Fernández et al., 2010).
Pigmento Contenido (mg·g-1)
Violaxantina 0,234
Astaxantina 0,210
Luteína 7,010
Cantaxantina 0,125
Ésteres de astaxantina 0,204
β-caroteno 0,756
2.3.- EL ACEITE DE OLIVA VIRGEN
El aceite de oliva virgen es el mosto oleoso procedente únicamente del fruto del
olivo (Olea Europaea Sátiva), la aceituna. Es un producto totalmente natural, que cuando
es obtenido por sistemas mecánicos adecuados y procede de frutos de buena calidad,
posee excepcionales características organolépticas (olor, color y sabor), siendo el único
entre los aceites vegetales que puede consumirse crudo, conservando íntegro su
Tesis Doctoral
42
2.- Antecedentes
contenido en vitaminas, ácidos grasos esenciales y otros productos naturales de gran
importancia dietética. El aceite de oliva virgen es obtenido únicamente por
procedimientos mecánicos o por medios físicos, como son el lavado, la decantación, la
centrifugación y el filtrado.
Los aceites de oliva vírgenes se clasifican en dos tipos (Reglamento Nº 61/2011
Diario Oficial de la Unión Europea de la Comisión de 24 de Enero 2011).
- Aceite de oliva virgen extra: aceite de oliva virgen cuya acidez libre, expresada
en contenido de ácido oleico, es como máximo 0,8 g por cada 100 g (<0.8°), y
en cuanto a sus características organolépticas la mediana de los defectos es
igual a 0 y la del atributo "frutado" es superior a 0.
- Aceite de oliva virgen: aceite de oliva virgen cuya acidez libre, expresada en
contenido de ácido oleico, es como máximo de 2 g por cada 100 g (<2°), y en
relación a las características organolépticas la mediana de los defectos es
superior a 0 e inferior o igual a 2,5 y la del atributo "frutado" es superior a 0.
El consumo de aceite de oliva virgen se ha relacionado con un perfil lipídico de
menor riesgo de padecer enfermedades coronarias (Gimeno, 2004; Perona et al., 2004) y
con un menor riesgo de desarrollar algunas neoplasias malignas (Lipworth et al., 1997;
Trichopoulou y Lagiou, 1997; Owen et al., 2000). Un número creciente de estudios apunta
al papel crucial que desempeña el aceite de oliva como integrante básico de la “dieta
mediterránea”, en sus efectos beneficiosos sobre la salud humana
(http://www.predimed.es/). Por ejemplo, se ha demostrado que el aceite de oliva reduce el
colesterol total en plasma, gracias a su composición de ácidos grasos. También
disminuye la fracción de colesterol transportada por las lipoproteínas de baja densidad
(LDL), mientras que incrementa la fracción transportada por las lipoproteínas de alta
densidad (HDL). Por otra parte, la incidencia de enfermedades cardiovasculares y
muertes por enfermedades coronarias es menor entre los habitantes de regiones donde
existe hábito de consumo de aceite de oliva (Aparicio y Hardwood, 2003; De Torres,
2013).
Desde el punto de vista bromatológico, se establece que la composición del aceite
de oliva queda dividida en dos tipos de compuestos (Tabla 2.9): la fracción mayoritaria,
también conocida como saponificable que está básicamente constituida por triglicéridos y,
en menor proporción, por diglicéridos, monoglicéridos, ácidos grasos libres, etc.,
Tesis Doctoral
43
2.- Antecedentes
representando el 98-99% del peso total del aceite, y la fracción minoritaria, que supone el
2% restante del peso total, constituida por pigmentos, compuesto volátiles, polifenoles,
tocoferoles, esteroles, etc., éstos constituyentes menores son importantes para la
estabilidad, sabor y aroma del aceite de oliva.
Tabla 2.9
Composición del aceite de oliva virgen. (Mérida y Pérez, 2014).
Fracción Saponificable Fracción Insaponificable
Fosfolípidos
Ceras
Ésteres de esteroles
Hidrocarburos
Triglicéridos
Alcoholes grasos
Monoglicéridos
Esteroles
Diglicéridos
Tocoferoles
Ácidos grasos libres
Dialcoholes triterpénicos
Pigmentos
Compuestos fenólicos
Compuestos volátiles y aromáticos
2.3.1.- ANTIOXIDANTES PRESENTES EN EL ACEITE DE OLIVA VIRGEN
Los principales antioxidantes del aceite de oliva virgen son los compuestos
fenólicos, incluyendo los fenoles lipofílicos e hidrofílicos. Se puede afirmar que el aceite
de oliva virgen puede ser diferenciado de otros aceites vegetales por su particular
composición en compuestos fenólicos (Boskou, 1996; Capella et al., 1997; Servili y
Montedoro, 2002).
Los pigmentos, presentes en el aceite de oliva virgen, también tienen propiedades
antioxidantes. Se ha descrito la doble capacidad, antioxidante en la oscuridad y pro-
oxidante en presencia de luz, de las clorofilas (Endo et al., 1984; Fakourelis et al., 1987;
Gutiérrez et al., 1992). Los carotenoides también presentan un importante papel como
antioxidantes en el aceite de oliva virgen (Fakourelis et al., 1987; Kiritsakis y Osman,
1995).
Tesis Doctoral
44
2.- Antecedentes
2.3.1.1.- Compuestos Fenólicos
Los fenoles hidrofílicos del aceite de oliva virgen constituyen un grupo de
compuestos, metabolitos secundarios de las plantas, que presentan importantes
propiedades organolépticas y para la salud. La concentración de estos compuestos en el
mesocarpio de las aceitunas puede suponer el 1-3 % del peso de la pulpa fresca. Se trata
de compuestos de carácter polar que pasan al aceite en pequeñas cantidades en el
proceso de extracción como consecuencia del equilibrio físico-químico entre dos fases
inmiscibles: agua y aceite. Estos compuestos reciben el nombre de polifenoles,
tratándose de un término convencional ya que no todos ellos son polihidroxi-derivados.
El contenido total en polifenoles en el aceite de oliva virgen oscila entre 50 y 500
mg/kg de ácido cafeico (Gutiérrez et al., 1977), si bien se han descrito aceites con un
contenido superior a los 1.000 mg/kg (Uceda et al., 2004; Servili et al., 2009). Los
compuestos fenólicos le confieren al aceite de oliva virgen determinadas propiedades a
nivel químico, organoléptico y de la salud (De Torres, 2013).
A nivel químico, el efecto antioxidante de estos compuestos ha quedado
demostrado en muchos trabajos. Tienen especial interés los orto-difenoles,
principalmente la oleuropeina y el hidroxitirosol. La actividad antioxidante del hidroxitirosol
se debe tanto a un efecto quelante de iones de metales como a un efecto secuestrador
de radicales libres, habiendo demostrado tener una capacidad antioxidante igual o
superior a la de otros antioxidantes como las vitaminas E y C (Visioli y Galli, 1998).
En cuanto a la implicación de los compuestos fenólicos en las propiedades
sensoriales del aceite de oliva virgen, en la bibliografía se informa de que estos
compuestos son responsables de los atributos positivos: amargo, picante y astringente
(Andrewes et al., 2003). El amargor, atributo sensorial positivo (COI, 1987), es función del
contenido en polifenoles totales (Gutiérrez et al., 1977; Beltrán et al., 2005). El amargor
de los aceites puede ser cuantificado químicamente mediante la medida del K225
(Gutiérrez et al., 1992), pues este parámetro está relacionado con la evaluación sensorial
del amargo (COI, 1987).
Tesis Doctoral
45
2.- Antecedentes
2.3.1.2.- Tocoferoles
Los tocoferoles son los compuestos responsables de la actividad desarrollada por
la vitamina E. El término general vitamina E se utiliza para designar a un grupo de ocho
especies naturales de tocoferoles (α, β, γ, y δ) y tocotrienoles. Junto con las vitaminas A,
D y K constituyen el grupo de las vitaminas liposolubles, caracterizadas por ser derivados
del núcleo isoprenoide, solubles en lípidos y en disolventes orgánicos. Son compuestos
esenciales, puesto que el organismo no puede sintetizarlos, por lo que su aporte se
realiza a través de la dieta en pequeñas cantidades, siendo los aceites vegetales una de
sus principales fuentes (Sayago et al., 2007).
La vitamina E es sintetizada de forma exclusiva por las plantas. Se encuentra
principalmente en los aceites vegetales (soja, maíz, algodón y girasol), semillas, plantas y
en el tejido adiposo de los animales. Se localiza principalmente en las hojas y partes
verdes de las plantas, que contienen más α-tocoferol que las partes amarillas, mientras
que el γ-tocoferol se encuentra en bajas concentraciones (Gerald y Combs, 1992).
También se encuentran en algunas algas marrones, verdes y rojas, y en algunas
levaduras y hongos, pero no en las bacterias (Codoceo y Muñoz, 1999). Los tocotrienoles
no se encuentran en las plantas verdes, pero sí en el salvado y el germen de ciertas
semillas y cereales (De Torres, 2013).
Los tocoferoles existen solo en forma de fenoles libres, mientras que los
tocotrienoles pueden presentarse en la naturaleza en forma esterificada (Aguilera, 2006).
En el aceite de oliva virgen se ha descrito la presencia de α, β, y γ-tocoferol. El α-
tocoferol es el mayoritario, alcanzando valores superiores al 95 % del total. También se
ha descrito la presencia de tocotrienoles en algunas variedades de aceite (Agramont et
al., 1986), si bien este hallazgo no ha sido corroborado en posteriores trabajos. El
contenido medio en tocoferoles en el aceite de oliva virgen oscila entre 50 y 300 mg/kg
(Boskou, 1996). En cuanto a la función de la vitamina E en el organismo humano, una de
las teorías más aceptada indica que actúa de forma coordinada con otras moléculas y
enzimas para la defensa de las células (especialmente glóbulos rojos, células musculares
y células nerviosas) frente a los efectos nocivos producidos por los radicales libres,
considerándose actualmente como un importante antioxidante que aporta sustancias
beneficiosas al organismo. Así, la actividad antioxidante de la vitamina E radica en su
capacidad de protección de las membranas celulares, acción que realiza impidiendo la
Tesis Doctoral
46
2.- Antecedentes
oxidación de las mismas por los radicales libres. Dicha oxidación llevaría a una
degradación del organismo, especialmente a la aparición de enfermedades cardíacas o
posibles cánceres. Esta vitamina, junto con las vitaminas A y C, conforma el grupo de las
vitaminas antioxidantes (Gerald y Combs, 1992). La vitamina E tiene muchos más efectos
de los que su descubridor hubiera podido imaginar. Como antioxidante, defiende las
células reduciendo el estrés oxidativo, estimula el sistema inmunológico y frena el
desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. Así mismo, ayuda a reducir los niveles de
colesterol (Packer y Obermüller-Jevic, 2002). Sin embargo, su utilidad en la prevención
de trombos en las arterias es aún discutible (Stanley, 2005).
2.3.1.3.- Pigmentos
El aceite de oliva virgen tiene un color que va desde el verde-amarillo hasta el
dorado, dependiendo de la variedad y del estado de madurez del fruto, que está
relacionado con la presencia de diversas cantidades de ciertos pigmentos. La
composición y el contenido total de pigmentos, presentes de forma natural en el aceite de
oliva virgen, son importantes parámetros para la determinación de su calidad. Los
pigmentos también están involucrados en mecanismos de auto-oxidación y foto-
oxidación. Los pigmentos presentes en el aceite de oliva se agrupan en dos clases:
clorofilas y feofitinas, y carotenoides (Carrasco, 2006).
Clorofilas y feofitinas
Las clorofilas son los pigmentos responsables del color verde de los aceites de
oliva vírgenes. Su estructura consiste básicamente en cuatro anillos pirrólicos sustituidos,
uno de los cuales está reducido, que están coordinados con un ión Mg2+ para formar un
complejo planar muy estable. En medio ácido se produce la sustitución del magnesio por
hidrógeno dando lugar a las feofitinas. Este proceso se produce siempre que se rompe la
integridad celular, lo que ocurre cuando los productos vegetales son sometidos a golpes,
rotura, trituración y calentamiento. En el aceite de oliva, como consecuencia del proceso
de elaboración, se pueden encontrar clorofilas y feofitinas "a" y "b", la diferencia entre
ambas es que la "a" tiene un grupo metilo en el carbono número 3 mientras que la "b"
posee un grupo formilo (Ranalli, 1992a). Su contenido en los aceites de oliva vírgenes
varía entre 1 y 20 mg/kg (De Torres, 2013).
Se ha observado que el aceite de oliva virgen es sensible a la radiación de 320-
700 nm (Vázquez, 1980). Esta sensibilidad es debida a la presencia de clorofilas que
Tesis Doctoral
47
2.- Antecedentes
absorben la luz en esa zona del espectro. Las clorofilas y feofitinas tienen un efecto pro-
oxidante sobre los lípidos en presencia de la luz, mientras que en la oscuridad actúan
como antioxidantes (Interesse et al., 1971). Por ello, el aceite de oliva virgen, que
contiene pigmentos verdes, debe ser protegido de la luz durante su almacenamiento,
para minimizar los efectos de la oxidación (Kiritsakis, 1980). Estos pigmentos facilitan la
formación de oxígeno singlete, lo que provoca la oxidación del aceite en presencia de luz
(Carlsson et al., 1976; Fakourelis et al., 1987; Lee et al., 1988). El oxígeno singlete
reacciona rápidamente con las insaturaciones de los ácidos grasos para dar
hidroperóxidos, que son inestables y se descomponen en radicales libres, iniciándose así
la reacción de auto-oxidación en cadena (Carlsson et al., 1976).
Carotenoides
Los carotenoides son moléculas liposolubles isoprenoides, presentes en todos los
organismos fotosintéticos, cuyo color va del amarillo al rojo. La estructura básica de los
carotenoides es un tetraterpeno de 40 carbonos, simétrico y lineal, formado a partir de
ocho unidades isoprenoides de 5 carbonos. Este esqueleto básico puede modificarse de
varias formas, como por ejemplo, por hidrogenación, deshidrogenación, ciclación,
migración del doble enlace, acortamiento o extensión de la cadena, reordenamiento,
isomerización, introducción de funciones oxigenadas, o por combinaciones de estos
procesos, dando como resultado una gran diversidad de estructuras. Los carotenoides se
dividen según su naturaleza química en dos grupos, carotenos y xantófilas. Los carotenos
no presentan sustituciones en la cadena hidrocarbonada mientras que las xantófilas son
derivados oxigenados, que contienen uno o más grupos funcionales (hidroxilo, carbonilo,
alcoxi, carboxilo, etc.).
Como ya se ha mencionado en la sección 2.2, los carotenoides presentan
importantes propiedades como colorantes, antioxidantes, favorecedores del bronceado, en
el tratamiento de enfermedades de la piel y oftalmológicas, e incluso como agentes de
prevención de ciertos tipos de cáncer (VERIS, 1997; Demming-Adams y Adams III, 2002).
Sólo las plantas, las algas, y algunos hongos y bacterias sintetizan de forma natural los
carotenoides, y por tanto los mamíferos necesitan ingerirlos a través de la dieta. Los
carotenoides son de los pigmentos más ampliamente reconocidos debido a sus relevantes
aplicaciones, de forma que un elevado número de ellos han encontrado aplicación
comercial; entre estos se incluyen el β-caroteno, licopeno, astaxantina, cantaxantina y la
luteína.
Tesis Doctoral
48
2.- Antecedentes
En los aceites de oliva, los carotenoides se encuentran presentes en un intervalo
comprendido entre los 5-100 mg/kg y dependiendo de la naturaleza del aceite se ha
encontrado luteína en concentraciones que varían desde 2-8 mg/kg (Cichelli y Pertesana,
2004).
2.3.2.- IMPORTANCIA DE LA DIETA MEDITERRÁNEA
El término "dieta mediterránea" hace referencia a los patrones alimentarios propios
de los países mediterráneos (especialmente España, Portugal, Francia, Italia, Grecia y
Malta). Aunque existen distintas variantes de la dieta mediterránea, se puede hablar de
unos ciertos componentes comunes. El principal aporte de grasa está constituido por el
aceite de oliva, rico en grasas monoinsaturadas; un alto consumo de vegetales, legumbres,
cereales, frutos frescos y secos; un moderado consumo de pescado, carne de ave, leche, y
productos derivados de la leche; y, por último, un bajo consumo de carne roja (Renaud et
al., 1995; Trichopoulou y Lagiou, 1997) y un consumo moderado de vino (Renaud y De
Lorgeril., 1992).
Existen evidencias científicas de que la dieta mediterránea clásica tiene un efecto
protector en los procesos asociados con la lesión oxidativa (Renaud et al., 1995), lo que se
atribuye a su alto contenido en compuestos con propiedades biológicas antioxidantes y al
elevado contenido en ácidos monoinsaturados (Fitó, 2003).
Así, por ejemplo, se ha comprobado (López-Miranda et al., 2000) que la dieta
mediterránea mejora la resistencia a la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad
(LDL). Los primeros ácidos grasos en peroxidarse son los ácidos grasos poliinsaturados de
las LDL (Esterbauer et al., 1987). Este proceso es inhibido por antioxidantes como la
vitamina E, encargados de la captación y neutralización de los radicales libres presentes en
las partículas de LDL (Bays y Dujovne, 1993). Los antioxidantes polifenólicos, presentes en
el aceite de oliva virgen, contribuyen notablemente en la susceptibilidad de las LDL a la
oxidación (Gutfinger, 1981).
Por otra parte, varios estudios indican que una dieta rica en grasas
monoinsaturadas puede mejorar el perfil lipídico (Grundy et al., 1988; Mensink y Katan,
1992), fenómeno que conlleva una menor incidencia de padecer enfermedades
cardiovasculares en el área mediterránea, como consecuencia de una dieta basada
fundamentalmente en el consumo de aceite de oliva (De Torres, 2013).
Tesis Doctoral
49
2.- Antecedentes
2.3.3.- PARÁMETROS DE CALIDAD DE LOS ACEITES DE OLIVA
Un concepto de calidad muy aceptado es el que la define como “conjunto de las
propiedades y características que proporcionan al producto la capacidad de satisfacer
exigencias explícitas (requisitos organolépticos y requisitos técnico-comerciales) o
intrínsecas (requisitos nutricionales y requisitos de seguridad)” (Mirandola et al., 1989;
Galoppini y Fiorentini, 1991; Diniosi et al., 1992).
En general, se entiende también por calidad la conformidad entre las normas,
indispensables o declaradas, y las características de un producto. En el uso corriente del
término en muchos idiomas, la palabra calidad lleva implícito un concepto positivo que,
sin adscribirse a una característica concreta, tiende a sintetizar un juicio resultante de una
suma de valores de peso y características diferentes en relación con la naturaleza del
producto mismo (Fiorino, 1996).
El primer inconveniente al valorar la calidad de un determinado producto es
establecer de una manera clara las cualidades que se buscan en el mismo, lo que a su
vez estará en función del uso que se le vaya a dar. De esta forma, y concretamente para
el aceite de oliva, se puede hablar de calidad desde diferentes puntos de vista: calidad
reglamentada, nutricional, comercial, etc.
Se puede considerar que el color, el sabor y el aroma son los principales
parámetros relacionados con la calidad del aceite de oliva. Los mencionados atributos
suelen estar relacionados con la presencia de algunos de los compuestos que se
encuentran en el aceite. Se analizará a continuación, un poco más en profundidad, cada
uno de ellos.
Dentro de la evaluación sensorial, el color es un criterio básico. No existe una
relación clara entre los principales parámetros de los aceites de oliva recomendados por el
Comité Oleícola Internacional (e.g. acidez, índice de peróxidos, coeficientes de extinción en
el ultravioleta, valoración organoléptica) y el color del aceite de oliva, lo que plantea la
necesidad de la medida del color de los aceites, sobre todo en cuanto a preferencia del
consumidor, para llegar a tener una completa caracterización y valoración del aceite (Pérez
et al., 2003; Melgosa et al., 2009).
Las características cromáticas del aceite de oliva pueden variar dependiendo del
método empleado para la obtención del mismo, es decir, dependen del sistema de
Tesis Doctoral
50
2.- Antecedentes
molienda y batido de la pasta de la aceituna. En general, podemos decir que el color de los
aceites de oliva vírgenes se encuentra entre un amarillo no muy intenso y un verde más o
menos intenso, dependiendo del contenido relativo de los principales pigmentos (clorofilas
y carotenoides) que se encuentran de manera natural en el fruto.
Las clorofilas dan al aceite su color amarillo-verdoso, mientras que los carotenos le
confieren un color entre amarillo y rojo (Mínguez-Mosquera et al., 1991). Es interesante
resaltar, que los pigmentos también están involucrados en mecanismos de auto-oxidación
y foto-oxidación. El nivel de estos pigmentos está relacionado con factores genéticos,
grado de maduración de las aceitunas y condiciones físicas durante la extracción del
aceite.
Como se ha mencionado anteriormente, los métodos sensoriales oficiales para la
evaluación de la calidad del aceite de oliva no requieren la determinación del color; éste se
evalúa por medio de métodos instrumentales y se expresa como valores de absorción a
longitudes de onda características, o como la medida de sus tres atributos característicos
(tono, pureza y luminosidad), o mediante el uso de escalas de referencia específicas como
son las escalas ABT (Gutiérrez y Gutiérrez, 1986), UOCS (Melgosa et al., 2004) y MUOCS
(Salmerón et al., 2012).
El gusto es la sensación percibida cuando las papilas gustativas son estimuladas
por algunas sustancias solubles. Los cuatros sabores básicos característicos son dulce,
salado, ácido y amargo.
El aroma que emana de un aceite de oliva virgen es realmente la suma de
sensaciones percibidas cuando varios compuestos químicos alcanzan y estimulan los
receptores del olor localizados en las neuronas del epitelio olfativo (Carrasco et al., 2010).
Calidad sensorial del aceite de oliva
La caracterización de un alimento es un proceso largo y complejo que normalmente
involucra a varias disciplinas científicas. El análisis sensorial debería ser una de ellas y,
concretamente, la obtención del perfil descriptivo o “huella sensorial” del producto debería
representar una parte fundamental de esa caracterización. En general, cualquier proceso
sensorial descriptivo de un alimento debería seguir una serie de etapas que garanticen su
objetividad y validez. La calidad sensorial de un alimento indica su nivel de aceptación y
apetencia, y generalmente se determina por un conjunto de características evaluadas a
Tesis Doctoral
51
2.- Antecedentes
través de los órganos sensoriales. Así, el análisis sensorial se fundamenta en la capacidad
de los sentidos para reaccionar ante estímulos químicos, físicos y físico-químicos. El
sistema nervioso periférico permite la interconexión entre el entorno y el cerebro, que al
estar dentro del cráneo obviamente no puede interactuar directamente con el mundo
exterior.
Los cinco sentidos permiten evaluar las siguientes propiedades sensoriales:
Apariencia (e.g. grado de traslucidez), color, tamaño y forma mediante la
vista.
Consistencia y características relacionadas (e.g. fluidez, viscosidad, dureza,
fibrosidad, flexibilidad, etc.) mediante el tacto y el oído.
Aroma, mediante el olfato.
Sabor, mediante el gusto.
Flavor, mediante una combinación del olfato, gusto y tacto.
En el caso particular del aceite de oliva, los atributos de calidad que se pueden
detectar a través de los órganos sensoriales no son tan numerosos como en otros
alimentos, ya que algunos, como el tamaño, la forma y las sensaciones de dureza,
fibrosidad, flexibilidad, etc., no son significativas en alimentos líquidos, y otros atributos,
tales como la turbidez y la viscosidad se pueden medir fácilmente con los instrumentos
adecuados. Por lo tanto, sólo el color, el olor, el sabor, junto con sensaciones tales como
aceitoso, fluido, picante, astringente, etc., suelen ser importantes en la evaluación de la
calidad sensorial de los aceites de oliva.
A pesar del progreso que se ha hecho en las últimas décadas en el campo analítico
y el esfuerzo realizado por numerosos grupos de investigación para identificar y cuantificar
los compuestos químicos volátiles y no volátiles responsables del flavor y sus
interrelaciones, hay ciertas cuestiones que no pueden resolverse completamente usando
sólo el análisis instrumental. El análisis sensorial es, por tanto, un medio muy efectivo para
evaluar diferencias cualitativas y cuantitativas en los estímulos sensoriales originados por
los alimentos, y para determinar si estos son del agrado de los consumidores o su nivel de
preferencia (Carrasco et al., 2010).
La evaluación sensorial de los aceites de oliva vírgenes se puede justificar por una
de las 5 razones siguientes (Angerosa, 2003):
Tesis Doctoral
52
2.- Antecedentes
Establecer una calidad básica del producto que verifique la ausencia o
presencia de defectos sensoriales y su intensidad correspondiente.
Determinar la pertenencia de un aceite a una denominación de origen
protegida (DOP).
Poner de manifiesto modificaciones de los perfiles sensoriales en relación
con la variedad, origen geográfico, tecnología y tiempo de vida del producto.
Encontrar características sensoriales críticas en la preferencia de los
consumidores.
Evaluar, en términos sensoriales, las diferencias en preferencia entre
consumidores habituales y potenciales.
2.3.4.- EL COLOR DEL ACEITE DE OLIVA
El color del aceite de oliva es un indicador de su calidad y, aunque su medida no es
requerida por la regulación de la Comunidad Económica Europea (CEE, 1991) en la
determinación oficial de las características del aceite de oliva, tiene un papel importante,
entre otras razones, porque es un parámetro independiente de los mencionados por el
Comité Oleícola Internacional (COI, 1987). Más aún, desde el punto de vista del
consumidor, la especificación precisa del color de los aceites de oliva se hace necesaria
para una completa valoración y caracterización del mismo (CEE, 1991; Martínez et al.,
2010). El color es un primer criterio de juicio sobre la calidad del aceite de oliva, que influye
notablemente sobre las preferencias del consumidor y puede también afectar a las
decisiones de los expertos que trabajan en paneles de cata. Esta influencia sobre la
aceptabilidad del alimento por parte del consumidor ha despertado un gran interés entre
productores y elaboradores, y ha impulsado en los últimos años el desarrollo de técnicas y
aparatos de fácil manejo en la industria e incluso en el campo (Calvo et al., 2001;
Meléndez-Martínez et al., 2005), así como también nuevas líneas de investigación sobre la
relación existente entre coordenadas colorimétricas y contenido en pigmentos (Meléndez-
Martínez et al., 2003; Ruiz et al., 2005).
Para la caracterización de los aceites de oliva, son numerosos los estudios
realizados que utilizan sus componentes químicos mayoritarios, como son los ácidos
grasos (Alonso y Aparicio, 1993), y muy pocos los que utilizan componentes minoritarios
(polifenoles, esteroles, alcoholes triterpénicos y pigmentos).
Tesis Doctoral
53
2.- Antecedentes
Entre los primeros estudios en los que se utiliza el contenido en pigmentos como
variable para la caracterización está el realizado por Gandul-Rojas y Mínguez-Mosquera en
el año 1996b. Actualmente para la caracterización, tipificación y análisis de autenticidad de
aceites italianos y griegos se está utilizando información como la de la fracción clorofílica y
carotenoide, o luteína y β-carotenos, entre otras (Ranalli et al., 2005; Giuffrida et al., 2007).
En esta Tesis se va a obtener el perfil colorimétrico de diferentes AOVE´s
enriquecidos con antioxidantes o carotenoides (luteína y β-caroteno) procedentes de
microalgas, basándonos en los parámetros colorimétricos de tales aceites en el espacio
CIELAB (L*, a*, b*). Desde 1976 la Comisión Internacional de Iluminación (CIE) ha
recomendado dicho espacio, junto con CIELUV, para la especificación cuantitativa del color
(CIE, 2004). Actualmente en todas las aplicaciones industriales que tratan con objetos de
color CIELAB es mucho más empleado que CIELUV (Kuehni, 1990), que casi sólo se
emplea en las industrias relacionadas con fuentes de luz e iluminación. Hay que mencionar
también que la adición de antioxidantes a aceites de oliva produce a veces colores que
están fuera del rango proporcionado por las escalas ABT (Gutiérrez y Gutiérrez, 1986),
UOCS (Melgosa et al., 2004) y MUOCS (Salmerón et al., 2012), motivo por el que en esta
Tesis se ha decidido usar CIELAB como espacio de especificación del color en lugar de
estas escalas específicas de color de aceites de oliva vírgenes extra.
Los pigmentos responsables del color del aceite de oliva forman parte de los
componentes minoritarios y no tienen relación química con los ácidos grasos. Estos
pigmentos están involucrados en los mecanismos de auto-oxidación y foto-oxidación, y se
pueden dividir en dos grupos: clorofilas y carotenoides. Las clorofilas son las responsables
del color verde del aceite y los carotenoides del amarillo. Cada estado de madurez de la
aceituna tiene unos valores diferentes de concentración de pigmentos (Moyano, 2002).
La concentración de clorofilas en los aceites va a depender, entre otros factores, del
sistema empleado en la extracción. En centrifugación directa el contenido en clorofilas es
mayor que mediante el prensado clásico. También depende de la madurez y del tipo de
frutos, siendo superior el contenido en clorofilas en las primeras épocas del periodo de
recogida de la aceituna (Mínguez-Mosquera et al., 1991).
El contenido de carotenoides del aceite de oliva varía de 5 a 100 mg/kg. De todos
ellos, el mayoritario es la luteína (2-8 mg/kg) y, al igual que en las clorofilas (su
concentración varía entre 1 y 20 mg/kg), su cantidad depende del método de extracción,
entre otros parámetros (Baeten et al., 2001; Cichelli y Pertesana, 2004).
Tesis Doctoral
54
2.- Antecedentes
2.4.- FUNDAMENTOS DE CIENCIA DEL COLOR
2.4.1. ESPECIFICACIÓN DEL COLOR
El color es una percepción que se genera en el cerebro al interpretar las señales
nerviosas que le envían los fotorreceptores de la retina del ojo, que a su vez son
sensibles a las distintas longitudes de onda del espectro electromagnético de la luz. Se
puede decir que el color de los objetos no existe por sí mismo, es sólo una percepción del
cerebro, que a menudo está también relacionada con las condiciones de observación de
dichos objetos (Fairchild y Melgosa, 2012).
El fenómeno de la percepción del color puede ser dividido en dos partes, en una
primera aproximación. La primera parte consiste en fenómenos de tipo físico-químico y
requiere usualmente de la conjunción de tres elementos: una fuente de luz, un objeto y un
detector. La interacción de la luz con el objeto puede dar lugar a fenómenos físicos como
la refracción, la transmisión, la dispersión, etc. En la segunda parte ocurren una serie de
procesos complicados y no del todo conocidos donde el receptor (el ojo) transmite
información al cerebro que la interpretará como color (Delgado-Vargas y Paredes-López,
2003).
El color depende de la luz y consecuentemente de la fuente de ésta. La luz está
compuesta de diferentes longitudes de onda de radiación y la luz visible es el
componente más importante en relación a la apreciación del color (la luz ultravioleta
también tiene cierta influencia, en particular en materiales fluorescentes y
fosforescentes). La luz visible comprende una parte muy pequeña del espectro
electromagnético, con radiaciones de longitudes de onda comprendidas entre 380 y 780
nm en el vacío, aproximadamente (Figura 2.4). Los colores percibidos por el ojo humano
están asociados con la radiación de luz en los siguientes rangos de valores,
aproximadamente: azul-violeta (380<<480 nm), verde (480<<560 nm), amarillo
(560<<590 nm), naranja (590<<630 nm) y rojo (630<<780 nm).
En nuestra vida diaria, estamos rodeados por un elevado número de colores. Los
sujetos con visión normal del color (en torno al 94% de la población) a menudo no damos
importancia a la percepción del color pero éste tiene una gran presencia en nuestras
vidas: influye en nuestros gustos en la selección de alimentos y otros tipos de compras, a
la hora de seleccionar información en mapas o páginas web, etc. Aunque los colores nos
afectan mucho y su importancia es creciente, nuestro conocimiento del color y de su
Tesis Doctoral
55
2.- Antecedentes
control es aún incompleto, lo que conduce a una gran cantidad de problemas a la hora de
diseñar y mantener el color de un producto. Como el juicio se hace frecuentemente de
acuerdo con la impresión o la experiencia personal, es necesario utilizar estándares
comunes y uniformes, tales como los observadores patrón propuestos por la CIE, con el
fin de poder obtener una especificación universal, rigurosa y precisa del color.
Incluso cuando tan sólo miramos a nuestro alrededor, una gran variedad de
colores entra en nuestros ojos. Sin embargo, al contrario de lo que ocurre con la longitud
o el peso, no existe una escala física sencilla para medir el color, y no todo el mundo
contesta del mismo modo cuando se le pregunta por un color determinado (Konica
Minolta, 2007). El color percibido es realmente un ente complejo, en el que aún no está
completamente determinado el número de dimensiones o variables independientes que
es necesario considerar (Fairchild, 2005). Normalmente se considera que en el color se
pueden distinguir tres dimensiones o atributos (tono, claridad y saturación), por
simplicidad de representación (e.g. en los atlas de color, como el Munsell, NCS, etc.).
Figura 2.4
Espectro electromagnético (izquierda), zona visible del espectro (derecha).
Tesis Doctoral
56
2.- Antecedentes
El color es una cuestión de percepción y de interpretación subjetiva, por lo que en
los experimentos suele haber una variabilidad inter-observador (de unos observadores
respecto a otros) e intra-observador (de un mismo observador repitiendo varias veces el
mismo experimento) no despreciables, que siempre es preciso tener en cuenta. En todo
caso, la especificación del color mediante palabras es muy imprecisa, como también lo es
la especificación acudiendo a conjuntos de muestras con una ordenación sistemática, tal
como las que se presentan en los llamados “atlas de color”. Afortunadamente, la
Comisión Internacional de Iluminación (CIE) ha establecido las bases para la
especificación numérica del color (CIE, 2004), que tiene su punto de partida en los
llamados valores triestímulo X, Y, Z, en cuya definición intervienen los tres elementos
básicos de la percepción del color antes mencionados: fuente de luz, objeto y sistema
visual humano. A partir de los valores triestímulo, la CIE ha propuesto también espacios
de color más apropiados que el espacio de los valores triestímulo (e.g. los espacios
CIELUV y CIELAB), en los que se pueden distinguir o calcular los 3 principales atributos
de la percepción cromática: tono, claridad y saturación, que se definen en los párrafos
siguientes.
Tono
El tono (hue en inglés) es el atributo del color más intuitivo o fácil de entender, ya
que es a lo que nos referimos cuando en el lenguaje corriente decimos que un objeto es
rojo, anaranjado, amarillo, verde, azul, violeta, rosa, marrón, púrpura, etc. El blanco, el
negro y el gris son también colores, pero sin cromaticidad (acromáticos) o con tonos
neutros. Los colores que habitualmente distinguimos en el arco iris son un buen ejemplo
de algunos de los tonos o colores no acromáticos. Las parejas de tonos rojo-verde y azul-
amarillo suelen denominarse oponentes, por la imposibilidad de obtener un estímulo que
sea percibido simultáneamente como rojo y verde (o como azul y amarillo). Además, la
mezcla aditiva de los tonos rojo y verde (o azul y amarillo), en proporciones apropiadas
produce estímulos neutros (colores acromáticos) en las denominadas experiencias de
cancelación de tono. La continuidad de tonos da como resultado las denominadas ruedas
de color o círculos de tonos (e.g. Figura 2.5, arriba), en las que suelen aparecer los tonos
en el mismo orden en que los vemos en el arco iris, y los extremos azul y rojo están
conectados mediante los colores denominados púrpuras. Los tonos púrpura son
estímulos no espectrales (no aparecen en los espectros de ninguna sustancia) que se
obtienen por mezcla aditiva de los tonos azul y rojo correspondientes a los extremos del
espectro visible.
Tesis Doctoral
57
2.- Antecedentes
Claridad-Luminosidad
Con independencia de su tono, un estímulo de color cualquiera puede ser más o
menos luminoso, es decir tener más o menos cantidad de luz. Así, hablamos de colores
claros y oscuros según que su luminosidad sea alta o baja. La luminosidad puede
medirse independientemente del tono. Si se observa la parte inferior de la Figura 2.5 (que
es un corte transversal de la superior, a lo largo de la línea recta que une A (verde) y B
(rojo-púrpura)), la luminosidad aumenta hacia la parte superior y disminuye hacia la parte
inferior. El negro y el blanco son estímulos acromáticos de luminosidad baja y alta,
respectivamente. La claridad es la luminosidad relativa de un estímulo, es decir la
luminosidad de un estímulo en comparación con un blanco patrón iluminado de la misma
manera que el estímulo. Un mismo trozo de papel blanco observado a plena luz del sol y
a la sombra presenta diferente luminosidad, pero su claridad o luminosidad relativa no
varía.
Figura 2.5
Rueda del color. Ejemplo de un círculo de tonos y de los atributos de claridad y saturación
Tesis Doctoral
58
2.- Antecedentes
Saturación
Con independencia del tono y luminosidad, los estímulos de color pueden ser más
o menos vivos o intensos. Así, los colores espectrales (producidos por las lámparas
espectrales de los distintos elementos químicos) son muy vivos, pero si les añadimos
blanco se van haciendo menos vivos o más pálidos, y se puede decir que se van
“desaturando”. Existe pues un tercer atributo del color, completamente independiente del
tono y de la luminosidad, que podemos llamar “saturación”. En realidad, la literatura
específica (Fairchild, 2005) considera aquí varios atributos distintos, denominados
“colorido”, “croma” y “saturación”, pero no entraremos aquí en su distinción por estar
fuera de los objetivos de esta Tesis. Prestando atención de nuevo la Figura 2.5, se
aprecia que la saturación cambia para los estímulos rojo-púrpura y verde
respectivamente, a medida que cambia la distancia horizontal respecto al centro. Los
colores son apagados o poco saturados cerca del centro y se hacen más vivos o
saturados a medida que nos alejamos del centro. En una escala ideal que fuera del
blanco al negro pasando por los grises (lo que se denomina una escala de grises)
tenemos una serie de estímulos acromáticos o de saturación nula. En la parte derecha de
la Figura 2.5, se muestran algunos adjetivos generalmente utilizados para describir la
luminosidad y la saturación de los colores.
Tono, luminosidad y saturación son por lo tanto los tres atributos principales del
color y pueden combinarse para crear el llamado sólido de color, un ente tridimensional
como el que se muestra en la Figura 2.6a. Los tonos conforman círculos centrados en el
eje del sólido, con la luminosidad como variable en la dirección vertical y la saturación
como variable en la dirección horizontal (Figura 2.6b). El Munsell Book of Color o atlas de
color Munsell es una famosa colección de muestras de color con un total de 40 páginas,
en cada una de las cuales se tiene un conjunto de muestras con un mismo tono (Hue), en
las que la claridad (Value) varía en la dirección vertical y la saturación (Chroma) en la
dirección horizontal (Figura 2.7). Este atlas sería una posible ejemplificación del sólido de
color al que nos estamos refiriendo.
Tesis Doctoral
59
2.- Antecedentes
Figura 2.6
Diferentes representaciones de los atributos del color en el sólido de color
Figura 2.7
Representación de las 40 cartas o tonos (Hue) del atlas Munsell
Como ya se ha dicho, el color es una percepción, de modo que estrictamente
hablando, un objeto (e.g. una muestra de aceite de oliva) no tiene un color fijo, más bien su
color percibido depende de varios factores, como, por ejemplo, el tipo de luz que lo ilumina.
Un mismo objeto tiene una apariencia diferente según la fuente que lo ilumine: la luz del
sol, una bombilla convencional, o una lámpara fluorescente. En realidad, cuando se dice
que el color percibido es el resultado de la interacción de la luz que ilumina con el objeto y
con el sistema visual humano, sólo estamos haciendo una primera aproximación al
problema, pues de hecho, el color percibido de un objeto puede depender también de otros
factores adicionales. Por ejemplo, es bien sabido que el fondo o campo circundante de un
Tesis Doctoral
60
2.- Antecedentes
cierto estímulo influye en el color percibido de dicho estímulo, de manera que, por ejemplo,
un fondo claro/oscuro induce un color oscuro/claro: son los llamados efectos de contraste
simultáneo o de inducción cromática, que son más notables cuando disminuye el tamaño
del estímulo respecto al del campo circundante. En las cabinas de iluminación
convencionales el suelo y las paredes suelen ser de un color gris neutro, a fin de evitar
estos efectos de inducción cromática a la vez que se controla la luz que incide sobre el
objeto. El tamaño del objeto también puede tener una cierta influencia en el color percibido
según investigaciones recientes (Xiao et al., 2011), de modo que un mismo estímulo nos
parece un poco más luminoso y saturado cuando su tamaño es grande, sin que el tamaño
tenga una influencia destacable en la percepción del tono. Esto tiene ciertas implicaciones
prácticas, por ejemplo a la hora de elegir la pintura de una pared grande a partir de los
colores disponibles en un determinado muestrario o atlas de color en el que las muestras
disponibles son usualmente de tamaño bastante pequeño. Algunos materiales (e.g.
algunas pinturas metalizadas usadas en las carrocerías de coches) tienen propiedades
gonioaparentes; es decir, su color cambia con la dirección de iluminación y observación.
Estos materiales gonioaparentes son bastante atractivos para algunos diseñadores y
consumidores, pero la caracterización precisa de su color es bastante complicada,
requiriendo como mínimo del uso de espectrofotómetros multiángulo (Melgosa et al., 2014).
Por último, se puede también mencionar que aún dentro de lo que se denominan
personas con “visión normal del color” existen diferencias en la percepción del color que
pueden tener cierta relevancia. Por ejemplo, es conocido que con la edad hay cambios en
la visión del color, como consecuencia de la disminución del tamaño pupilar,
amarilleamiento del cristalino, cambios retinianos, etc. El envejecimiento generalizado de la
población occidental hace que el estudio de estos cambios y la elección de diseños válidos
para personas de todas las edades (en señalización visual, páginas webs, etc.) sea un
tema de creciente interés en la actualidad.
2.4.2.- ESPACIOS DE COLOR
Se han propuesto distintos métodos para cuantificar el color y expresarlo
numéricamente con el objetivo de poder comunicar los colores de un modo universal y
preciso. Por ejemplo, para intentar mejorar la imprecisión que conlleva la especificación
del color mediante el uso de palabras, en 1905 el artista estadounidense A. H. Munsell
creó un método de ordenación de los colores y lo materializó realizando el “atlas de color”
Munsell: un gran número de muestras de papel con distintos colores clasificadas de
acuerdo con su método de ordenación, en el que se distinguen los atributos de tono
Tesis Doctoral
61
2.- Antecedentes
(Hue), claridad (Value) y saturación (Chroma). La comparación visual de las muestras del
atlas con una muestra de color dada nos permite especificar el color de dicha muestra
mediante tres parámetros relacionados con los atributos antes mencionados.
Concretamente, mediante el atlas Munsell cualquier color se expresa como una
combinación de letras y números (H V/C) en términos de su tono (H), claridad (V) y croma
(C), según una comparación visual que a veces puede resultar problemática. Por
ejemplo, a menudo el color buscado no coincide con ninguna de las muestras del atlas
Munsell, lo que hace necesario realizar una interpolación visual subjetiva entre las
muestras disponibles en el atlas (o incluso una extrapolación), que puede ser bastante
imprecisa.
La organización internacional más importante desde el punto de vista de la
estandarización de la luz y el color es la Commission Internationale de l'Éclairage
(Comisión Internacional de la Iluminación - CIE), que ha desarrollado varios sistemas
para expresar el color numéricamente de forma objetiva. Se trata así de evitar la
subjetividad e imprecisión inherentes a la especificación de un color mediante la
comparación visual realizada por una determinada persona (o un panel de observadores)
mediante el uso de un determinado atlas de color. Los dos sistemas CIE más conocidos
son el sistema Yxy, creado en 1931 basándose en los valores triestímulo XYZ, y el
sistema L*a*b* (o CIELAB), creado en 1976 para proporcionar diferencias de color más
uniformes en relación con las diferencias visuales. Tanto XYZ, como Yxy, o L*a*b*
pueden considerarse ejemplos de espacios de color. Un espacio de color es simplemente
un sistema de especificación numérica del color mediante el uso de 3 números que
varían en escalas continuas (téngase en cuenta que las escalas Munsell de Hue, Value y
Chroma no son continuas sino discretas). A veces se deja aparte el atributo de
luminosidad (relacionado con el valor triestímulo Y) y entonces los espacios de color
quedan reducidos a dos dimensiones que constituyen lo que se llama un “diagrama de
cromaticidad” (e.g. el célebre diagrama de cromaticidad CIE xy con forma de huella de
caballo). Aún no disponemos de un espacio de color ideal en el que sus 3 dimensiones se
correspondan con exactitud con los atributos del color percibido. Tal espacio de color
suele decirse que debe ser “uniforme”, lo que quiere decir que las diferencias de color
visualmente iguales a un estímulo dado, deben ser estímulos situados en dicho espacio
sobre la superficie de esferas de un mismo radio centradas en los estímulos dados.
CIELAB (o el espacio L*C*h derivado de CIELAB) son sólo espacios de color
aproximadamente uniformes.
Tesis Doctoral
62
2.- Antecedentes
Espacio de color XYZ
Los valores triestímulo , , (Ecuaciones 2.1, 2.2 y 2.3) determinan un espacio
de color, del que se deriva inmediatamente el espacio de color Yxy, siendo ambos
espacios los primeros que fueron propuestos por la CIE en 1931 (CIE, 2004). Como ya se
ha dicho, el cálculo de los valores triestímulo de un objeto implica conocer 3 parámetros:
1) la distribución espectral de la fuente de luz que ilumina el objeto ( ); 2) la reflectancia
o transmitancia espectral del objeto iluminado ( ); 3) las sensibilidades espectrales del
ojo humano (o sea, las llamadas “funciones de mezcla” , , que constituyen los
“observadores patrón” establecidos por la CIE):
= ∑ Ecuación 2.1
= ∑ Ecuación 2.2
= ∑ Ecuación 2.3
Más concretamente, el valor triestímulo está relacionado con la luminosidad o
cantidad de luz, que puede dejarse aparte y considerar sólo las coordenadas de
cromaticidad , (resultado de normalizar los valores triestímulo mediante su suma)
(Ecuaciones 2.4 y 2.5), lo que conduce al diagrama de cromaticidad CIE , mostrado en
la Figura 2.8.
= Ecuación 2.4
= Ecuación 2.5
En el diagrama CIE , los estímulos espectrales (máxima saturación) están
situados sobre el borde curvo del diagrama de cromaticidad (lugar espectral), y el
estímulo acromático (blanco) aproximadamente en su centro, mientras que los extremos
azul y rojo del espectro visible quedan conectados por una línea recta denominada línea
de púrpuras. La saturación o croma de los estímulos en este diagrama crece conforme
nos aproximamos al lugar espectral o a la línea de púrpuras (Figura 2.8).
Tesis Doctoral
63
2.- Antecedentes
Figura 2.8
Diagrama de cromaticidad CIE , basado en el espacio de color XYZ.
Espacio de color L*a*b*
El espacio de color L*a*b* (también llamado CIELAB) es actualmente uno de los
espacios más populares para medir el color de los objetos y se utiliza ampliamente en
casi todos los campos. Es uno de los espacios de color aproximadamente uniformes
definidos por la CIE en 1976 para resolver uno de los principales problemas del espacio
Yxy: en este último espacio iguales distancias no se correspondían en absoluto con
iguales diferencias de color percibidas. En CIELAB, L* indica claridad (luminosidad
relativa) mientras que a* y b* indican cromaticidad (Figura 2.9). Las ecuaciones de
cálculo de las coordenadas L*, a*, b* a partir de los valores triestímulo , , , suponiendo
un determinado blanco de referencia, pueden encontrarse en la literatura (CIE, 2004). En
la parte inferior de la Figura 2.9 se muestra el plano de cromaticidad a*b* en el que
podemos observar que +a* es la dirección del rojo, -a* es la dirección del verde, +b* es la
dirección del amarillo y -b* es la dirección del azul. El centro del plano a*b* es un color
acromático; a medida que los valores de a* y b* aumentan y el punto se separa del
centro, la saturación del color se incrementa.
La parte izquierda de la Figura 2.10 es una representación de CIELAB que puede
asociarse tanto con el sistema Munsell como con el sólido de color (Figura 2.6)
previamente mencionados, lo que hace que el sistema CIELAB resulte para mucha gente
bastante intuitivo o fácil de entender. La parte derecha de la Figura 2.10 muestra algunos
Tesis Doctoral
64
2.- Antecedentes
adjetivos usualmente empleados para designar los colores situados en distintas zonas del
espacio CIELAB.
Figura 2.9
a) Espacio de color CIELAB con las coordenadas L*a*b*.
b) Plano CIELAB con coordenadas a* y b* (L* constante).
Tesis Doctoral
65
2.- Antecedentes
Figura 2.10
Vista del espacio de color L*a*b* (izquierda) y algunos calificativos usados para designar los
colores situados en distintas posiciones de este espacio (derecha).
Espacio de color L*C*h
El espacio de color L*C*h es en realidad el mismo espacio de color L*a*b*, pero
utilizando coordenadas cilíndricas en lugar de coordenadas rectangulares. En este
espacio de color, L* es la misma claridad (luminosidad relativa) del espacio de color
L*a*b*, mientras que C* es el croma CIELAB y h es el ángulo de tono CIELAB (ver Figura
2.11). En realidad, las designaciones oficiales (CIE, 2004) del croma y ángulo de tono en
CIELAB son ∗ y ℎ , respectivamente. El valor de croma ∗ (Ecuación 2.6) es nulo
para estímulos neutros o acromáticos (saturación nula), y aumenta de acuerdo con la
distancia respecto al centro. El ángulo del tono ℎ (Ecuación 2.7) se define comenzando
en el eje +a* y se expresa en grados: 0° sería el eje +a* (rojo), 90° sería el eje +b*
(amarillo), 180° sería el eje -a* (verde) y 270° sería el eje -b* (azul).
∗ = ∗ + ∗ Ecuación 2.6
∗
ℎ = tan ∗ Ecuación 2.7
Tesis Doctoral
66
2.- Antecedentes
Figura 2.11
Parámetros del espacio de color L* C* h.
Espacio de color Hunter Lab
El espacio de color de Hunter Lab fue desarrollado por R.S. Hunter y es también
un espacio de color más uniforme visualmente que el espacio de color Yxy definido por la
CIE en 1931. Similar al espacio de color CIE L*a*b*, sigue en uso en varios campos,
como la industria de pinturas de los EE.UU., y está incluido en el software de algunos
instrumentos de medida del color. Como se ha apuntado, son numerosos los espacios de
color propuestos a lo largo de los años, éste es sólo un ejemplo más. En todo caso,
conviene hacer notar que los espacios de color actualmente recomendados por la CIE
son solamente CIELUV y CIELAB, siendo este último el que más se usa en la práctica,
salvo en la industria relacionada con fuentes de iluminación.
2.4.3.- MEDIDA DE LA DIFERENCIA DE COLOR
Desde un punto de vista práctico, más allá de la especificación numérica del
color, interesa la medida de diferencias de color. En efecto, dados dos estímulos de color
con diferentes coordenadas en un determinado espacio de color, puede ser que la
diferencia entre esos estímulos no sea visualmente perceptible (es decir, esté por debajo
del umbral de discriminación del ojo humano), en cuyo caso sería una diferencia
totalmente aceptable en un proceso de control de calidad industrial. Ahora bien, si esos
dos estímulos son percibidos como ligeramente distintos o como muy distintos, el cambio
de color podría ser inaceptable en un control de calidad, e indicar que por alguna/s
causa/s el color del material ha sufrido una degradación o cambio que es preciso
controlar/subsanar. A partir de las coordenadas de color de dos estímulos en un cierto
Tesis Doctoral
67
2.- Antecedentes
espacio de color podemos calcular su diferencia de color ∆E, por ejemplo como una
simple distancia Euclídea entre dichos puntos.
Una “fórmula de diferencia de color” es un cálculo matemático que, a partir del
color de dos estímulos dados, nos da un determinado número ∆E, que debe estar bien
correlacionado con la diferencia de color visualmente percibida por sujetos con visión
normal del color (∆V) entre dichos estímulos. Los instrumentos comerciales de medida
del color suelen incorporar en su software el cálculo de diferencias de color mediante
varias fórmulas de diferencia de color. La distancia Euclídea en CIELAB, ∆E*ab (Ecuación
2.8), es una de las fórmulas de diferencia de color más usuales (Figura 2.12), y
afortunadamente esta distancia puede expresarse también como el resultado de las
diferencias en claridad (L*), croma (C*ab) y tono (H*ab) CIELAB (Ecuación 2.9), lo cual
resulta bastante más intuitivo al ser éstos los 3 atributos básicos del color percibido:
E*ab= [(L*)2 + (a*)2 + (b*)2]1/2 Ecuación 2.8
E* = [(L*)2 + (C* )2 + (H* )2]1/2 ab ab ab Ecuación 2.9
donde el símbolo ∆ indica la diferencia de la magnitud correspondiente entre las 2
muestras cuya diferencia de color se desea calcular, salvo en el caso de la diferencia de
tono, H*ab, que está relacionada con la diferencia en ángulo de tono (hab), calculándose
mediante la Ecuación 2.10 (CIE, 2004):
H* =2 ∗ ∗ab , , sin Ecuación 2.10
donde dentro del radicando aparecen los valores del croma CIELAB de las 2 muestras
comparadas.
La ecuación 2.9 permite calcular los porcentajes de diferencia en claridad, croma y
tono que hay en una diferencia de color total ∆E*ab. La Figura 2.13 muestra algunos
términos utilizados para describir diferencias en claridad y croma en CIELAB. Sin
embargo, desde el punto de vista perceptivo, suele ser frecuente que las diferencias de
claridad, croma y tono CIELAB tengan distinto peso o importancia en la diferencia de
color total. En efecto, a partir de esta idea se han propuesto numerosas fórmulas de
diferencia de color basadas en CIELAB que a menudo son mucho más eficientes que la
propia fórmula CIELAB (Ecuaciones 2.8 y 2.9), en el sentido de predecir mejor los
Tesis Doctoral
68
2.- Antecedentes
resultados de la percepción visual humana (Melgosa et al., 2014). Un ejemplo de una
fórmula de este tipo es CIEDE2000 (CIE, 2004), que es la fórmula de diferencia de color
actualmente recomendada por ISO y CIE como estándar (CIE, 2013), en particular para
una serie de condiciones de observación próximas a las más habituales en las
aplicaciones industriales.
Figura 2.12
Diferencias de color en el espacio L*a*b*.
Figura 2.13
Términos para describir diferencias de color en claridad y croma CIELAB.
Tesis Doctoral
69
2.- Antecedentes
2.4.4.- EMOCIONES Y PREFERENCIAS SUSCITADAS POR EL COLOR
Definir una emoción es algo bastante complejo. En una primera aproximación se
puede decir que en una emoción se desencadena el siguiente proceso: estímulo,
reconocimiento del estímulo, conciencia del estímulo, sentimiento subjetivo,
comportamiento y efecto de dicho comportamiento (Plutchik, 1980). El color, siendo un
estímulo, tiene una fuerte influencia en la generación de emociones en el ser humano. Por
ejemplo, algunos colores pueden hacernos sentir felices y otros pueden hacernos sentir
tristes. A lo largo de la historia de la psicología hay diversos estudios que relacionan el
color y las emociones (Birren, 1978; Johnson et al., 1986). Pero no fue hasta 1997, en el 8º
Congreso Cuatrienal de la Asociación Internacional del Color (AIC) en Kyoto, cuando en el
mundo de la colorimetría se explicitó el interés por este campo de la psicofísica. Cinco
años después, la AIC organizó un congreso en Bangkok en el que el tema principal reunía
psicología, colorimetría y diseño dentro del mundo de las emociones de color. En la
actualidad, el Comité Técnico 1-86 de la CIE (Presidente: L. C. Ou) trabaja sobre modelos
de emociones suscitadas por el color y armonía, lo que supone un reconocimiento explícito
al creciente interés que este tema suscita dentro de la comunidad científica dedicada al
estudio del color.
Aunque el término “emoción de color” no está del todo bien precisado, una posible
definición del mismo seguida por diversos autores es: “(…) aquella consecuencia de un
estímulo de color que puede ser expresada a través de las palabras” (Sato et al., 2000; Ou,
2004). Si aceptamos esta definición, la investigación sobre emociones de color tratará de
relacionar emoción y color por medio de términos semánticos (Osgood et al., 1957). En
estudios iniciales sobre respuestas emocionales al color, Norman y Scott en 1952 indicaron
una importante limitación, pues realmente no se medía la respuesta emocional del
observador ante un color, sino más bien la respuesta emocional del observador ante
materiales de color que se observaban bajo unas determinadas condiciones de
iluminación. Es decir, no se tenía en cuenta que las emociones pueden ser evocadas
simplemente por el color, sino que se asociaban a la experiencia visual completa. Esta
perspectiva resulta muy interesante, ya que conviene hacer notar que en la práctica, por
encima de las emociones suscitadas por el color de forma genérica o abstracta, interesa el
color de objetos concretos (e.g. aceites de oliva, vinos, ropa, pelo, automóviles, etc.).
Los colores pueden afectar al estado de ánimo de las personas. Por ejemplo, se ha
estudiado el comportamiento de 625 personas en 9 oficinas prácticamente iguales, siendo
la única diferencia entre ellas que las paredes estaban pintadas de colores distintos
Tesis Doctoral
70
2.- Antecedentes
(Kwallek et al., 1996). Se analizó el estado de cada uno de los sujetos antes y después de
trabajar en cada una de las oficinas. Los resultados mostraron que las mujeres tendían a
un estado depresivo en oficinas de colores poco saturados; al contrario, los hombres
tendían a tener este comportamiento en las oficinas cuyas paredes estaban pintadas de
colores saturados. Además se mostró con una significación alta una tendencia general a
tener más faltas ortográficas cuando se trabajaba en ambientes con las paredes blancas.
Ante la limitación planteada por Norman y Scott, Ou plantea responder a la
siguiente pregunta: “Si todos los atributos de apariencia salvo el color están controlados
¿habrá relación directa entre color y emociones?” (Ou, 2004). Para responder a esta
pregunta, Ou propone dos niveles emocionales, uno reactivo y otro reflexivo. A nivel
reflexivo, el factor dominante es el significado del estímulo visual. Es decir, a este nivel hay
que tener en cuenta el contexto bajo el cual el estímulo es percibido. Aislar la interacción
entre color y emoción es complicado de hacer a un nivel reflexivo. A nivel reactivo, las
emociones están determinadas por las configuraciones del estímulo visual, incluyendo los
atributos visuales (como el color, la forma, la textura, etc.) pero manteniendo el estímulo y
su contexto sin variación. Esto implica que a un nivel reactivo sí que se puede establecer
un enlace directo entre color y emoción. De acuerdo con estas ideas, podemos definir las
emociones suscitadas por el color (o emociones de color) (Ou, 2004) como el resultado de
la relación entre un estímulo de color y sus correspondientes respuestas a nivel reactivo,
usualmente determinadas por la configuración del estímulo y la experiencia visual completa
(Gómez-Robledo, 2011).
Es posible llegar a cuantificar las emociones de color. Para empezar, se puede
establecer un orden en las emociones de color que percibimos: por ejemplo, dos colores
nos pueden parecer cálidos cuando los observamos, pero quizá uno más que el otro.
Puesto que el hecho de medir es comparar observables, uno de los objetivos en el campo
de las emociones de color es establecer una escala de emociones de color que nos
permita relacionar un punto concreto en un espacio de color con una determinada emoción
y la “intensidad” de dicha emoción. Así, se han propuesto (Sato et al., 2000) un primer
conjunto de ecuaciones para emociones de color, las cuales tratan de relacionar las
coordenadas CIELAB de un conjunto de muestras del sistema SCOTDIC (muestras textiles
de colores), con pares de emociones opuestas, evaluadas por un amplio grupo de sujetos
con visión normal del color. Por ejemplo, para el par de emociones “fuerte-débil” las
ecuaciones daban valores comprendidos entre +100 y -100, donde +100 corresponde a lo
más “fuerte” que puede resultar un color y -100 a lo más “débil”. La Ecuación 2.11 se
Tesis Doctoral
71
2.- Antecedentes
corresponde a la emoción “fuerte-débil”, que fue creada en base a la diferencia de color
entre cada estímulo y el color más “débil”, según el trabajo de Sato et al., 2000.
CE fuertedébil k L L *L *2 k 2 20 a a *a0 * kb b *b0 * kM Ecuación 2.11
CE es el valor predicho para esa emoción de color (Color Emotion); L*, a*, b* son
las coordenadas CIELAB del estímulo analizado, L0*, a0*, b0*, son las coordenadas del
color evaluado como “más débil”, y ki son las constantes características del modelo. En
las investigaciones que se realizan actualmente, para cada uno de los pares de
emociones estudiadas se proponen diferentes modelos o ecuaciones de emociones de
color, ajustando las respuestas experimentales de grupos de observadores a las
coordenadas de color de los estímulos visualizados (Sato, 2000; Xin, 2004). Los trabajos
de L.C. Ou tienen un objetivo similar al de T. Sato, 2000: buscar una relación entre las
coordenadas de color y la intensidad de cada par de emociones. Pero, a diferencia de los
trabajos de Sato, Ou no obtiene la medida de la intensidad de cada una de las emociones
promediando las respuestas de los sujetos del experimento sino por medio de la Ley de
Thurstone del Juicio Comparativo (Thurstone, 1994) y la Ley de Torgerson del Juicio
Categórico (Torgerson, 1958). Estas leyes permiten situar en un continuo psicológico la
intensidad percibida de ciertos estímulos sin necesidad de conocer la intensidad física de
los mismos.
Relacionado con el tema de las “emociones” suscitadas por el color están las
llamadas “preferencias de color”. Una definición simple de preferencia de color es la dada
por Nemcsics (1993): “un color es preferido cuando gusta más que otro”. Nuestra intuición
nos dice que las preferencias de color deben estar relacionadas con las emociones del
color, siendo quizá como una especie de resultado global de las mismas. Según Crozier
(1999), “si un azul es un color preferido y la felicidad es una emoción que gusta entonces
seguramente el azul estará más asociado con felicidad que con emociones como tristeza”.
En la práctica, la frontera entre emociones de color y preferencias de color no está bien
definida para muchos autores, llegándose incluso a considerar la “preferencia” como una
“emoción” más del tipo “me gusta - no me gusta”. Uno de los estudios más antiguos sobre
preferencias de color es el de Cohn, que propuso una aproximación empírica a las mismas,
y observó que, aunque una gran cantidad de estudios de preferencias de color están
centrados en estudiar distintas combinaciones de color, también hay trabajos que tratan de
estudiar la dependencia de las preferencias de color con distintos factores como la edad, el
género o las diferencias culturales (Cohn, 1984). Por otro lado, Goethe sugirió que los
Tesis Doctoral
72
2.- Antecedentes
colores tienen un contenido o significado psicológico intrínseco. Al igual que Norman y
Scott habían propuesto anteriormente para las emociones de color, las preferencias de
color están ligadas a un determinado contexto o situación concreta. Por ejemplo, el color
preferido para un coche, puede ser muy distinto del preferido para el exterior de una casa,
o una bebida, etc. Se habla así de preferencias de color “ligadas al contexto", habiéndose
estudiado preferencias de color en muy distintos ámbitos (Roa et al., 2001).
La edad ha sido un factor importante en la investigación sobre preferencias de color.
Por un lado, ciertos autores sugieren que la edad tiene una gran influencia en las
preferencias de color (Norman y Scott, 1952), mientras que otros apuntan justo lo contrario
(Dorcus, 1926; Child et al., 1968). También parece ser objeto de debate en preferencias de
color la influencia que pueda tener el sexo de los sujetos. Unos trabajos muestran que hay
diferencias evidentes (Garth, 1924; Shen, 1937) mientras que otros concluyen que no hay
muchas diferencias entre hombres y mujeres (Child et al., 1968; Eysenck, 1941; Camgöz et
al., 2002). Históricamente parece que ha habido una cierta evolución desde principios del
siglo XX hasta la actualidad, en la que las diferencias entre resultados para distintos sexos
han disminuido. Otro factor estudiado en las preferencias de color es la influencia de la
cultura del observador; es decir, podría haber distintas preferencias de color en función de
la raza, el entorno social, etc. La mayor parte de los estudios sugieren que hay diferencias
importantes en función de la cultura. Así, se han encontrado diferencias entre indios
“puros”, blancos “puros” y mestizos (Garth, 1922) y también diferencias entre sujetos de
Irán y Kuwait (Choungorian, 1968). Otros autores indican que existen diferencias entre
culturas aunque no son tan marcadas como sería de esperar, y han desarrollado modelos
predictivos que relacionan las coordenadas CIELAB de los estímulos con la intensidad de
la emoción y la preferencia de color (Xin et al., 2004 y Ou et al., 2004a, 2004b y 2004c). Se
han comparado de sujetos procedentes de Japón, Corea y Taiwán (Xin et al., 2004), así
como de sujetos de Reino Unido y Taiwán (Ou, 2004; Gómez, 2011). El estudio de
preferencias y emociones de color considerando sólo sujetos con visión normal del color es
otro aspecto común a la mayoría de las investigaciones que se han realizado hasta ahora,
con muy pocas excepciones (Álvaro et al., 2015). No obstante, es generalmente
reconocido que hay que prestar una mayor atención al estudio y resolución de los
problemas relacionados con visión defectiva del color, que afectan a un número importante
de personas, especialmente varones (Lillo et al., 2014).
En definitiva, puede decirse que la influencia de la edad, el género y la cultura sobre
las preferencias y emociones de color es actualmente un tema bastante abierto,
especialmente cuando se trata de preferencias y emociones de color ligadas a contextos
Tesis Doctoral
73
2.- Antecedentes
específicos. Este es el caso de la presente Tesis Doctoral en la que nos referiremos a las
preferencias y emociones suscitadas por el color de aceites de oliva vírgenes extra puros y
con adición de determinadas concentraciones de antioxidantes procedentes de un tipo
concreto de microalga. Aunque sería deseable poder estudiar todas las posibles variables
con influencia en los resultados, por el momento nuestro estudio en esta Tesis se ha
restringido a la variable que nos parece que puede ser más importante: el hecho de que los
sujetos que realizan el experimento de emociones de color sean o no españoles o, dicho
de otro modo, el hecho de que dichos sujetos estén acostumbrados o no al consumo del
aceite de oliva.
2.5.- FACTORES QUE INFLUYEN EN EL COLOR Y AFECTAN A LA PRESENCIA DE
ANTIOXIDANTES EN EL ACEITE DE OLIVA
Como se ha comentado anteriormente, el aceite de oliva virgen es el zumo natural
de un fruto, que puede consumirse directamente, a diferencia de cualquier otro tipo de
aceite vegetal. Debido a esta forma “natural” de obtención, todo el proceso, desde el olivo
hasta que el aceite llega al consumidor, debe estar controlado para conseguir y mantener
aceites de oliva de calidad.
En principio, cualquier variedad de aceituna es apta para obtener aceites de
buena calidad, siempre que se utilicen las técnicas de cultivo adecuadas y todas las
operaciones del proceso de elaboración se realicen en las mejores condiciones. Sin
embargo, si se quieren obtener aceites con determinados atributos positivos es necesario
partir de determinadas variedades que puedan aportar estos atributos.
Según algunos autores, la variedad es la variable más importante para
caracterizar las diferentes producciones olivícolas (Fiorino y Nizzi, 1991; Pannelli y Servili,
1991), mientras que en otros casos se piensa que las diferencias en composición debidas
al estado de maduración son mucho mayores que las propias del cultivar (Civantos et al.,
1999). Se han realizado algunos trabajos específicos en los que se considera la variación
del color del aceite de oliva virgen extra como consecuencia de la variedad y estado de
madurez de la aceituna, así como de la campaña de cosecha (Moyano, 2002; Melgosa et
al., 2005).
La influencia de la variedad de aceituna en las características químicas del aceite
de oliva se debe, por un lado, a la acumulación de determinados triglicéridos y, por otro, y
en mayor medida, a la formación y evolución de los otros componentes. De las técnicas
Tesis Doctoral
74
2.- Antecedentes
de cultivo, la que más influye en la obtención de aceites de calidad es la protección
fitosanitaria del árbol. Para alcanzar esta calidad es absolutamente necesario que los
frutos se conserven sanos y que permanezcan en el árbol hasta el momento de la
recolección. La tecnología de extracción y separación puede modificar la cantidad de
pigmentos liposolubles que pasan a las diversas fracciones aceite/agua/orujo, por lo que
parece necesario conocer mejor su contenido en las diversas partes del fruto, la
influencia de los mecanismos de extracción y sus relaciones de dispersión en las distintas
fracciones de la elaboración. De los numerosos factores que influyen en la calidad del
aceite de oliva virgen, algunos de ellos, tales como la variedad de aceituna, el grado de
maduración o el sistema de extracción utilizado, inciden directamente sobre las
características organolépticas, y concretamente sobre el color (Humanes y Civantos,
1992; Fedeli, 1996; Alba et al., 1997; Uceda y Hermoso, 1999; Civantos, 2009). Como es
de imaginar, existe una gran cantidad de factores que influyen sobre la presencia de
antioxidantes en el aceite de oliva virgen, los agronómicos y los tecnológicos (también
conocidos como industriales o de transformación). En los siguientes epígrafes nos
referiremos a todos estos factores, pues su influencia es una referencia de interés para
los estudios de esta Tesis, centrados en aceites con antioxidantes procedentes de
microalgas, tanto por lo que se refiere a su cambio de color como a su estabilidad física y
química.
2.5.1.- FACTORES AGRONÓMICOS
Los factores agronómicos inciden en la calidad del aceite de oliva ya que afectan
directamente a la aceituna. Se clasifican en:
Intrínsecos: Aquellos que difícilmente pueden modificarse. Entre ellos se encuentra
la variedad y el medio en el que se desarrolla la planta.
Extrínsecos: Son los que pueden ser controlados, con relativa facilidad, por el
agricultor. Se pueden incluir en este apartado las prácticas culturales, la recolección y el
transporte.
Tesis Doctoral
75
2.- Antecedentes
2.5.1.1.- Factores agronómicos intrínsecos
Variedad de aceituna
La variedad de aceituna influye en el color del aceite obtenido en función de la
composición en pigmentos que presente. Como se ha dicho anteriormente, las clorofilas
comunican la tonalidad verde, y los carotenos participan en la coloración amarillo-rojiza, de
modo que la proporción relativa de clorofilas y carotenos es lo que principalmente
determina el color resultante del aceite. Algunas variedades producen aceites verdes
independientemente del grado de maduración, mientras que otras sólo producen aceites
verdes cuando el fruto no está totalmente maduro (Ridgway, 1993).
El estudio de pigmentos cloroplásticos (clorofilas y carotenoides) en frutos de las
variedades “Hojiblanca” y “Manzanilla”, ha puesto de manifiesto que la composición
cualitativa es idéntica para ambas variedades y que además se mantiene inalterada a lo
largo del tiempo, debiéndose las diferencias en el color de las mismas a diferentes
cantidades de los pigmentos (Mínguez-Mosquera y Garrido-Fernández, 1986b). Se han
señalado diferencias cuantitativas en el contenido en pigmentos entre los frutos de éstas
dos variedades, siendo los procedentes de “Manzanilla” los menos pigmentados, y
manteniendo, en ambos casos, el mismo grado de diferencia en los distintos estados de
maduración (Mínguez-Mosquera y Garrido-Fernández, 1987, 1989).
En el caso de la variedad “Arbequina”, sin embargo, se han identificado algunos
pigmentos no encontrados en otras variedades, tales como clorofilidas, xantófilas
esterificadas, α-caroteno, ԑ-caroteno, y fitoflueno (Gandul-Rojas y Mínguez-Mosquera,
1999).
También se han observado diferencias varietales relacionadas con el color en
aceites procedentes de variedades italianas y de 34 tipos diferentes de olivo catalán, donde
se encontraron como tonalidades más frecuentes las comprendidas entre los índices 2/3 y
2/9 de la escala ABT modificada (Tous y Romero, 1992; Ranalli, 1992a; Ranalli, 1992b;
Montedoro et al, 1993; Ranalli y Serraiocco, 1996).
Un estudio más reciente sobre la composición de clorofilas y carotenos de 9
variedades de aceites de oliva vírgenes de las principales regiones de producción española
ha mostrado, igualmente, diferencias cuantitativas que dependen de la variedad y grado de
maduración de los frutos, pero en este caso se ha encontrado que los cis-α-carotenos, las
Tesis Doctoral
76
2.- Antecedentes
xantófilas mono- y di-esterificadas y la feoforbida “a” fueron pigmentos exclusivos de la
variedad “Arbequina”, un hecho que, según los autores, podría ser utilizado como un
diferenciador quimo-taxonómico de los aceites de esta variedad (Gandul-Rojas y Mínguez-
Mosquera, 1996a).
Estudios posteriores han confirmado la dependencia entre el nivel de pigmentos
fotosintéticos en el aceite y la variedad de aceituna, teniendo siempre en cuenta que el
grado de madurez de la aceituna es, igualmente, un importante factor a considerar, ya que
implica una pérdida gradual de pigmentos clorofílicos y carotenoides y un incremento de
compuestos antociánicos. Las velocidades relativas de desaparición de clorofilas y
carotenos son marcadamente diferentes entre variedades, implicando que también su
velocidad de catabolismo es una característica propia de cada variedad (Roca y Mínguez,
2001).
Factores ambientales
El clima ejerce una gran influencia sobre la composición química y la calidad del
aceite. Se ha observado que existe una notable influencia de las condiciones
meteorológicas sobre la evolución en el crecimiento del fruto y su maduración (Jacoboni et
al., 1999), lo que produce modificaciones del color del aceite de oliva obtenido de una
misma planta en distintas cosechas. En un estudio del efecto de los factores agronómicos y
estacionales sobre la producción del olivo y las características cualitativas de los aceites se
ha puesto de manifiesto que las condiciones climáticas, en particular las precipitaciones,
influyen en la composición química de los aceites. Los compuestos que más se ven
influenciados son los alcoholes alifáticos, los compuestos fenólicos y los componentes del
espacio de cabeza, de particular importancia en lo que respecta a las características
organolépticas y de calidad del aceite de oliva virgen (Pannelli et al., 1994). También se ha
observado que aceites procedentes de la misma variedad y cultivados en distintas áreas
geográficas presentan características significativamente diferentes respecto a la
composición aromática, concentración de compuestos fenólicos y composición acídica
(Ranalli et al., 1997), mostrando que la tipicidad de los aceites está definida también por la
zona de producción y consecuentemente por factores climáticos y edafológicos (De Torres,
2013).
Tesis Doctoral
77
2.- Antecedentes
2.5.1.2.- Factores agronómicos extrínsecos
Estado de maduración del fruto
El periodo de crecimiento y desarrollo del fruto del olivo se puede establecer en
unos 200 días como cifra media, siguiendo, como en la mayoría de las drupas, una curva
doble sigmoidal, con una etapa de latencia inicial y otra final. Se produce una primera fase
de crecimiento rápido en la que el endocarpio es el principal tejido en desarrollo. En una
segunda fase, de crecimiento lento, el endocarpio se endurece progresivamente y tanto el
embrión como el hueso alcanzan su tamaño final que ya no varía. La tercera fase, de
crecimiento rápido debido al aumento de tamaño de las células de la pulpa, determina el
tamaño real del fruto. En esta fase comienza la biosíntesis del aceite y su acumulación se
reduce de manera progresiva, siendo éste el proceso de maduración (Hermoso et al.,
1999).
Cuando el fruto está completamente desarrollado, la pulpa representa un 70-90%, el
hueso un 9-27% y la semilla (alojada en el interior del hueso) un 2-3% del peso total del
fruto. Los componentes mayoritarios de la pulpa y de la semilla son el agua y el aceite. En
la pulpa, el agua representa un 50-60% y el aceite un 20-30%. En la semilla, los contenidos
de agua y aceite tienen valores del orden del 30 y del 27% respectivamente. Por su parte,
el hueso tiene contenidos medios más bajos, del orden del 9% de agua y menos del 1% de
aceite. Además, presentan cantidades variables de azúcares, polisacáridos y proteínas.
En el aceite se producen cambios en la proporción de componentes menores,
aunque las tendencias a lo largo de la maduración varían según las diferentes familias
químicas. En el caso de los ácidos grasos, se ha observado una disminución del ácido
palmítico y un aumento del ácido linoleico; el contenido en polifenoles y el grado de
amargor alcanzan un máximo cuando la mayoría de los frutos están en envero,
disminuyendo conforme avanza la maduración; el contenido en tocoferoles y esteroles
presenta una tendencia a disminuir durante el periodo de maduración (Uceda y Hermoso,
1999; Civantos, 2009).
Durante el desarrollo del fruto se producen una serie de cambios que pueden
utilizarse como indicadores más o menos específicos de la maduración. Uno de ellos es la
variación del color del fruto. La aceituna, que al principio tiene color verde, vira a un color
amarillento como consecuencia de una fuerte reducción del contenido en clorofilas.
Después comienza la acumulación de antocianinas aumentando su concentración en las
Tesis Doctoral
78
2.- Antecedentes
células y la intensidad del color, que puede ir del rojizo al violáceo intenso y al negro
(Vázquez-Roncero y Maestro, 1970). En la mayoría de las variedades, la coloración de la
piel comienza en el ápice (inicio del envero) y continúa hacia el extremo opuesto junto al
pedúnculo (final del envero). Después comienza a colorearse el mesocarpio, desde la parte
más exterior hasta que el color violáceo llega al hueso. Se considera como periodo de
maduración, según este criterio, el tiempo transcurrido desde la aparición de las manchas
violáceas, hasta la coloración definitiva de la piel (Humanes y Civantos, 1992), siendo
dicho tiempo variable y estando afectado por las características varietales y las condiciones
climáticas.
Se ha estudiado la evolución de los pigmentos cloroplásticos (clorofilas y
carotenoides) en los frutos de las variedades “Hojiblanca”, “Manzanilla”, “Picual” y “Picudo”,
observándose que el descenso paulatino y homogéneo de la concentración de cada
pigmento a medida que avanza la maduración, es lo que provoca los cambios de color de
los frutos. A partir del estado de envero (aceitunas “pintonas”), en el que se produce el
cambio cromático, las clorofilas decrecen más rápidamente que los carotenoides, dando
paso, como se ha dicho anteriormente, a otro tipo de compuestos coloreados, las
antocianinas (Mínguez-Mosquera y Garrido-Fernández, 1986a; Mínguez-Mosquera et al.,
1990; Hidalgo et al., 1993).
En el caso del aceite, se produce también una considerable disminución del
contenido en pigmentos. En los aceites obtenidos durante el periodo de maduración de
aceitunas de siete variedades de la zona del Montsiá (Tarragona), se puso de manifiesto
que, en los primeros meses, se produce una brusca disminución del contenido en
pigmentos carotenoides (determinados por la medida espectrofotométrica a 450 nm). Esta
reducción pasa a ser más suave posteriormente, que según los autores podría deberse,
principalmente, a dos fenómenos: las oxidaciones que inevitablemente afectan a este tipo
de estructuras, y la dilución de los pigmentos debida al aumento del rendimiento en aceite
una vez que se detiene la síntesis de carotenoides en las etapas iniciales de maduración
(López et al., 1986).
De forma paralela a lo que ocurre en la aceituna, otros autores también han
observado en aceites procedentes de las variedades “Hojiblanca” y de la italiana “Frantoio”
que a lo largo del proceso de maduración hay una ostensible disminución tanto de
clorofilas como de carotenos (β-caroteno), aunque la relación carotenos/clorofilas tiende a
aumentar de forma considerable (Mínguez-Mosquera et al., 1990; Garrido et al., 1990a;
Garrido et al., 1990b; Caselli et al., 1993). A la misma conclusión llegan otros autores, que
Tesis Doctoral
79
2.- Antecedentes
además estudian la correlación existente entre la concentración de pigmentos y las
características del color de los aceites, observando que los parámetros cromáticos
disminuyen con la maduración, planteándose la posibilidad de obtener índices de color que
permitan la clasificación de los aceites según el origen y la variedad de la aceituna
(Mínguez-Mosquera y Garrido-Fernández, 1991).
En un estudio sobre la calidad de los aceites de la Denominación de Origen
catalana “Borjas Blancas” durante 5 campañas, se observó que cuando se utilizaba el
sistema continuo de elaboración los índices de clorofilas y carotenos eran mayores al
principio que al final de campaña, mientras que, al parecer, en el sistema de prensa ocurría
al contrario (Graell et al., 1992). Sin embargo, estudiando la calidad del aceite de oliva
virgen de la Denominación de Origen “Les Garrigues” (Lérida), durante la campaña
1995/1996, se observó que el color se mantenía dentro de los tonos del amarillo y no había
diferencias importantes entre aceites de principio y final de campaña (Motilva et al., 1998),
en contra de lo observado en algunas campañas precedentes como la 1992/93, en la que
los aceites de principio presentaron colores más verdosos que los del final (Solé, 1995).
Esto se atribuyó a la climatología anómala de la campaña estudiada que propició un
avanzado estado de madurez de las aceitunas en el inicio de la recolección.
En general, se considera que las variedades de maduración escalonada mantienen
el color verde del aceite relativamente más tiempo que las de maduración precoz, incluso
cuando la recolección se efectúa en épocas más avanzadas. La variación y la atenuación
del color del aceite dependen, en realidad, de la velocidad de caída del cromoplasto del
fruto, donde la clorofila puede estar presente pero enmascarada por otros pigmentos
neoformados no liposolubles (Fiorino y Nizzi, 1991).
Los polifenoles totales y los compuestos volátiles van aumentando a lo largo del
ciclo de maduración del fruto, presentando máximos en el momento en que el árbol ofrece
la mayor cantidad de aceitunas en envero, para disminuir apreciablemente a continuación
(Civantos, 2009).
Condiciones de cultivo
Las condiciones climáticas y la zona de producción del olivar ejercen también
influencia en las características de los aceites. En un estudio sobre la influencia ejercida
por el clima en alguna variedad de olivo portugués se encontró que existía una cierta
variación en el color del aceite de una región a otra, observando además una gran
Tesis Doctoral
80
2.- Antecedentes
influencia de las condiciones ambientales unidas a las de extracción (Vidal y Lefévre,
1945). Sin embargo, posteriormente, estudiando la variación regional del color de los
aceites vírgenes portugueses, no fue posible la delimitación de zonas utilizando técnicas
estadísticas multivariantes como el análisis de componentes principales. Los resultados
obtenidos pusieron de manifiesto que son ciertos factores regionales, como el estado
sanitario y de maduración de las aceitunas, procesos tecnológicos, etc., los principales
responsables de las diferencias de color en los aceites vírgenes portugueses
(Vasconcelos, 1985).
Por otra parte, se ha encontrado que los aceites de la variedad “Arbequina”
producidos en Andalucía, Aragón y en la zona de la Denominación de Origen “Les
Garrigues” son más verdosos que los de otras zonas estudiadas (Tous et al, 1997). Los
aceites del tipo “Les Garrigues”, “Siurana-Montsant” y de Aragón se diferencian
principalmente, respecto de los del tipo “Siurana-Camp” y de Andalucía, por tener un color
amarillo más intenso.
De forma generalizada se atribuye al cultivar la capacidad de aportar a los aceites
unas características peculiares y diferenciales, que son apreciadas por consumidores y
catadores expertos, distinguiéndolos por su origen.
La influencia conjunta de estos factores, variedad y medio agrológico, puede verse
reflejada en las características peculiares, el color entre ellas, de los aceites que
pertenecen a las diferentes Denominaciones de Origen: los de “Siurana” y “Les Garrigues”,
de color verdoso cuando son de recolección temprana y de color amarillo los de
recolección tardía, son considerados como productos especiales de inconfundible aroma,
color y sabor, bien diferenciados de otros aceites; en los aceites de “Baena” el color oscila
entre el verde intenso y el amarillo dorado; los de “Sierra de Segura” son de color amarillo
verdoso; en los de “Priego” se diferencian los tipos “Picudo”, de color amarillo, “Hojiblanca”,
de color amarillo dorado, y “Picual”, de color amarillo verdoso (Consejería de Agricultura y
Pesca, 1966, 1993, 1995 ; Ministerio de Agricultura, 1977, 1979).
Época de recolección
La elección del momento adecuado de recolección es fundamental para la
elaboración de un aceite de calidad. De esta decisión dependerán en gran medida las
características del aceite obtenido. Obviamente, un factor a tener en cuenta sería la
finalización del periodo de formación del aceite en el fruto. Para la variedad “Picual” se
Tesis Doctoral
81
2.- Antecedentes
considera que el aceite está completamente formado cuando el fruto alcanza un índice de
madurez con valores próximos al 3,5, lo que se corresponde con el momento en que la
mayoría de los frutos se encuentran en envero, pocos están negros y aún quedan frutos de
color verde-amarillento. En este punto se podría pensar que los frutos en el árbol aún
verdes pudieran aumentar su contenido en aceite si se retrasa la recolección. Beltrán et al.,
(2005) observaron que cuando se había alcanzado este grado de madurez de los frutos el
contenido graso sobre materia seca se había estabilizado, no observándose diferencias en
el contenido graso sobre materia seca de la pulpa (De Torres, 2013). Un retraso en la
época de recolección y, en consecuencia, un incremento en el grado de maduración del
fruto conlleva la disminución de determinados componentes como los compuestos
fenólicos (Beltrán et al., 2005).
Riego
El olivar se ha cultivado tradicionalmente en condiciones de secano. Es un cultivo
bien adaptado a los secanos mediterráneos, con producciones aceptables, y capaz de
sobrevivir a periodos de intensa sequía. Sin embargo, desde hace tiempo se ha
comprobado experimentalmente que la práctica del riego aumenta considerablemente el
rendimiento del olivar, incluso cuando las aportaciones de agua son muy reducidas (Orgaz
y Fereres, 2004). El riego de los olivos es un factor decisivo en la composición de los
aceites, fundamentalmente en cuanto a los componentes antioxidantes se refiere.
Se ha estudiado el efecto de la aplicación de diferentes estrategias de riego al olivo
de la variedad “Arbequina” sobre la composición del aceite, encontrándose que los aceites
que procedían de los frutos de árboles más regados, contenían menos cantidad de
pigmentos (clorofílicos y carotenoides), atribuyéndose este hecho a que al aumentar el
volumen de agua aplicada al olivo, las pastas que se obtienen son más fluidas, por lo que
atravesarían las cribas del molino con más facilidad, sufriendo sus tejidos un menor daño y
produciéndose una menor extracción de pigmentos, localizados principalmente en el
epicarpio de los frutos (Tovar et al., 2001). Sin embargo, otros autores indican que el
contenido en pigmentos de los aceites procedentes de frutos de la variedad “Cornicabra”,
no se ve influenciado por el riego (Gómez-Rico et al., 2007).
En cuanto al contenido en α-tocoferol presente en el aceite de oliva, no se aprecian
diferencias significativas en su concentración con el riego del olivar para las variedades
“Cornicabra”, “Arbequina” y “Morisca” (Tovar et al., 2001; Gómez-Rico et al., 2007, 2009).
Tesis Doctoral
82
2.- Antecedentes
El contenido total en polifenoles, atendiendo a los trabajos desarrollados hasta
ahora donde se relaciona riego y calidad, casi siempre permite diferenciar los aceites
producidos en riego de los de secano. Normalmente, el contenido en polifenoles aumenta
significativamente al reducirse la cantidad de agua de riego aportada, siendo máximo en el
olivar no regado. Esta tendencia ha sido observada por diferentes autores en distintas
variedades y zonas de cultivo, como la variedad “Kalamata” en Italia (Patumi et al., 2002),
“Leccino” en Italia (Gucci et al., 2004), “Arbequina” en Cataluña (Tovar et al., 2002),
“Arbequina” en EE.UU. (Berenguer et al., 2006) y también la variedad “Picual” en la
provincia de Jaén (Salas et al., 1997).
Plagas y enfermedades
Las plagas y enfermedades del olivo inciden negativamente sobre la calidad de los
aceites y, en particular, la infección por la mosca del olivo (Bactrocera oleae) origina
aceites con un menor contenido en compuestos fenólicos (Zunin et al., 1995).
El empleo de algunos inductores de autodefensa del olivo (Brotomax) parece
originar un mayor contenido de compuestos fenólicos en los aceites de diferentes
variedades (Botia et al., 2001).
Las plagas y enfermedades pueden alterar el color del aceite, destacando el caso
del Colletotrichun gloesporiodes, que produce una alteración conocida como aceituna
jabonosa, y que incide directamente en la calidad, produciéndose aceites de coloraciones
rojizas y elevada acidez, que aumenta linealmente con el porcentaje de frutos atacados
(Civantos et al., 1999; Trapero y Blanco, 1999).
Se ha observado que la utilización de determinadas sustancias que ayudan a la
separación de la aceituna del pedúnculo también produce cambios de color en los aceites.
Se obtienen aceites más amarillos si se utiliza ácido oleico y más verdes en el caso de
otros compuestos liberadores de etileno (Petruccioli, 1971).
Por otro lado, el sistema de recolección y los mecanismos de limpieza que se
utilicen pueden influir en la cantidad de hojas que acompañen a la aceituna en el momento
de su elaboración. Se ha estudiado el efecto de la adición de determinadas cantidades de
hojas a aceitunas maduras, sobre la calidad del aceite, encontrándose que el contenido de
pigmentos clorofílicos aumenta con la cantidad de hojas añadidas (Di Giovachino et al.,
1996).
Tesis Doctoral
83
3. OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN
DE LOS ACEITES DE OLIVA VÍRGENES
EXTRA ENRIQUECIDOS CON
ANTIOXIDANTES
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
3.1.- INTRODUCCIÓN
En el presente capítulo se ha procedido a preparar y adicionar el extracto de
antioxidantes (cuya composición en % en peso es: 13,3% de β-caroteno, 0,25% de
luteína y 1% de otros carotenoides) a diferentes aceites de oliva vírgenes extra (AOVE´s),
estudiando cómo varía el color, a medida que va aumentando la concentración del
extracto. Así, se ha utilizado un extracto de antioxidantes cuya concentración en luteína
es de 2,3 mg/ml, y se han realizado sucesivas adiciones hasta llegar a concentraciones
de luteína en los AOVE´s de 0,16 mg/ml (174,3 mg luteína/kg aceite), considerando
aceites con una densidad media de 0,918 kg/L, conforme a nuestras medidas, es decir,
se han alcanzado concentraciones de luteína entre 22 y 87 veces superiores a las que
presentan los aceites de oliva no enriquecidos (2-8 mg luteína/kg aceite) (Baeten et al.,
2001; Cichelli y Pertesana, 2004; Aparicio Ruiz et al., 2011).
3.2.- MATERIALES Y MÉTODOS
3.2.1.- MICROALGA SCENEDESMUS ALMERIENSIS
La microalga clorofícea Scenedesmus almeriensis (Imágenes 3.1 y 2.5) se ha
catalogado como una nueva especie, habiendo sido caracterizada genéticamente en la
Universidad de Göttingen (Alemania). Ha sido aislada por el Departamento de Ingeniería
Química de la Universidad de Almería y depositada en la Colección de Cultivos de Algas
y Protozoos (CCAP) con el código CCAP 276/24. Esta especie ha sido patentada por la
Universidad de Almería y la Fundación Cajamar para la producción industrial de luteína y
extractos ricos en luteína de aplicaciones biotecnológicas. Se trata de una microalga
termófila que muestra una temperatura óptima de crecimiento de 35 ºC y soporta
temperaturas de hasta 48 ºC, lo que la hace especialmente apta para su producción en
exteriores (Sánchez et al., 2008b). Esta microalga es también tolerante a elevadas
irradiancias de hasta 1.625 microE/(m2·s), llegando a acumular hasta el 1% de su peso
en luteína. Su velocidad de crecimiento es alta en comparación con otras especies de
microalgas, lo que reduce el riesgo de contaminaciones en los cultivos. La productividad
de biomasa en las instalaciones de Almería llega a valores de hasta 0,95 g/(L·día), siendo
la productividad de luteína de hasta 5,3 mg/(L·día) (Sánchez et al., 2008a).
Tesis Doctoral
84
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Imagen 3.1
Imágenes de S. almeriensis tomadas mediante microscopio óptico y electrónico.
3.2.2.- ACEITES DE OLIVA VÍRGENES EXTRA
Se han utilizado AOVE´s procedentes de diferentes variedades de aceituna,
concretamente “Picual”, “Arbequina”, “Hojiblanca”, “Frantoio” y “Royal”. Los aceites se
han obtenido comercialmente y proceden mayoritariamente de la provincia de Jaén,
aunque también se han estudiado algunos AOVE´s de las provincias de Granada,
Córdoba y Málaga. Concretamente la Tabla 3.1 muestra las características principales de
los 15 aceites estudiados, incluyendo sus coordenadas CIELAB para muestras medidas
en espectrofotómetro con cubetas de espesor 1 cm suponiendo iluminante CIE D65 y
observador patrón CIE 1931. La Figura 3.1 muestra las coordenadas de color de todos
los aceites en el plano a*b* (los valores de la coordenada L* de cada aceite se han
redondeado, para mejor visualización). Puede observarse que los valores de L* son altos
(oscilando entre 79 y 89), los valores de a* son bajos (oscilando entre -1 y 7), y
finalmente los valores de b* son muy altos oscilando en un rango relativamente más
amplio que el de las otras dos coordenadas de color (entre 102 y 123). Los ángulos de
tono CIELAB (hab) de estos 15 aceites oscilan en un pequeño rango comprendido entre
86,8° y 90,5°, mientras que los valores de croma CIELAB (C*ab) son muy altos y similares
a los valores de la coordenada b*.
Tesis Doctoral
85
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Tabla 3.1
AOVE´s utilizados en las experiencias de enriquecimiento con extracto de antioxidantes
procedente de la microalga S. almeriensis. Las 3 últimas columnas muestran los
parámetros colorimétricos de los distintos aceites (L*, a*, b*) medidos en cubeta de
espesor 1 cm, suponiendo iluminante CIE D65 y observador patrón CIE 1931.
Aceite Procedencia Variedad de aceituna L* a* b*
A: Fuenroble (FR) Jaén Picual 78,8 6,9 123,1
B: Santuario de Mágina (SM) Jaén Picual 81,9 5,1 122,3
C: Oro Bailén (OB) Jaén Picual 83,7 1,8 119,2
D: Oro de Génave (OG) Jaén Picual 86,4 2,6 120,5
E: Hojiblanca Málaga Hojiblanca 87,8 1,7 111,8
F: La Cántara Jaén Picual 87,5 0,3 107,9
G: Melgarejo Jaén Picual 88,8 1,3 109,0
H: Carbonell Nacional Picual 88,0 0,7 105,3
I: Garay Córdoba Arbequina 88,2 0,7 102,6
J: Baena Córdoba Picual 88,8 0,5 102,1
K: Abades Granada Picual 89,1 -0,03 102,7
L: Castillo Canena Picual (CCP) Jaén Picual 80,3 3,1 121,0
M: Castillo Canena Arbequina (CCA) Jaén Arbequina 81,7 -1,1 118,3
N: Castillo Canena Frantoio (CCF) Jaén Frantoio 86,2 3,3 116,3
P: Castillo Canena Royal (CCR) Jaén Royal 80,1 4,9 121,5
Figura 3.1
Coordenadas CIELAB de los 15 AOVE’s (Tabla 3.1) medidos en cubetas de espesor 1 cm bajo
iluminante CIE D65 y observador patrón CIE 1931.
Tesis Doctoral
86
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
A título de ejemplo, la Imagen 3.2 muestra algunos de los diferentes AOVE´s
ensayados antes de las adiciones de extracto de antioxidantes.
G B H E
Imagen 3.2
Algunos de los AOVE´s empleados en las experiencias de enriquecimiento en antioxidantes: G, B,
H y E (según Tabla 3.1).
3.2.3- EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL EXTRACTO DE ANTIOXIDANTES
Se han estudiado diferentes metodologías para la obtención del extracto, siendo la
que mejores resultados ha arrojado, la extracción con hexano. Antes de la recuperación
de los antioxidantes se ha estudiado también el proceso de ruptura celular, habiendo
ensayado metodologías tales como: ultrasonidos, presión, congelación-descongelación y
molino de bolas. Los mejores resultados se han obtenido usando molino de bolas con los
siguientes parámetros de operación: 10 minutos de molienda, utilizando bolas de 2,8 cm
de diámetro y adicionando alúmina como coadyudante.
La Imagen 3.3 muestra el esquema general del proceso de extracción y
purificación utilizado.
Con el fin de eliminar el hexano se ha utilizado un rotavapor y se ha obtenido un
concentrado en antioxidante de intenso color rojo-anaranjado. A continuación, para
estabilizar los carotenoides se recomienda solubilizarlos en aceite de oliva virgen extra,
obteniendo de esta forma una disolución con una concentración de luteína igual a 2,3
mg/ml (Imagen 3.4). Este producto puede ser usado directamente como complemento en
luteína y otros carotenoides o en la formulación de alimentos especiales para consumo
humano o animal.
Tesis Doctoral
87
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Imagen 3.3
Esquema global para la obtención del extracto de antioxidantes
Imagen 3.4
Extracto de antioxidantes (2,3 mg/ml de luteína) en AOVE tras la eliminación de disolvente
en rotavapor.
Tesis Doctoral
88
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
3.2.4.- OBTENCIÓN DE ACEITES ENRIQUECIDOS CON ANTIOXIDANTES
La composición del extracto, tal y como se ha mencionado anteriormente, es de:
14,55% en peso de antioxidantes (13,3% de β-caroteno, 0,25% de luteína y 1% de otros
carotenoides) obtenido mediante HPLC.
Para realizar el cromatograma del extracto de antioxidantes (Figura 3.2), se ha
utilizado una columna Phenomenex Luna C18, cuyas medidas son 250 mm x 2,5 mm. El
análisis se realizó a 23 ºC con un gradiente lineal durante 30 minutos. La fase móvil
utilizada fue agua-metanol (80%) con 0,05% de trietilamina y 20% de acetato de etilo (con
0,05% de trietilamina) con un caudal de 1 ml/min.
Para obtener la concentración en mg/ml de los distintos carotenoides se ha
calculado la densidad del extracto, mediante picnometría, obteniéndose los siguientes
resultados:
- ρ extracto de antioxidantes= 0,907 g/ml
- ρ aceite= 0,918 g/ml
- Carotenoides totales: 132,43 mg/ml
- β- caroteno: 121,03 mg/ml
- Luteína: 2,3 mg/ml
- Otros: 9,1 mg/ml
Tesis Doctoral
89
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
c)
b)
a)
d)
Figura 3.2
Cromatogramas del AOVE “C” sin enriquecer (a), AOVE “C” enriquecido con 0,05 mg/ml
(b), AOVE “C” enriquecido con 0,1 mg/ml (c) y del extracto de antioxidantes (d). L= Luteína, PI=
Patrón interno, B= β-caroteno
Tesis Doctoral
90
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Una vez obtenido el extracto de antioxidantes, procedente del correspondiente
tratamiento de la biomasa de la microalga Scenedesmus almeriensis, se ha procedido a
caracterizar los diferentes aceites. Puesto que en este extracto hay un 0,25% de luteína
en peso, el extracto tiene 2,3 mg de luteína/ml.
Con la idea de incorporar al organismo humano una cantidad de luteína suficiente
para la prevención de las enfermedades asociadas a su déficit, que está comprendida
entre 3 y 6 mg/día (Jhonson Down et al., 2002, Krinsky et al., 2003; Silva, 2004), se han
preparado aceites con concentraciones de luteína comprendidas entre 0,02 y 0,16 mg/ml
de aceite. Teniendo en cuenta que en España el consumo medio de AOVE por habitante
y día según COI, (2011) es de 36 ml, con las muestras de aceite preparadas de esta
manera se aportarían al organismo entre 0,72 - 5,76 mg de luteína por día. (Tablas 3.2,
3.3, 3.4 y 3.5). En este sentido, para el resto de estudios realizados (foto-estabilidad y
termo-estabilidad) se han elegido aceites con dos concentraciones de trabajo: 0,05 y 0,1
mg luteína/ml de aceite, que están dentro del rango anteriormente señalado (0,02 – 0,16
mg/ml aceite), apareciendo en las Tablas 3.2, 3.3, 3.4 y 3.5 sombreadas las líneas
correspondientes a estas dos concentraciones. Con estas concentraciones se aportarían
al organismo 1,8 y 3,6 mg de luteína, respectivamente, con 36 ml de ingesta de AOVE
diaria. Estas cantidades sumadas a las ingeridas con el resto de alimentos de la dieta
mediterránea, permitirían alcanzar las cantidades de luteína recomendadas para la
prevención de las enfermedades asociadas a su déficit (3-6 mg/día) (Krinsky et al., 2003;
Silva, 2004).
Para alcanzar las concentraciones mencionadas de 0,05 y 0,1 mg luteína/ml de
aceite se han pipeteado 311 y 636 µl, respectivamente, de nuestro extracto de
antioxidantes y se han llevado a cubetas de 14 ml de AOVE, para las determinaciones de
color con el espectrofotómetro descritas en la siguiente sección:
∗ , í
í= 0,05 ; x = 0,311 ml = 311 μl extracto Ecuación 3.1
∗ , í
í= 0,1 ; x = 0,636 ml = 636 μl extracto Ecuación 3.2
Tesis Doctoral
91
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
3.2.5.- CARACTERIZACIÓN DEL COLOR DE LOS AOVE´S
La determinación espectrofotométrica del color permite caracterizar y monitorizar
las muestras de AOVE´s. Concretamente, las medidas de color se han realizado con un
espectrofotómetro Konica Minolta CM-5 conectado a un ordenador dotado del software
SpectraMagic NX PRO USB. El equipo proporciona medidas en el espacio de color
CIELAB. Se ha supuesto iluminante D65 y observador patrón colorimétrico CIE 1931 en
la realización de las medidas. Tras la correspondiente calibración del instrumento se
procedió a medir los parámetros de color para las muestras. Así, se colocaron 14 ml de
aceite en cubetas transparentes con unas dimensiones de 4,2 x 3,2 x 1,0 cm (paso de luz
de 1,0 cm). Tras la medida inicial para caracterizar el aceite original sin ninguna adición
de extracto de antioxidantes, se realizó el enriquecimiento mediante sucesivas adiciones
de 100 µl de nuestro extracto de antioxidantes, y se midieron los correspondientes
valores de los parámetros colorimétricos de cada muestra generada (L*, a*, b*), así como
las variaciones de los mismos con respecto al color al aceite original (ΔL*, Δa*, Δb* y
ΔE*ab).
Los resultados de diferencias de color usando fórmulas de diferencia de color más
avanzadas que CIELAB, como la reciente fórmula CIEDE2000 (ISO/CIE, 2014), son
cualitativamente similares a los obtenidos con CIELAB. El uso de CIELAB es suficiente
para nuestro propósito principal de monitorizar los cambios, que en nuestro caso no
tienen relación con un experimento visual de diferencias de color.
3.3.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.3.1.- EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ANTIOXIDANTES
En cuanto a la obtención del extracto de antioxidantes a partir de la biomasa seca,
se ha usado la técnica de extracción con disolventes biocompatibles. En este sentido, se
ha optimizado un método que incluye tres etapas: rotura celular, saponificación y
extracción. Hemos comprobado, que la rotura celular es necesaria con el fin de mejorar el
rendimiento de extracción y que la mejor alternativa para aplicaciones industriales es el
uso de un molino de bolas con los siguientes parámetros de operación: 10 minutos de
molienda, bolas de 2,8 cm de diámetro y adición de alúmina como coadyuvante, como se
ha mencionado anteriormente. El uso del molino de bolas asegura un ambiente cerrado
Tesis Doctoral
92
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
que previene la desnaturalización de la luteína por oxidación, aunque el impacto de las
bolas provoca calentamientos locales, que puede causar la desnaturalización de diversos
productos. Sin embargo, en la presente aplicación no ha ocurrido así ya que la biomasa
ha sido analizada antes y después del tratamiento, habiéndose comprobado la integridad
del contenido en extracto de antioxidantes.
Por lo que se refiere a la etapa de saponificación, se ha determinado que las
condiciones óptimas son la saponificación durante 5 minutos a una temperatura de 40 ºC
utilizando una solución de KOH al 4% (40 g/L) y una concentración máxima de biomasa
de 100 g/L. Se ha observado que la saponificación durante un tiempo mayor o a
concentraciones de KOH superiores, reduce el rendimiento del proceso por degradación
de los antioxidantes, fundamentalmente de la luteína.
Finalmente, tras haber estudiado diferentes metodologías para la obtención del
extracto, se ha optimizado la extracción con hexano como disolvente biocompatible
aceptado para productos de uso alimentario. Para ello, se ha propuesto un proceso de
extracción y una proporción en volumen 1:1 de hexano y de muestra, habiendo estudiado
el número de extracciones óptimo, que ha resultado ser de ocho, el cual permite
recuperar el 95% de la luteína contenida en la biomasa (Figura 3.3).
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0 2 4 6 8 10 12
Número de extracción
Figura 3.3
Representación del % de luteína recuperada frente al nº de extracciones.
Tesis Doctoral
93
% Luteína
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
3.3.2.- OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN COLORIMÉTRICA DE AOVE´S
ENRIQUECIDOS CON ANTIOXIDANTES
Una vez obtenido el extracto de antioxidantes (cuya concentración de luteína es
2,3 mg/ml), se ha procedido a caracterizar colorimétricamente los diferentes AOVE´s
adquiridos con distintas denominaciones de origen (Tabla 3.1). Se puede observar que
algunos aceites, como por ejemplo, los aceites “Melgarejo” y “Carbonell” (designados
como “G” y “H” en la Tabla 3.1 y Figura 3.1) tienen coordenadas de color muy parecidas,
pero aun así interesa estudiar el cambio de color que las adiciones de extracto producen
en cada uno de ellos, ya que su composición química es muy diferente, como puede por
ejemplo inferirse de su diferente grado de acidez.
Tras cada una de las adiciones de 100 µl de extracto de antioxidantes a 14 ml de
muestra de cada tipo de aceite, se homogeniza la muestra de aceite enriquecido y se
mide el color en el espectrofotómetro, obteniéndose los parámetros correspondientes a
las muestras generadas y las diferencias de color (ΔE*ab) con el aceite original, al que no
se había añadido ningún antioxidante. En las Tablas 3.2, 3.3, 3.4 y 3.5 se muestran los
datos correspondientes a los AOVE´s “Santuario de Mágina”, “Hojiblanca”, “Melgarejo” y
“Carbonell” (designados como “B”, “E”, “G” y “H”, respectivamente en la Tabla 3.1 y
Figura 3.1; véase también la Imagen 3.2), que fueron seleccionados para este ensayo
acumulativo de adiciones.
Los resultados obtenidos muestran cómo con la primera adición de extracto, el
color amarillo-verdoso de los AOVE´s originales se modifica, en el sentido de que su
claridad L* disminuye (se obtienen aceites más oscuros), y sus coordenadas a* y b*
aumentan ambas (aunque en mayor cuantía la coordenada a*), de forma que el ángulo
de tono disminuye y el croma aumenta (es decir, el aceite tras la primera adición de
extracto de antioxidantes presenta un color más anaranjado y saturado).
Tesis Doctoral
94
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Tabla 3.2
Parámetros colorimétricos en la adición de extracto de antioxidantes sobre el AOVE “Santuario de
Mágina”. Extracto de antioxidantes [luteína]= 2,3 mg/ml. Volumen inicial de aceite en cubeta=14
ml. ρaceite=0,918 g/ml (Aparicio et al., 2011).
Extracto de
mg
antioxidantes ΔE* [luteína]
Muestra L* a* b* ab± luteína/kg adicionado σ = 0,028 mg/ml
aceite
(µl)
0 - 81,9 5,1 122,3 - -
1 123 79,7 11,5 129,2 9,6 0,02 21,7
2 185 77,8 16,2 128,6 13,4 0,03 32,7
3 311 76,4 19,6 127,2 16,3 0,05 54,5
4 439 74,9 23,3 125,8 19,8 0,07 76,3
5 504 73,9 25,5 124,3 22,1 0,08 87,1
6 636 72,8 27,3 123,1 24,0 0,10 108,9
7 771 71,9 29,0 121,8 25,9 0,12 130,7
8 839 71,1 30,2 120,8 27,4 0,13 141,6
9 977 70,2 31,7 119,5 29,2 0,15 163,4
10 1047 69,4 32,9 118,2 30,8 0,16 174,3
Estos cambios de color eran de esperar, teniendo en cuenta el color oscuro y
fuertemente rojo-anaranjado del extracto de antioxidantes adicionado. A medida que
añadimos más cantidad de extracto de antioxidantes el color del aceite sigue cambiando,
de modo que con crecientes cantidades de extracto de antioxidantes adicionado, los
aceites tienden a oscurecerse (L* disminuye) y a hacerse aún más anaranjados-rojizos
(disminuye el ángulo de tono), mientras que su saturación se mantiene en valores muy
altos, ligeramente superiores a los iniciales en la mayoría de los casos. El parámetro
∆E*ab es el que indica la diferencia de color entre dos muestras sujetas a comparación.
Así, analizando el valor de ∆E*ab, éste crece de forma continua conforme se adiciona
extracto y es interesante resaltar que de los 4 AOVE´s ensayados en esta sección, el que
genera menor variación del parámetro ∆E*ab es el correspondiente a “Santuario de
Mágina” (Tabla 3.2).
Tesis Doctoral
95
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
La Figura 3.4 muestra los cambios de color en el plano a*b* para los 4 aceites
(los valores de la coordenada L* son los números que aparecen junto a cada punto,
habiéndose redondeado aquí los valores de las medidas de L* al número entero más
próximo para facilitar la visualización), considerando las sucesivas adiciones de extracto
realizadas al aceite natural original, cuyas coordenadas se indican mediante flechas
rojas. Se puede observar que los colores de los 4 aceites siguen una tendencia similar
con la adición del extracto (quizá el más discrepante sería el Santuario de Mágina,
porque su color inicial es diferente al de los otros tres aceites): La claridad L* disminuye,
la coordenada a* crece constantemente y de manera considerable (color más rojizo), la
coordenada b* sigue una tendencia “parabólica”, con un fuerte crecimiento inicial hasta
un cierto máximo, tras el cual empieza a decrecer suavemente. Se puede también
observar que el cambio de color es más grande con las primeras adiciones que con las
últimas.
Figura 3.4
Cambios de color en el plano a*b* para los 4 aceites considerando diferentes adiciones de
extracto. Las flechas rojas indican las posiciones de los aceites originales (sin extracto). Los
números corresponden a la tercera coordenada CIELAB, L* (valores redondeados al entero más
próximo).
Tesis Doctoral
96
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Una forma alternativa y más clara de interpretar el resultado de la Figura 3.4 es
considerar separadamente los cambios en los 3 atributos perceptivos del color para el ojo
humano: claridad (L*), tono (hab) y croma (C*ab). Con este fin, las Figuras 3.5 y 3.6
muestran las evoluciones del color de los aceites (cuyos colores originales se señalan de
nuevo con flechas rojas) en los planos tono-claridad y tono-croma de CIELAB, al ir
añadiendo distintas cantidades del extracto de antioxidantes. Como se puede apreciar,
las adiciones hacen decrecer el ángulo de tono hab desde un valor inicial en torno a 90
grados (tonalidades amarillentas) hacia valores menores (tonos más rojizos), como cabía
esperar por el color del extracto añadido, mientras que la claridad disminuye de forma
continua con las adiciones (o sea, las muestras se hacen más oscuras, como también era
de esperar) y el croma sigue la tendencia “parabólica” antes mencionada para b* (un
crecimiento fuerte inicial hasta lograr un máximo y a partir de ahí un decrecimiento que
podríamos considerar levemente asintótico).
Figura 3.5
Evolución del color de los 4 aceites con diferentes adiciones de extracto, en el plano CIELAB con
coordenadas ángulo de tono y claridad. Las flechas rojas indican las posiciones de los aceites
originales (sin extracto).
Tesis Doctoral
97
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Figura 3.6
Evolución del color de los 4 aceites con diferentes adiciones de extracto, en el plano CIELAB con
coordenadas ángulo de tono y croma. Las flechas rojas indican las posiciones de los aceites
originales (sin extracto).
En las Tablas 3.2, 3.3, 3.4 y 3.5, se observa que el efecto de la adición de extracto
de antioxidantes para cuatro de los AOVE´s ensayados es similar, si bien destaca un
poco más la trayectoria correspondiente al aceite “B” “Santuario de Mágina” (Tabla 3.2)
ya que el cambio de color con la primera adición de extracto es de 9,6 unidades CIELAB,
bastante menor que el que se obtiene para los otros tres aceites (por encima de 20
unidades CIELAB). Esta diferencia entre el comportamiento colorimétrico de los aceites
estudiados, puede estar relacionada con el hecho de que el color inicial del AOVE
“Santuario de Mágina” es bastante diferente al de los otros aceites (ver Tabla 3.1). En
efecto, al ser su coordenada b* muy elevada (b*=122,3), la primera adición de extracto
difícilmente consigue aumentar aún más dicha coordenada, por lo que la diferencia de
color total que produce dicha adición es bastante menor que la que se observa en los
demás aceites. Por otra parte, como ya se apuntó previamente, la Figura 3.6 también nos
muestra que, salvo para el AOVE “Santuario de Mágina”, en las primeras adiciones de
extracto el color cambia más que en las últimas, es decir, el cambio de color con la
adición de extracto no es un proceso lineal, existiendo probablemente una cierta
tendencia asintótica o de estabilización del color a partir de cierta cantidad de luteína
adicionada (superior a la usada en nuestros experimentos). En cuanto a la naturaleza de
los cambios de color que produce la adición del extracto de antioxidantes a los AOVE’s,
en general se puede decir que el cambio mayor es debido al cambio de tono, seguido por
Tesis Doctoral
98
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
el cambio de croma (importante también en muchos casos), y finalmente al cambio en
claridad.
Tabla 3.3
Parámetros colorimétricos en la adición de extracto de antioxidantes sobre el AOVE “Hojiblanca”.
Extracto de antioxidantes [luteína]= 2,3 mg/ml. Volumen inicial de aceite en cubeta=14 ml.
ρaceite=0,918 g/ml (Aparicio et al., 2011).
Antioxidante ΔE* mg [luteína]
Muestra Adicionado L* a* b* ab± luteína/kg σ = 0,028 mg/ml
(µl) aceite
0 - 87,8 1,7 111,8 - -
1 123 84,8 10,2 132,5 22,6 0,02 21,7
2 185 82,5 16,5 134,9 27,9 0,03 32,7
3 311 80,6 21,2 133,6 30,2 0,05 54,5
4 439 78,9 24,8 132,2 32,1 0,07 76,3
5 504 77,6 27,5 130,6 33,6 0,08 87,1
6 636 76,6 29,6 129,2 34,7 0,10 108,9
7 771 75,8 31,1 128,2 35,7 0,12 130,7
8 839 74,7 32,9 126,6 37,0 0,13 141,6
9 977 73,7 34,3 125,2 37,9 0,15 163,4
10 1047 72,9 35,6 124,0 39,0 0,16 174,3
Tabla 3.4
Parámetros colorimétricos en la adición de extracto de antioxidantes sobre el AOVE “Carbonell”.
Extracto de antioxidantes [luteína]= 2,3 mg/ml. Volumen inicial de aceite en cubeta=14 ml.
ρaceite=0,918 g/ml (Aparicio et al., 2011).
Antioxidante ΔE* mg [luteína]
Muestra Adicionado L* a* b* ab± luteína/kg σ = 0,028 mg/ml
(µl) aceite
0 - 88,0 0,7 105,3 - -
1 123 84,6 10,3 131,9 28,5 0,02 21,7
2 185 82,3 17,1 134,7 34,1 0,03 32,7
3 311 80,3 21,8 133,2 35,8 0,05 54,5
4 439 79,0 24,8 132,2 37,2 0,07 76,3
5 504 77,8 27,1 130,6 38 0,08 87,1
6 636 76,7 29,6 129,3 39,2 0,10 108,9
7 771 75,4 31,5 127,6 40,0 0,12 130,7
8 839 74,6 32,9 126,6 40,9 0,13 141,6
9 977 73,6 34,5 125,0 41,6 0,15 163,4
10 1047 72,9 35,7 123,9 42,4 0,16 174,3
Tesis Doctoral
99
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Tabla 3.5
Parámetros colorimétricos en la adición de extracto de antioxidantes sobre el AOVE “Melgarejo”.
Extracto de antioxidantes [luteína]= 2,3 mg/ml. Volumen inicial de aceite en cubeta=14 ml.
ρaceite=0,918 g/ml (Aparicio et al., 2011).
Antioxidante ΔE* mg [luteína]
Muestra Adicionado L* a* b* ab± luteína/kg σ = 0,028 mg/ml
(µl) aceite
0 - 88,8 1,3 109,0 - - -
1 123 84,8 11,4 133,3 26,5 0,02 21,7
2 185 82,8 16,9 135,3 31,1 0,03 32,7
3 311 81,3 20,6 134,4 32,7 0,05 54,5
4 439 79,6 24,3 132,9 34,3 0,07 76,3
5 504 78,5 26,8 131,7 35,6 0,08 87,1
6 636 77,4 29,2 130,4 36,8 0,10 108,9
7 771 76,5 30,8 129,1 37,6 0,12 130,7
8 839 75,6 32,6 127,9 38,7 0,13 141,6
9 977 74,8 33,9 126,9 39,6 0,15 163,4
10 1047 74,1 35,2 125,7 40,4 0,16 174,3
Considerando las diferencias de color totales respecto al color de los aceites
originales, los resultados son los que muestra la Figura 3.7.
Figura 3.7
Diferencias de color CIELAB en 4 AOVE´s en función del enriquecimiento con extracto de
antioxidantes de los mismos.
Tesis Doctoral
100
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
La Tabla 3.6 muestra, a modo de resumen, los parámetros colorimétricos de todos
los AOVE´s utilizados y de los mismos adicionados con extracto hasta una concentración
en luteína igual a 0,1 mg/ml. Puede observarse que los aceites que cambian menos de
color tras la adición de extracto respecto del color original sin la adición de la misma, son
los cuatro primeros y los cuatro últimos de la Tabla 3.6, en donde los valores del
parámetro que indica la variación de color total se mantienen por debajo de 30 unidades
CIELAB. En el resto de aceites los valores son muy superiores, superando en los aceites
“I”, “J” y “K” las 40 unidades CIELAB de diferencia de color.
A la vista de los datos, puede deducirse que una adición de 600 µl de extracto de
antioxidantes genera AOVE´s con una concentración de luteína igual a 0,1 mg/ml,
concentración que haría que la ingesta media estimada por el COI (Comité Oleícola
Internacional) para la población de España, que es de 36 ml por persona y día, fuera
suficiente para incorporar los 3 mg de luteína que se estima que son necesarios para la
prevención de enfermedades degenerativas tales como las comentadas en el apartado
de introducción.
El color que se obtiene con la adición de extracto obviamente difiere del aceite
original sin enriquecer, aunque esta diferencia no es demasiado grande para el caso de
concentraciones 0,05 mg/ml y tiene algo más de importancia en aceites enriquecidos
hasta 0,1 mg/ml, en referencia a cantidad de luteína.
Para valorar la incidencia que estas variaciones colorimétricas pueden tener en
los consumidores, se ha abordado el ensayo de preferencia de color correspondiente al
capítulo 6 de esta Tesis Doctoral (Emociones y preferencias de color en AOVE´s
enriquecidos con antioxidantes. Estudios de apreciación visual de poblaciones
acostumbradas o no al consumo de aceite de oliva).
Tesis Doctoral
101
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Tabla 3.6
Parámetros colorimétricos de los AOVE´s originales y enriquecidos con luteína (0,1 mg/ml). La
última columna muestra las diferencias de color CIELAB para cada AOVE.
AOVE Procedencia L* a* b* ΔE*ab
78,81 6,91 123,13 -
A: Fuenroble (FR) Orcera (Jaén)
71,10 25,81 120,28 20,60
B: Santuario de 81,9 5,10 122,3 -
Huelma (Jaén)
Mágina (SM) 72,8 27,3 123,1 24,00
83,68 1,79 119,15 -
C: Oro Bailén (OB) Bailén (Jaén)
73,62 26,57 124,32 27,24
D: Oro de Génave 86,42 2,63 120,52 -
Génave (Jaén)
(OG) 76,70 27,31 129,05 27,86
87,8 1,69 111,8 -
E: Hojiblanca Antequera (Málaga)
76,6 29,6 129,2 34,7
87,39 0,33 107,96 -
F:La Cántara Cambil (Jaén)
76,41 28,5 128,8 36,68
88,8 1,30 109,0 -
G: Melgarejo Pegalajar (Jaén)
77,4 29,2 130,4 36,8
88,0 0,72 105,3 -
H: Carbonell Nacional
76,7 29,6 129,3 39,0
88,18 0,67 102,6 -
I: Garay Lucena (Córdoba)
77,40 27,9 130,17 40,22
88,75 0,46 102,14 -
J: Baena Baena (Córdoba)
76,82 29,18 129,51 41,43
89,08 -0,03 102,66 -
K: Abades Loja (Granada)
78,07 27,96 131,20 41,46
L: Castillo Canena 80,27 3,06 121,04 -
Baeza (Jaén)
Picual (CCP) 71,59 25,17 120,81 23,75
M: Castillo Canena 81,73 -1,10 118,34 -
Baeza (Jaén)
Arbequina (CCA) 72,79 22,57 122,59 25,66
N: Castillo Canena 86,47 3,31 116,3 -
Baeza (Jaén)
Frantoio (CCF) 77,67 26,2 130,33 28,25
P: Castillo Canena 80,11 4,88 121,54 -
Baeza (Jaén)
Royal (CCR) 72,02 25,3 121,62 21,96
Tesis Doctoral
102
3.- Obtención y caracterización de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
3.4.- CONCLUSIONES
Se han podido solubilizar cantidades adecuadas de extracto de antioxidantes en
los diferentes AOVE´s ensayados, prestando especial atención a los cambios de color
producidos por la adición del antioxidante como variable de monitorización y estudio. Se
ha procedido a adicionar extracto de antioxidantes a diferentes AOVE´s, estudiando cómo
varían los parámetros colorimétricos a medida que va aumentando la concentración de
luteína. En este sentido, se ha utilizado un extracto de luteína de concentración igual a
2,3 mg/ml, y se han realizado sucesivas adiciones de 100 µl de extracto hasta llegar a
concentraciones en los aceites de 0,16 mg/ml (174,3 mg luteína/kg aceite), es decir, se
han alcanzado concentraciones de luteína entre 22 y 87 veces superiores a las que
presentan los aceites de oliva no enriquecidos en luteína (2-8 mg luteína/kg aceite).
La adición de extractos confiere a los AOVE´s un color más amarillento-naranja,
debido a la concentración de los pigmentos, principalmente al β-caroteno.
Los resultados obtenidos muestran que enriqueciendo los aceites hasta una
concentración de 0,1 mg luteína/ml, se obtienen aceites con propiedades físico-químicas
y colorimétricas muy aceptables, que además permiten incorporar al organismo buena
parte de la ingesta diaria de luteína recomendada (6 mg), teniendo en cuenta el consumo
medio estimado de aceite de oliva por habitante y día para nuestro país (36 ml).
Tesis Doctoral
103
4. MEJORA DE LA ESTABILIDAD Y DE
LA FRACCIÓN DE CAROTENOIDES EN
AOVE´s MEDIANTE LA ADICIÓN DE
EXTRACTOS PROCEDENTES DE LA
MICROALGA SCENDESMUS
ALMERIENSIS
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
4.1.- INTRODUCCIÓN
Actualmente, el consumo de frutas y verduras en todo el mundo es un motivo de
preocupación constante. De acuerdo con Pomerleau et al., (2004), en el año 2000 se
produjeron 2,7 millones de muertes en todo el mundo y el 1,8% del total de enfermedades
se atribuyó al bajo consumo de frutas y verduras. Además, se estima que la baja ingesta
de frutas y verduras es la causante de aproximadamente el 14% de las muertes por
cáncer gastrointestinal, alrededor del 11% de las muertes por enfermedades del corazón
y del 9% de las muertes por infarto cerebrovascular (World Health Organization, 2014). El
consumo de frutas y verduras en todo el mundo es insuficiente, con especial atención en
adolescentes y niños, siendo este punto destacado por organismos y autoridades
internacionales: Organización para la Cooperación y el Desarrollo (OECD 2013); Consejo
Europeo de Información sobre la Alimentación (EUFIC 2012); Centros para el Control y la
Prevención de Enfermedades (CDC 2013).
Con un consumo reducido de frutas y verduras, ciertos componentes bioactivos de
los alimentos no se ingieren en las dosis adecuadas, teniendo repercusiones en el
organismo humano (Duyn y Pivonka, 2000). Así, el consumo de frutas y verduras reduce
la probabilidad de padecer cáncer (Block et al., 1992) y enfermedades cardiovasculares
(Veer et al., 2000). Entre los componentes bioactivos más importantes se encuentran los
carotenoides (Gaziano et al., 1995). Los carotenoides actúan en procesos biológicos
dentro del organismo, teniendo repercusiones en la salud (Granado et al., 2003). Las
cantidades de carotenoides que se encuentran en los tejidos humanos son casi
exclusivamente debidos a la ingesta a través de la dieta mediterránea, principalmente de
frutas y verduras, o de suplementos.
Dos de los carotenoides más relevantes son el β-caroteno y la luteína. El β-
caroteno es un carotenoide utilizado tanto como agente colorante de alimentos como
fuente de vitamina A en la alimentación animal. El β-caroteno se utiliza también para el
tratamiento de asma y protoporfiria eritropoyética, y para reducir el riesgo de varios tipos
de cáncer de mama y cáncer de pulmón, además de enfermedades cardiovasculares
(Omenn et al., 1996). Por otro lado, la absorción de β-caroteno reduce el riesgo de
padecer degeneración macular senil (DMAE) (Teikari et al., 1998). El β-caroteno se
encuentra en verduras, como zanahorias, calabazas y batatas proporciónandole a las
mismas ese color naranja, aunque también se puede producir a partir de la microalga
Dunaliella sp.
Tesis Doctoral
104
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
La luteína es una xantófila con actividad antioxidante, recomendada para prevenir
algunos tipos de cáncer (Nishino, 1998), así como enfermedades cardiovasculares
(Peterson et al., 2012) y enfermedades de la retina (Ozawa et al., 2012). La cantidad
estimada de ingesta diaria de luteína a través del consumo de frutas y verduras es de 1,5
mg·día-1, siendo esta cantidad insuficiente para alcanzar la cantidad diaria recomendada
de 3-6 mg·día-1 (Seddon et al., 1994), por lo que una línea de trabajo es tratar de aportar
la cantidad restante a través de suplementos. La luteína se produce comercialmente a
partir de la flor de caléndula (Tagetes erecta L.), pero el contenido en luteína de las flores
de caléndula es muy bajo (aproximadamente 0,03% del peso seco), mientras que las
microalgas como Muriellopsis sp, Chlorella sp. y Scenedesmus sp. pueden contener
cantidades muy superiores de este compuesto, hasta 0,90% del peso seco (García-
González et al., 2005; Yen et al., 2011). La producción de luteína procedente de una
nueva cepa de microalgas rica en este compuesto, Scenedesmus almeriensis, ha sido
patentada por el grupo de Biotecnología de microalgas de la Universidad de Almería. Así,
la microalga S. almeriensis puede contener hasta 1,5% del peso seco de luteína junto con
otros carotenoides como β-caroteno y se produce en fotobiorreactores tubulares
cerrados, en modo continuo a gran escala, con un alto rendimiento, siendo, por lo tanto
una fuente continua y fiable de este carotenoide (Sánchez et al., 2008a; Sánchez et al.,
2008b; Fernández-Sevilla et al., 2010).
Por otro lado, es importante resaltar que frente al reducido consumo de frutas y
verduras, se está produciendo un alto incremento en el consumo de aceite de oliva. Así,
el consumo y la producción del aceite de oliva de alta calidad está aumentando
constantemente en todo el mundo en los últimos años (IOC 2013a; IOC 2013b). Por lo
tanto, el aceite de oliva podría ser un buen medio de transporte para mejorar y aumentar
la ingesta de carotenoides a través de la dieta mediterránea. En este sentido, en la
presente Tesis Doctoral, los principales objetivos son estudiar los efectos de la adición de
diferentes concentraciones de extracto de antioxidantes ricos en carotenoides a los
aceites de oliva vírgenes extra. En los AOVE´s se han determinado los parámetros de
color, calidad, composición (perfil de ácidos grasos, tocoferoles, pigmentos) y la
estabilidad oxidativa con el fin de corroborar su eficacia como antioxidantes.
Tesis Doctoral
105
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
4.2.- MATERIALES Y MÉTODOS
4.2.1.- PRODUCCIÓN DE LA MICROALGA SCENEDESMUS ALMERIENSIS
La microalga S. almeriensis CCAP 276/24 se ha producido en un fotobiorreactor
tubular exterior de tamaño industrial (3.000 L), en modo continuo, a una velocidad de
dilución de 0,30 L/día, en Almería (España) en primavera. El medio de cultivo utilizado ha
sido preparado en agua utilizando compuestos fertilizantes (NaNO3, KH2PO4 y
micronutrientes). Para evitar la contaminación, el medio de cultivo fue ozonizado y
pasado por ultrafiltración (0,02 micras). Los cultivos se realizaron a pH=8,0 con inyección
de CO2, a una temperatura por debajo de 30ºC pasando agua termostatizada a través de
un intercambiador de calor situado en el interior del reactor. La biomasa se cosechó
diariamente por centrifugación y seguidamente fue liofilizada y almacenada a -18 ºC. Esta
biomasa liofilizada es la que se utiliza como materia prima para la extracción de los
antioxidantes (Acién et al., 2012b).
4.2.2.- MÉTODOS DE EXTRACCIÓN
La luteína actualmente se obtiene y se purifica a partir de flores de caléndula por
el método de saponificación-extracción-recristalización (Morita et al., 2002). Una
modificación de este método ha sido utilizada para recuperar los carotenoides a partir de
biomasa liofilizada de S. almeriensis (Cerón et al., 2008). El primer paso es un proceso
de ruptura celular, con alúmina en una proporción 1:1 w/w, utilizando un molino de bolas
(Staatlich Berlin Ku 4) a una velocidad de rotación de 120 rpm y con bolas de 28 mm de
diámetro, durante 5 min de funcionamiento para eliminar los ácidos grasos. El segundo
paso es una saponificación utilizando KOH al 4% w/v, con una concentración de biomasa
de 100 g/L durante 5 min. Se ha demostrado que tratamientos alcalinos más prolongados
o el uso de mayores concentraciones de KOH reducen el rendimiento del proceso. Por
último, la extracción con hexano se realiza usando una proporción de hexano:muestra
1:1 v/v, llevando a cabo un total de tres pasos para recuperar más del 90% de los
carotenoides contenidos en la biomasa procesada. En cada paso se ha añadido un
volumen de etanol igual al 1% del volumen total para evitar la emulsión (Camacho et al.,
2007). Finalmente, el hexano se ha eliminado del extracto mediante destilación a vacío.
Tesis Doctoral
106
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
4.2.3.- PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS DE ACEITE DE OLIVA
Se han utilizado cinco aceites de oliva vírgenes extra comerciales (AOVE´s) de la
provincia de Jaén (“A”, “B”, “C”, “D” y “F”) (Tabla 3.1, página 86). Se ha partido de tres
botellas de 750 ml de cada aceite de oliva (n = 3). De cada botella, se han preparado tres
muestras de 50 ml cada una, correspondientes a: control (aceite de oliva sin extracto (I));
aceite de oliva con 0,1 mg de extracto por ml de aceite (II); y aceite de oliva con 0,21 mg
de extracto por ml de aceite (III). Todos los aceites de oliva se han filtrado en presencia
de sulfato de sodio anhidro antes de su uso. Una vez preparadas, las muestras se han
homogeneizado y mantenido a 4 ºC antes de los correspondientes análisis.
4.2.4.- PARÁMETROS FÍSICOS Y DE CALIDAD EVALUADOS
4.2.4.1.- Determinación de Color
Se ha utilizado un colorímetro modelo Konica Minolta CR-400 para la medición del
color de los aceites de oliva con y sin la adición del extracto. Las diferencias de color
(ΔE*ab) entre las muestras control consideradas como estándar (aceites de oliva sin
adición del extracto) y los aceites enriquecidos (con adición del extracto) se han calculado
a partir de los valores determinados de variables monocromáticas L*, a*, y b* obtenidas
mediante el método CIELAB, así como el índice de amarilleamiento (YI) tal y como
describe Zamora et al., (2004):
E* = [(L*)2 ab + (a*)2 + (b*)2]1/2 Ecuación 4.1
, ∗
YI= ∗ Ecuación 4.2
L* es una medida de luminiscencia o componente de luminosidad, que oscila de 0
a 100 (negro y blanco); los valores de a* van del negativo al positivo (verde a rojo); y b*
también se extiende desde el negativo al positivo (azul a amarillo).
Tesis Doctoral
107
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
4.2.4.2.- Determinación de parámetros de calidad
La acidez libre (FA), el índice de peróxidos (PV) y los coeficientes de extinción
específica a 232 y 270 nm (K232 y K270) se han determinado de acuerdo a los métodos
estándar de la Unión Europea (Anexos II y IX del Reglamento Europeo CEE 2568/91 del
11 Julio).
4.2.5.- DETERMINACIÓN DE LOS VALORES DE p-ANISIDINA
Los aldehídos insaturados y los productos de oxidación secundaria, se han
determinado mediante el valor de anisidina (p-AV), como se detalla en la norma ISO 6885
(2006). Esta medida se basa en el incremento de absorbancia por gramos de aceite,
medida a 350 nm (Genesys 10UV), de una solución de aceite de oliva en iso-octano,
antes y después de la reacción con el reactivo p-anisidina en la oscuridad.
4.2.6.- ESTABILIDAD OXIDATIVA
La estabilidad oxidativa se ha determinado midiendo el tiempo de inducción a la
oxidación, en un equipo Rancimat 743 (Metrohm CH, Suiza). Se ha burbujeado aire
limpio, filtrado y secado (20 L/h) a través del aceite (3,00 g) calentando a 120 ± 1,6 ºC,
recogiendo los compuestos volátiles en agua, y midiendo continuamente el aumento de la
conductividad. Se ha registrado el tiempo necesario para alcanzar la conductividad de
inflexión.
4.2.7.- COMPOSICIÓN EN ÁCIDOS GRASOS
Los ácidos grasos se evaluaron como sus ésteres de metilo, después de la
transesterificación alcalina en frío con una solución metanólica de hidróxido de potasio
(Commission Regulation 2568/91 del 11 de Julio) y la extracción con n-heptano. El perfil
de ácidos grasos se ha determinado con un cromatógrafo Chrompack CP 9001 equipado
con un inyector split-splitless, un detector FID, un muestreador automático Chrompack
CP-9050 y una columna capilar de sílice fundida de 50 m x 0,25 mm de diámetro interno
recubierta con una película de 0,19 μ CP-Sil 88 (Varian). Se ha utilizado helio como gas
portador a una presión interna de 110 kPa. Las temperaturas del inyector y del detector
han sido de 250 a 230 ºC, respectivamente. La temperatura del horno se ha programado
a 120 ºC durante los 3 primeros minutos con un aumento de 4 ºC/min hasta 220 ºC. La
Tesis Doctoral
108
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
relación de separación ha sido de 1:50 y el volumen inyectado de 1 µl. Los resultados se
han expresado en porcentaje relativo de cada ácido graso, calculado por la normalización
interna del área del pico cromatográfico que eluye entre ésteres metílicos, mirístico y
lignocérico. Una muestra de control (aceite de oliva 47118, Supelco) y una mezcla de
ésteres de ácidos grasos estándar metílicos (FAME Supelco 37 Mix) se han utilizado con
el objetivo de realizar la identificación y la calibración (Sigma, España).
4.2.8.- COMPOSICIÓN EN TOCOFEROLES
La composición en tocoferoles se ha evaluado siguiendo la norma internacional
ISO 9936 (2006), con algunas modificaciones tal como se describe en el trabajo de
Malheiro et al., (2013a). Los tocoferoles estándar (α, β, y ) se han adquirido de
Calbiochem (La Jolla, San Diego, CA) y Sigma (España), mientras que el estándar
interno 2-metil-2-(4,8,12-trimetiltridecil)chroman-6-ol (tocol) fue de Matreya Inc. (Pleasant
Gap, PA). Una cantidad precisa de aceite de oliva filtrado y de extracto de S. almeriensis
se han mezclado con una cantidad apropiada de disolución patrón interno (tocol) en un
volumen de 1,5 ml de n-hexano y se ha homogeneizado por agitación. La preparación de
la muestra se ha llevado a cabo en oscuridad y los tubos que contienen las muestras se
han envuelto en papel de aluminio. La mezcla se ha centrifugado durante 5 minutos a
13.000 rpm y el sobrenadante se ha analizado mediante HPLC. El cromatógrafo de
líquidos consiste en un sistema integrado Jasco (Japón) equipado con una unidad de
datos Jasco LC-NetII/ADC, una bomba inteligente PU-1580, una unidad de gradiente
cuaternario LG-1580-04, un desgasificador de cuatro líneas DG-1580-54 y un detector de
fluorescencia FP-920 (λexc= 290 nm y λem= 330 nm). La separación cromatográfica se
consiguió en una columna Supelcosil TM LC-SI (3 µm) 75 x 3,0 mm (Supelco, Bellefonte,
PA), operando a temperatura ambiente constante (23ºC). Se ha utilizado como eluyente,
a un caudal de 0,7 ml/min, una mezcla de n-hexano y 1,4-dioxano (97,5:2,5). Los datos
se han analizado con el cromatógrafo ChromNAV - Data Station JASCO (Japón). Los
compuestos se han identificado por comparación cromatográfica con patrones auténticos,
por co-elución y por sus espectros de UV. La cuantificación se ha basado en el método
de patrón interno, usando la respuesta de la señal de fluorescencia.
Tesis Doctoral
109
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
4.2.9.- COMPOSICIÓN DE LOS PIGMENTOS
Los extractos fueron preparados de acuerdo con Achir et al., (2010). Se ha
añadido una cantidad adecuada de patrón interno de β-apo-carotenal (Sigma-Aldrich) a
200 mg de muestra de aceite de oliva, se ha mezclado con 2 ml de acetona en un
agitador vortex durante 10 s, y se ha dejado durante la noche a -20 °C para la
cristalización del triacilglicerol. Los triacilgliceroles fueron separados por muestreo rápido
seguido de centrifugación a 13.000 rpm. Estos pasos se han omitido en el análisis del
extracto de S. almeriensis, siendo directamente diluido en acetona después de la adición
del patrón interno. El extracto fue inyectado directamente en la columna de HPLC,
Phenomenex Luna C18 (250 x 3,5 mm d.i) a 23 °C, y eluido con un gradiente lineal de 30
min con metanol acuoso al 80% (v/v) que contenía 0,05% de trietilamina y 20% de
acetato de etilo (conteniendo 0,05% de trietilamina) a 1 ml/min. El análisis se ha realizado
en el mismo equipo de HPLC descrito para el análisis de tocoferoles, excepto por el uso
de un detector DAD (JASCO MD-2015-Plus, Japón). La luteína y el β-caroteno se han
adquirido de Sigma. Las curvas de calibración se construyeron a 440 nm para la luteína y
el β-caroteno frente al patrón interno.
4.2.10.- ANÁLISIS ESTADÍSTICO
4.2.10.1.- Análisis de la varianza
Se ha realizado un análisis de la varianza utilizando el procedimiento del Modelo
Lineal General del software SPSS, versión 21.0 (IBM Corporation, Nueva York, EE.UU.).
El cumplimiento de los requisitos del ANOVA, la normalidad de los residuos y la
homogeneidad de la varianza, se han evaluado mediante el test de Kolmogorov-Smirnov
con la corrección de Lilliefors (si n>50), por el test de Shapiro-Wilk (si n<50), y los test de
Levene, respectivamente. Todas las variables dependientes se han analizado mediante
un ANOVA de una vía con o sin corrección de Welch, dependiendo de si el requisito de la
homogeneidad de las varianzas se cumplía o no. El principal factor estudiado ha sido el
efecto de la adición de diferentes concentraciones del extracto de S. almeriensis en la
calidad de los AOVE´s (FA, PV, p-AV, TOTOX, K232, K270, y ΔK), los parámetros de color
(a*, b*, L*, ΔE*ab y YI), el perfil de ácidos grasos, la composición de tocoferoles (α-, β-, γ-,
y tocoferoles totales), la estabilidad oxidativa y la composición de pigmentos (luteína y β-
caroteno). En caso de que se detecte un efecto estadísticamente significativo, las
muestras se comparan mediante el índice de Tukey, test de comparación múltiple o el
Tesis Doctoral
110
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
test de Dunnett T3, dependiendo de si la igualdad de las diferencias podrían ser
asumidas o no. Todas las pruebas estadísticas se han realizado a un nivel de
significancia del 5%.
4.2.10.2.- Análisis de los Componentes Principales (PCA)
Se ha aplicado el análisis de los componentes principales (PCA) para reducir el
número de variables en los AOVE´s enriquecidos con diferentes concentraciones de
extracto de S. almeriensis (4 variables correspondiente a los parámetros de color - L*, a*,
b*, y YI; 5 variables correspondientes a los parámetros de calidad -FA, PV, K232, K270 y
ΔK; el índice de p-AV, el índice TOTOX; 4 variables correspondientes a los tocoferoles,
incluyendo el contenido total de vitamina E (tocoferoles totales); la estabilidad oxidativa;
el contenido de luteína y β-caroteno; con un total de 18 variables) a un número menor de
nuevas variables derivadas (componentes principales) que resumen adecuadamente la
información original, es decir, la adición de diferentes concentraciones de S. almeriensis a
los AOVE´s. Este análisis ha permitido el reconocimiento de patrones en los datos,
utilizando las nuevas variables derivadas como dimensiones (mediante las puntuaciones
de los componentes principales). Este PCA se ha realizado utilizando el software SPSS,
versión 21.0 (IBM Corporation, Nueva York, EE.UU.).
4.2.10.3.- Análisis Discriminante Lineal (LDA)
Se ha utilizado el análisis discriminante lineal (LDA) como técnica de aprendizaje
supervisado para clasificar las diferentes concentraciones de extracto de S. almeriensis
añadido en función de su color y de la calidad de sus parámetros, TOTOX, p-AV, el
contenido de tocoferoles, el perfil de ácidos grasos, el contenido en pigmentos del AOVE,
y la estabilidad oxidativa (32 variables en total). Una técnica gradual, que utiliza el método
lambda de Wilks con las probabilidades habituales de F (3,84 para entrar y 2,71 para
eliminar), fue aplicada para la selección de variables. Este procedimiento utiliza una
combinación de selección hacia adelante y procedimientos de eliminación hacia atrás,
donde antes de seleccionar una nueva variable para ser incluida, se verifica si todas las
variables seleccionadas previamente siguen siendo significativas. Con este enfoque, es
posible identificar las variables significativas entre todas las variables en estudio. Para
comprobar qué funciones discriminantes canónicas fueron significativas, se aplicó el
método lambda de Wilks. Para confirmar la capacidad predictiva del modelo se utilizó un
procedimiento de validación cruzada. Por otra parte, la sensibilidad y especificidad del
modelo discriminante se calcularon a partir del número de individuos predicho
Tesis Doctoral
111
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
correctamente como perteneciente a un grupo asignado. La sensibilidad se calculó
dividiendo el número de muestras de un grupo específico correctamente clasificado entre
el número total de muestras que pertenecen a ese grupo específico. La especificidad se
calculó dividiendo el número de muestras de un grupo específico clasificadas como
pertenecientes a ese grupo, entre el número total de muestras de cualquier grupo
clasificado como pertenecientes a ese grupo específico. El LDA se llevó a cabo utilizando
el software SPSS, versión 21.0 (IBM Corporation, Nueva York, EE.UU.).
4.3.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.3.1.- PARÁMETROS DE COLOR
El color de los AOVE´s se ha utilizado para valorar la apariencia de los aceites
tras la adición del extracto de S. almeriensis, ya que el aspecto visual de los aceites de
oliva es un factor importante para la evaluación y preferencia de los consumidores
(Gómez-Caravaca et al., 2007). En la Tabla 4.1 se presentan los principales valores
CIELAB, L*, a* b* obtenidos a partir de AOVE´s con diferentes concentraciones de
extracto de S. almeriensis. En los cinco aceites estudiados se aprecia el efecto en el color
tras la adición del extracto. Los valores de a* disminuyen con la concentración de extracto
añadido de forma similar en los 5 aceites, existiendo diferencias significativas (Tabla 4.1).
Esto significa que la coloración verde, típica de los AOVE´s, pasa a una coloración más
amarillo-naranja. Con respecto al valor b*, se observa un aumento de este parámetro,
principalmente con la adición de 0,1 mg de extracto por ml de aceite de oliva, ya que los
aceites de oliva se hacen más amarillos con la adición del extracto procedente de S.
almeriensis (Tabla 4.1 y Figura 4.1). La claridad (L*) de los aceites de oliva disminuye
significativamente en todas las muestras, se observa una proporción directa entre la
concentración de extracto y la claridad observada, la cual convierte a los AOVE´s con
extracto adicionado más oscuros que los controles (aceites sin extracto) (Figura 4.1).
Los resultados obtenidos en a*, b* y L*, muestran que la adición de extracto de S.
almeriensis a los AOVE´s provoca cambios significativos en su color, observaciones
corroboradas por el parámetro ΔE*ab (diferencia de color). En la Figura 4.1 se observan
las diferencias de color (Fig. 4.1a) entre los aceites de oliva con y sin extracto de S.
almeriensis y el índice de amarilleamiento (YI) (Fig. 4.1b). Los valores ΔE*ab son más
altos en AOVE´s enriquecidos, lo que significa que las diferencias de color de los aceites
con extracto aumentan (Fig. 4.1). El índice YI aumenta significativamente con la adición
Tesis Doctoral
112
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
del extracto, sin embargo, no se observan diferencias entre la adición de 0,1 mg/ml y 0,21
mg/ml.
El efecto de la adición de extracto de S. almeriensis se aprecia claramente,
incluso a simple vista (Figura 4.1, derecha). El color adoptado por los aceites está
relacionado con la composición del extracto, donde predominan los carotenoides (Cerón
et al., 2008), como se discutirá en la sección 4.3.5.
4.3.2.- PARÁMETROS DE CALIDAD
La calidad de los AOVE´s se ha evaluado para verificar si las adiciones de
extracto de S. almeriensis causan modificaciones en la calidad. Las observaciones
globales ponen claramente de manifiesto que no hay degradación de la calidad con la
adición de extracto (Tabla 4.1). En cuanto a los valores de ácidos grasos (FA), en cuatro
de los cinco aceites de oliva estudiados, no se observaron cambios significativos, excepto
en el aceite “C”, en el que la adición del extracto reduce los niveles de ácidos grasos
libres, pero sin cambios significativos entre los aceites con extracto. Estos resultados son
positivos, ya que la adición de extracto no provoca reacciones hidrolíticas en los aceites
de oliva, manteniendo los niveles de ácidos grasos libres.
La posible aparición de procesos oxidativos en los AOVE´s se controló mediante
la determinación de varios parámetros de calidad (PV, K232, K270, ΔK, y p-AV) presentados
en la Tabla 4.1. La peroxidación de los AOVE´s disminuye con la adición de extracto de
S. almeriensis, ya que en todos los aceites, excepto el “F”, se observa una disminución
significativa en el índice de peróxidos (PV). Por lo tanto, la formación de productos de
oxidación primarios (principalmente hidroperóxidos) (Laguerre et al., 2007) es inhibida,
actuando el extracto de S. almeriensis como antioxidante. Los coeficientes de extinción
específica a 232 y 270 nm (K232 y K270, respectivamente) también corroboran que la
adición de extracto tampoco afecta a la calidad de los aceites de oliva. En K232 y ΔK no se
observaron cambios significativos en los aceites, sin embargo, la adición de extracto
aumenta significativamente los valores de K270 de los AOVE´s. El parámetro K270 es
indicativo de la formación de productos secundarios de oxidación y mediante la
evaluación de los valores obtenidos en el análisis de p-AV, se concluye claramente que la
adición de extracto no influye en la oxidación secundaria de los aceites de oliva, por lo
que los resultados obtenidos en K270 podrían estar relacionados con el color conferido a
los aceites por la adición de extracto. Según Malheiro et al., (2011) el análisis de p-AV se
utiliza para evaluar la rancidez oxidativa avanzada de aceites vegetales. El método
Tesis Doctoral
113
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
analítico se basa en la reactividad del enlace carbonilo aldehído sobre los grupos amina
de p-anisidina, lo que lleva a la formación de la base de Schiff que absorbe a 350 nm.
Esto permite la estimación de los productos de oxidación secundarios de los ácidos
grasos insaturados, principalmente dienales y 2-alquenales (Labrinea et al., 2001). Por lo
tanto, mediante el estudio de los parámetros de calidad (Tabla 4.1) de los AOVE´s
estudiados se puede deducir que la adición de extracto no influye negativamente ni en las
reacciones oxidativas primarias (PV y K232) ni en las secundarias (p-AV). De hecho, la
adición es positiva, ya que se observa una menor formación de hidroperóxidos y un
aumento general en la calidad de los AOVE´s, como se aprecia en el valor de TOTOX
(Tabla 4.1). El valor TOTOX es una herramienta útil en la evaluación de la degradación
oxidativa de los aceites vegetales, siendo también considerado como el valor total de
oxidación de acuerdo con la norma ISO 6885 (2006). De los cinco AOVE´s analizados, el
aceite “B” fue el único en el que no se observaron disminuciones significativas en el valor
de TOTOX. Los AOVE´s restantes presentaban un menor deterioro oxidativo con la
adición de extracto. En este punto hay que resaltar que se han registrado valores más
bajos de TOTOX en comparación con los obtenidos en AOVE´s italianos (Cerretani et al.,
2009).
Con respecto a todos los valores obtenidos en los parámetros de calidad de los
AOVE´s con y sin adición de extracto de S. almeriensis, todos los aceites podrían ser
clasificados como AOVE´s de acuerdo con la legislación Comunitaria Europea ((EU), nº
299/2013).
4.3.3.- PERFIL DE ÁCIDOS GRASOS
El perfil de ácidos grasos de los AOVE´s con y sin diferentes concentraciones de
extracto de S. almeriensis se observa en la Tabla 4.2. El perfil de ácidos grasos de los
cinco AOVE´s está compuesto principalmente por ácido oleico (C18:1), seguido de ácido
palmítico (C16:0) y ácido linoleico (C18:2). En los AOVE´s estudiados, la adición de
extracto de S. almeriensis no conlleva cambios significativos en el perfil de ácidos grasos,
excepto en algunas situaciones específicas. En dos AOVE´s (“C” y “D”) el contenido de
ácido palmítico aumenta de manera significativa, mientras que en el “F” se observó la
misma relación con el ácido linoleico. El contenido de ácido linolénico (C18:3) en los
aceites de oliva “C” y “A”, aumenta considerablemente (Tabla 4.2). En cuanto a las
diferentes fracciones de ácidos grasos que componen los AOVE´s estudiados, como se
esperaba, debido a su alto contenido en ácido oleico, los MUFA (ácidos grasos
monoinsaturados) fueron los más abundantes (> 77%), seguidos de los SFA (ácidos
Tesis Doctoral
114
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
grasos saturados) entre 14,40% y 17,15%, y los PUFA (ácidos grasos poliinsaturados)
con valores comprendidos entre el 3,59% y 4,70% (Tabla 4.2). Los ácidos grasos trans
han resultado ser siempre iguales o inferiores al 0,05% (Tabla 4.2).
4.3.4.- COMPOSICIÓN EN TOCOFEROLES
La composición detallada en tocoferoles de los AOVE´s con diferentes
concentraciones de extracto de S. almeriensis se observa en la Tabla 4.3. En los cinco
aceites de oliva analizados, se han detectado y cuantificado tres tocoferoles: α-, β-, y γ-
tocoferol. El α-tocoferol estaba presente en cantidades más altas, como era de esperar
para los aceites de oliva (Malheiro et al., 2012), con contenidos comprendidos entre 119 y
429 mg/kg en los AOVE´s control. Los valores de β-tocoferol fueron de 4 a 6 mg/kg,
mientras que los de γ-tocoferol oscilaron entre 40 y 55 mg/kg en todas las muestras
estudiadas (Tabla 4.3). La cantidad total de tocoferoles encontrada oscilaba entre 159
mg/kg (correspondiente al aceite “F” en las muestras control) y 511 mg/kg (aceite “C” con
0,1 mg/ml de extracto). La adición de extracto de S. almeriensis no afecta
considerablemente a la cantidad de tocoferoles totales, así como a los tocoferoles
individuales, excepto en algunos casos particulares (Tabla 4.3). Estas observaciones
concuerdan con la ausencia de tocoferoles en el extracto de S. almeriensis.
Principalmente el α-tocoferol, posee una importante acción antioxidante y vitamínica, el
hecho de que la adición de S. almeriensis no comprometa su contenido es una buena
señal, ya que ambas propiedades biológicas importantes se conservan en los aceites de
oliva vírgenes extra.
4.3.5.- COMPOSICIÓN DE PIGMENTOS
El análisis llevado a cabo mediante HPLC del extracto de antioxidantes de S.
almeriensis, reveló su composición, siendo el β-caroteno el compuesto más
representativo con un 13,3% del extracto total, seguido por un 0,25% en luteína y un 1%
de otros carotenoides no identificados. Las determinaciones espectrofotométricas
corroboraron los resultados anteriores, con un promedio de 14,4% del total de
compuestos carotenoides en el extracto de S. almeriensis.
La composición de los pigmentos de los cinco AOVE´s con y sin adición de
extracto de S. almeriensis, se muestra en la Figura 4.2a y Fig.4.2b. De los resultados
obtenidos se puede deducir que los extractos de S. almeriensis son principalmente ricos
en carotenoides: β-caroteno y luteína, siendo el primero el componente mayoritario. En
Tesis Doctoral
115
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
todos los AOVE´s analizados, el contenido de luteína en los aceites control osciló entre
4,5 y 6,3 mg/kg (Figura 4.2b). La adición del extracto de S. almeriensis produce un
aumento considerable del contenido en luteína en todos los AOVE´s (excepto en el aceite
“C”). El aumento en luteína con la adición de extracto a 0,1 mg/ml fue sólo
estadísticamente significativo en los aceites “B” y “F”, mientras que la adición de 0,21
mg/ml fue significativa en los aceites “B”, “F” y “A” en comparación con los aceites control.
Por lo tanto, la adición de 0,1 mg/ml sería la mejor opción a fin de mejorar el contenido en
luteína de los AOVE´s. Además, se ha observado que los extractos de S. almeriensis son
muy ricos en otros carotenoides como el β-caroteno (Figura 4.2a). El contenido en β-
caroteno en los AOVE´s control ha variado entre 1,2 mg/kg (aceite “F”) y 4,1 mg/kg
(aceite “A”). Con la adición de 0,1 mg/ml de extracto, el contenido de β-caroteno aumentó
6,5 veces en el AOVE “A”, 6,0 en el “B”, 11,1 en el “C”, 4,4 en el “D” y 8,3 veces en el “F”.
Con una adición de 0,21 mg/ml el contenido β-caroteno aumentó 9 veces en el aceite “A”
y 25,8 veces en el aceite “F”. El contenido en β-caroteno de los AOVE´s con 0,21 mg/ml
varió entre 30,1 y 37,1 mg/kg (en los aceites “C” y “A” respectivamente; Figura 4.2a).
Comparando los AOVE´s enriquecidos con hojas de olivo durante el proceso de
extracción (Malheiro et al., 2013b), se encuentran AOVE´s con un contenido inferior en
luteína, pero mucho más alto en β-caroteno, que resulta de la adición del extracto de S.
almeriensis, sin un incremento significativo en el contenido de clorofilas y feofitinas, como
se observa con la adición de extracto de hojas de olivo durante el proceso de extracción.
El incremento en carotenoides ha provocado cambios significativos en el color y la
calidad de los AOVE´s como se ha comprobado en las secciones 4.3.1 y 4.3.2 y se puede
apreciar en la Figura 4.1 y la Tabla 4.1 de este capítulo de Tesis.
4.3.6.- ESTABILIDAD OXIDATIVA
La estabilidad oxidativa de los AOVE´s se ha evaluado con el fin de verificar si la
adición de extracto de S. almeriensis podría mostrar o no alguna actividad antioxidante y
pro-oxidante en los AOVE´s. Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 4.2c y
muestran claramente que los extractos de S. almeriensis actúan como antioxidantes,
protegiendo a los aceites frente a la oxidación. Un aumento significativo de la resistencia
a la oxidación se ha verificado en todos los aceites de oliva. Además se observa que
mediante la adición de 0,21 mg de extracto por ml de aceite, no se aprecian aumentos
significativos en la estabilidad oxidativa comparado con la adición de 0,1 mg/ml (excepto
en el aceite “A”). Así, se podría concluir que la adición de 0,21 mg/ml de extracto de S.
almeriensis a los AOVE´s podría ser excesiva, ya que no se han observado mejoras
Tesis Doctoral
116
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
adicionales, y podrían también posiblemente actuar como prooxidantes. La adición de 0,1
mg/ml ha aumentado la estabilidad oxidativa de los AOVE´s de 11,85% (en el aceite “F”)
a 37,80% (en el aceite “B”), mientras que la de 0,21 mg/ml elevó la estabilidad oxidativa
entre 15,76% (en el aceite “F”) y 42,06% (en el aceite “C”). El aumento de la estabilidad
oxidativa se relaciona con la composición del extracto de S. almeriensis, especialmente
rico en β-caroteno. El β-caroteno es un compuesto antioxidante reconocido (Sies y Stahl,
1995), y de acuerdo con Aparicio et al., (1999), en condiciones normales, los
carotenoides son responsables de aproximadamente el 6% de la estabilidad de los
aceites de oliva. En este tipo de aceites, con grandes cantidades de β-caroteno, la
contribución de los carotenoides a la estabilidad oxidativa es mucho mayor. Estas
observaciones son importantes ya que la vida útil de los AOVE´s podría incrementarse
considerablemente, siendo interesante estudiar el impacto y la estabilización de los
AOVE´s con extractos de S. almeriensis durante el periodo de almacenamiento y
procesamiento térmico.
4.3.7.- DISCRIMINACIÓN DE LOS ACEITES DE OLIVA POR LA ADICIÓN DE
EXTRACTO DE SCENEDESMUS ALMERIENSIS
La adición de extracto de Scenedesmus almeriensis a diferentes concentraciones
afecta claramente al color, la calidad, la composición y la estabilidad oxidativa de los
AOVE´s de una manera que hace posible la distinción de acuerdo a la concentración de
extracto añadido en cada aceite de oliva. En la Figura 4.3a se muestra la representación
bidimensional con respecto a los dos componentes principales, que explican el 58,61%
de la varianza total de los datos obtenidos. Se percibe que el primer componente principal
(PC1) separa el AOVE control (sin extractos) de los AOVE´s con adición de extracto
procedente de S. almeriensis. Los AOVE´s control representados en toda la región
negativa de PC1 (Figura 4.3a), se caracterizaron por poseer los peores índices de calidad
(PV, FA, y el valor TOTOX), mientras que los AOVE´s con la adición de 0,1 y 0,21 mg/ml,
representados principalmente en la región positiva de PC1, se asocian con valores más
altos en los parámetros de color (a*, b*, L*, ΔE*ab, y YI -Tabla 4.1 y Figura 4.1), con
mayor contenido en luteína y β-caroteno (Figura 4.2a y Fig. 4.2b), y una mayor
estabilidad frente a la oxidación (Fig. 4.2c).
Junto con el método PCA sin supervisión, se ha aplicado un análisis discriminante
lineal gradual (LDA) a los datos obtenidos, con el fin de crear un modelo discriminante. El
modelo obtenido determinó siete funciones discriminantes importantes que explican el
100% de la varianza, aunque sólo se utilizaron las dos primeras, ya que explican el
Tesis Doctoral
117
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
89,3% de la varianza de los datos experimentales (Función 1: 52,8% y Función 2: 36,5%;
Fig. 4.3b). De las 32 variables iniciales, el modelo ajustado se basó en 7 variables: b*, L*,
YI, β-caroteno, luteína, α-tocoferol y γ-tocoferol. Una vez más, la quimiometría demuestra
que la adición de extracto de antioxidantes tiene un efecto importante en el color de los
AOVE´s correspondiente al contenido de pigmentos, de manera que es posible clasificar
correctamente todas las muestras. El modelo mostró además un rendimiento muy
satisfactorio, ya que permitió clasificar correctamente todas las muestras con respecto a
los AOVE´s pertenecientes y a la concentración correcta de S. almeriensis. Se
observaron los mismos resultados para el procedimiento de validación cruzada
(sensibilidad y especificidad del 100%), lo que demuestra que la clasificación de los
grupos originales no se sobreestimó. En la Figura 4.3b se puede observar que las
funciones discriminantes separan los AOVE´s de acuerdo a la concentración de los
extractos de S. almeriensis añadidos, y entre los que tienen la misma concentración es
posible separar los diferentes AOVE´s estudiados. El tratamiento de dichos datos ayudó a
reconocer los efectos de la adición de extracto en los AOVE´s, y a observar de una
manera integrada y resumida todos los datos.
4.3.8.- INCORPORACIÓN DE S. ALMERIENSIS Y CONSUMO DE ACEITE DE OLIVA
De la totalidad de los datos obtenidos en el estudio de los AOVE´s se observa
claramente que los principales cambios están relacionados con la concentración de
carotenoides de los extractos, principalmente de β-caroteno y luteína, como era de
esperar. Los carotenoides son componentes muy importantes en varios procesos
biológicos para el organismo humano, que tienen repercusiones en la salud humana
(Granado et al., 2003). La luteína y el β-caroteno presentes en los extractos de S.
almeriensis son dos buenos ejemplos. Las cantidades de carotenoides que se encuentran
en los tejidos humanos son casi exclusivamente de origen alimentario, principalmente
procedentes de frutas y verduras, o de suplementos, pero su consumo es deficiente en
muchos países. De acuerdo con el Informe CDC sobre el consumo de frutas y verduras
(CDC 2013), en los EE.UU. el 37,7% y el 22,6% de la población adulta consumen frutas y
verduras, respectivamente, menos de una vez al día. Respecto a la población
adolescente, se obtiene que el 36,0% y 37,7% consumen frutas y verduras,
respectivamente, menos de una vez al día. La ingesta de frutas media en EE.UU. para
adultos y adolescentes es de 1,0 y 1,1 veces al día, mientras que para el consumo de
verduras, los valores aumentan a 1,6 y 1,3 veces al día, (CDC 2013). De acuerdo con
Kimmons et al., (2009), pocos adolescentes y adultos estadounidenses consumen las
cantidades recomendadas de frutas y verduras. Aunque las cifras de Europa no son
Tesis Doctoral
118
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
aparentemente tan inquietantes, en varios países la ingesta de carotenoides a partir de
fuentes naturales todavía es reducida (Tennant et al., 2014). Por otro lado, la producción
y el consumo de aceite de oliva, está en constante aumento en todo el mundo en los
últimos años (IOC 2013a; IOC 2013b). La luteína y el β-caroteno están naturalmente
presentes en el aceite de oliva, pero en dosis bajas (Malheiro et al., 2013a). Con la
incorporación del extracto de S. almeriensis el contenido en carotenoides aumenta en el
aceite de oliva, principalmente el de β-caroteno (Fig. 4.2a). Por lo tanto, la incorporación
de extractos de S. almeriensis al AOVE es una buena estrategia para fomentar el
consumo de carotenoides esenciales e incorporarlos al organismo humano. Desde el
punto de vista nutricional, el consumo de AOVE´s enriquecidos con extractos
procedentes de S. almeriensis sería un activo valioso para contrarrestar el consumo
deficiente de frutas y verduras. Además, los carotenoides procedentes de la microalga S.
almeriensis poseen una bioaccesibilidad para la absorción en el organismo muy superior
a los de muchas frutas y verduras o suplementos (Granado et al., 2009). Aun así, se
deben de realizar más ensayos antes de la comercialización de este tipo de productos,
haciendo especial énfasis en la seguridad para el consumidor. Además, la preparación de
extracto de S. almeriensis, debe ser optimizada para una mayor productividad en la
industria alimentaria.
Tesis Doctoral
119
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
4.4.- CONCLUSIONES
La adición de extracto de S. almeriensis conlleva cambios significativos en el
color, la calidad, la composición y la estabilidad de los AOVE´s. La adición de extractos
proporciona a los AOVE´s un color más amarillo-naranja debido a la concentración de
los pigmentos, principalmente el β-caroteno. La estabilidad oxidativa ha mejorado
notablemente por adición del extracto de S. almeriensis y también se ha mejorado la vida
útil de los aceites, protegiéndolos frente a los agentes oxidantes. La peroxidación de los
AOVE´s se reduce, así como la formación de productos de oxidación, por tanto, se
produce una mejora en la calidad de estos AOVE´s. El perfil de ácidos grasos no se ve
afectado por la adición del extracto, así como el contenido de tocoferoles.
En general, la adición de extracto de antioxidantes es beneficiosa para discriminar
los diferentes AOVE´s de acuerdo con la cantidad de extracto añadido. De todos los
resultados obtenidos se concluye que, la adición de 0,21 mg/ml no contribuye
decisivamente a la calidad y composición de los AOVE´s comparativamente a la de 0,1
mg/ml. Por lo tanto, la concentración de 0,1 mg/ml de extracto de S. almeriensis sería una
concentración óptima, ya que se conservan todas las propiedades y características de los
AOVE´s originales, mientras que al mismo tiempo proporciona dosis importantes de
compuestos bioactivos y una mayor estabilidad frente a la oxidación.
La posible introducción de este tipo de antioxidantes en el aceite de oliva
aumentaría la ingesta diaria de carotenoides esenciales en la dieta, con la mejora de las
propiedades para la salud de los consumidores, ya que confiere importantes activos
nutricionales. Además, se han llevado a cabo en esta Tesis distintos ensayos para
evaluar la estabilidad de este tipo de AOVE´s durante el almacenamiento, y se ha
estudiado la estabilidad en función de tres variables principales de degradación: el
tiempo, la temperatura y la exposición a la luz (capítulo 5 de esta Tesis Doctoral).
Tesis Doctoral
120
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
Figura 4.1
Diferencias de color (ΔE*ab) (Fig. 4.1a) y el índice de amarilleamiento (YI) (Fig. 4.1b) entre AOVE´s
con y sin adición de extracto de S. almeriensis. En cada uno de los AOVE´s los valores difieren
significativamente (P <0,05).
Tesis Doctoral
121
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
Fig.4.2c
Figura 4.2
Contenido en β-caroteno (mg/kg; Fig. 4.2a), luteína (mg/kg; Fig. 4.2b) y estabilidad oxidativa
(horas; Figura 4.2c) de AOVE´s sin (I) y con extracto de S. almeriensis (II = 0,1 mg/ml; III = 0,21
mg/ml). En cada uno de los AOVE´s los valores difieren significativamente (P <0,05).
Tesis Doctoral
122
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
Figura 4.3
Análisis de los componentes principales (PCA -Figura 4.3a) y análisis discriminante lineal (LDA -
Figura 4.3b) de los AOVE´s sin (I) y con enriquecimiento de extracto de S. almeriensis (II = 0,1
mg/ml; III = 0,21 mg/ml) (p-AV - valor de p-anisidina; OS - estabilidad oxidativa). Los factores del
PCA y las funciones discriminantes explican el 58,58% y 89,3% de la varianza total,
respectivamente.
Tesis Doctoral
123
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
Tabla 4.1
Parámetros de calidad (FA - acidez libre; PV - índice de peróxidos), valor de p-anisidina (p-AV), índice de TOTOX, y parámetros de color (a* b* y L*) de los
AOVE´s sin (I) y con extracto de S. almeriensis (II = 0,1 mg/ml; III = 0,21 mg/ml).
Color parameters Quality parameters
PV
Olive oil a* b* L* FA (%) K232 K270 ΔK p-AV TOTOX
(mEq. O2/kg)
B
I -11.77±0.29 a 81.95±0.81 a 73.95±0.52 c 0.3±0.04 a 9±1 b 0.86±0.15 a 0.15±0.02 a -0.003±0.002 a 17±1 a 35±2 a
II -2.33±0.42 b 86.01±1.32 b 70.70±0.85 b 0.3±0.05 a 6±1 a 0.83±0.09 a 0.15±0.01 a -0.003±0.001 a 16±0 a 28±3 a
III 3.92±0.51 c 82.65±0.96 a 68.24±0.61 a 0.3±0.04 a 7±2 a 0.94±0.12 a 0.19±0.03 b -0.001±0.002 a 16±1 a 30±4 a
C
I -12.77±0.27 a 81.41±1.46 a 75.60±1.01 c 0.2±0.00a 9±1 b 0.94±0.17 a 0.13±0.02 a -0.002±0.005 a 12±0 a 30±2 b
II -3.08±0.45 b 86.39±2.23 c 70.96±1.38 b 0.2±0.00 a 6±1 a 0.86±0.18 a 0.12±0.01 a -0.005±0.002 a 13±1 a 24±2 a
III 3.35±0.36 c 83.89±1.49 b 69.01±0.89 a 0.2±0.00 a 6±0 a 1.17±0.55 a 0.16±0.01 b -0.003±0.004 a 13±1 a 25±1 a
F
I -13.13±0.76 a 73.24±2.39 a 78.53±0.85 c 0.3±0.00 a 9±0 a 0.84±0.07 a 0.18±0.02 a -0.001±0.003 a 13±1 a 32±0 b
II -1.28±1.10 b 89.40±1.56 b 72.93±1.01 b 0.3±0.00 a 8±0 a 0.88±0.03 a,b 0.21±0.02 a,b -0.007±0.008 a 14±1 a 31±0 b
III 5.42±1.09 c 88.15±0.56 c 71.58±0.34 a 0.3±0.00 a 8±1 a 0.92±0.04 b 0.24±0.03 b -0.003±0.002 a 13±1 a 30±1 a
A
I -11.77±0.37 a 82.34±1.08 a 74.85±0.82 c 0.2±0.00 a 9±0 b 0.82±0.05 a 0.13±0.01 a -0.003±0.001 a 15±1 a 33±1 b
II -3.48±0.21 b 85.87±2.02 b 70.96±1.01 b 0.2±0.00 a 6±1 a 0.84±0.04 a 0.15±0.02 a,b -0.004±0.002 a 16±1 a 27±2 a
III 2.36±0.46 c 85.17±1.23 c 69.87±0.76 a 0.2±0.04 a 6±1 a 0.81±0.05 a 0.16±0.01 b -0.002±0.001 a 16±1 a 28±1 a
D
I -14.15±0.04 a 71.48±2.12 a 81.34±0.61 c 0.3±0.00 a 8±1 b 1.00±0.07 a 0.13±0.02 a -0.003±0.001 a 14±1 a 29±1 a
II -5.38±0.20 b 95.20±0.38 c 77.49±0.26 b 0.3±0.05 a 5±1 a 0.93±0.08 a 0.13±0.02 a -0.009±0.017 a 14±1 a 24±2 b
III 0.85±0.83 c 93.58±0.81 b 75.13±0.58 a 0.3±0.00 a 5±1 a 1.01±0.03 a 0.16±0.01 b -0.002±0.002 a 14±1 a 24±1 b
Tesis Doctoral
124
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
Tabla 4.2
Composición detallada de ácidos grasos expresada en (g/100 g de ácidos grasos) de los AOVE´s sin (I) y con extracto de S. almeriensis (II = 0,1 mg/ml;
III = 0,21 mg/ml).
Olive
C16:0 C16:1 C17:1 C18:0 C18:1 C18:2 C20:0 C18:3 C20:1 C22:0 SFA MUFA PUFA Trans
oil
B
I 11.76±0.45a 0.79±0.06a 0.10±0.02a 2.87±0.26a 78.09±0.84a 3.46±0.44a 0.37±0.02a 0.57±0.03a 0.24±0.01a 0.09±0.02a 15.24±0.56a 79.22±0.85a 4.02±0.41a 0.04±0.01a
II 11.35±0.44a 0.77±0.01a 0.10±0.00a 2.60±0.23a 79.32±0.61a 3.18±0.04a 0.35±0.01a 0.58±0.00a 0.22±0.00a 0.11±0.00a 14.52±0.66a 80.42±0.61a 3.76±0.05a 0.02±0.00a
III 11.07±0.37a 0.80±0.01a 0.10±0.00a 2.74±0.06a 79.21±0.36a 3.30±0.01a 0.35±0.01a 0.60±0.00a 0.22±0.00a 0.11±0.01a 14.40±0.45a 80.34±0.36a 3.9±0.01a 0.02±0.01a
C
I 11.43±0.64a 1.33±0.03a 0.11±0.00a 2.41±0.32a 77.67±0.66a 3.58±0.12a 0.36±0.01a 0.77±0.02a 0.25±0.01a 0.12±0.02a 14.45±0.95a 79.35±0.69b 4.35±0.13a 0.04±0.01b
II 12.01±0.27a,b 1.36±0.06a 0.10±0.00a 2.29±0.17a 77.33±0.14a 3.73±0.04a 0.37±0.01a 0.81±0.01b 0.25±0.00a 0.11±0.02a 14.92±0.13a,b 79.04±0.08a,b 4.54±0.04a 0.01±0.00a,b
III 13.00±0.78b 1.34±0.03a 0.11±0.01a 2.71±0.16a 76.22±0.71a 3.73±0.08a 0.36±0.01a 0.80±0.01a,b 0.25±0.00a 0.10±0.00a 16.30±0.65b 77.91±0.69a 4.53±0.08a 0.03±0.01a
F
I 10.85±0.56a 0.88±0.02a 0.10±0.01a 2.99±0.17a 78.77±0.58a 3.56±0.08a 0.34±0.01a 0.63±0.05a 0.22±0.02a 0.11±0.02a 14.42±0.72a 79.96±0.58a 4.19±0.10a 0.05±0.02a
II 11.22±0.34a 0.93±0.09a 0.13±0.04a 2.86±0.18a 78.69±0.25a 3.66±0.05a,b 0.38±0.04a 0.60±0.03a 0.27±0.06a 0.11±0.01a 14.73±0.53a 80.02±0.14a 4.26±0.03a,b 0.04±0.01a
III 11.35±0.11a 0.90±0.04a 0.10±0.00a 2.94±0.05a 78.73±0.09a 3.73±0.03b 0.35±0.01a 0.63±0.01a 0.23±0.00a 0.10±0.00a 14.86±0.05a 79.96±0.12a 4.36±0.04b 0.04±0.01a
A
I 13.36±0.74a 1.17±0.02a 0.11±0.03a 2.28±0.10a 77.09±1.01a 2.94±0.05a 0.33±0.02a 0.65±0.02a 0.24±0.02a 0.10±0.01a 16.19±0.78a 78.61±1.03a 3.59±0.07a 0.05±0.03a
II 13.14±0.52a 1.16±0.01a 0.10±0.00a 2.32±0.10a 77.33±0.24a 3.07±0.11a 0.35±0.03a 0.69±0.01a,b 0.24±0.00a 0.11±0.01a 16.05±0.44a 78.84±0.24a 3.77±0.11a 0.02±0.01a
III 12.18±0.71a 1.17±0.04a 0.10±0.00a 2.27±0.13a 78.29±0.74a 3.31±0.05a 0.34±0.01a 0.74±0.03b 0.24±0.01a 0.10±0.01a 15.02±0.68a 79.82±0.77a 4.05±0.08b 0.04±0.02a
D
I 12.17±0.64a 1.18±0.40a 0.08±0.03a 3.16±0.26a 76.94±0.76a 3.85±0.20a 0.36±0.01a 0.63±0.03a 0.22±0.03a 0.11±0.01a 15.94±0.88a 78.41±0.42a 4.48±0.23a 0.04±0.03a
II 11.92±0.87a,b 0.94±0.01a 0.09±0.00a 2.98±0.03a 77.19±0.74a 4.03±0.06a 0.37±0.01a 0.67±0.01a 0.24±0.01a 0.11±0.00a 15.52±0.86a 78.47±0.72a 4.70±0.07a 0.04±0.02a
III 13.55±0.26b 0.96±0.05a 0.09±0.01a 3.02±0.14a 76.04±0.39a 3.98±0.06a 0.35±0.02a 0.67±0.02a 0.23±0.01a 0.10±0.01a 17.15±0.42a 77.32±0.41a 4.65±0.08a 0.03±0.01a
Tesis Doctoral
125
4.- Mejora de la estabilidad y de la fracción de carotenoides en AOVE´s
Tabla 4.3
Composición de tocoferoles expresada en (mg/kg de aceite de oliva) de AOVE´s sin (I) y con
extracto de S. almeriensis (II = 0,1 mg/ml; III = 0,21 mg/ml).
Olive Oil α- β- γ- Total
Tocopherol Tocopherol Tocopherol tocopherols
B
I 257±6.1 a 4.9±0.1 a 50±0.9 b 312±6.8 a
II 273±1.2 b 4.7±0.2 a 50±0.1 b 328±1.8 b
III 261±4.4 a 4.5±0.1 a 46±0.4 a 311±4.6 a
C
I 429±9.8 a 5.7±0.2 a 55±2.4 a 489±11.4 a
II 451±20.3 a 5.5±0.3 a 54±1.9 a 511±20.2 a
III 435±5.2 a 5.4±0.1 a 52±2.5 a 492±6.7 a
F
I 119±21.4 a 4.1±0.1 a 44±3.5 a 159±24.7 a
II 121±19.9 a 4.1±0.0 a 42±2.8 a 168±22.6 a,b
III 137±20.6 a 4.2±0.1 a 42±3.3 a 183±24.0 b
A
I 336±25.8 a 5.2±0.1 b 42±5.1 a 383±30.8 a
II 330±26.5 a 5.0±0.2a,b 40±5.0 a 376±31.5 a
III 334±31.7 a 4.7±0.2 a 39±4.3 a 378±35.6 a
D
I 297±2.6 a 5.0±0.1 a 51±0.6 b 353±3.2 a
II 297±2.0 a 4.9±0.1 a 49±0.6a,b 351±2.6 a
III 307±11.7 a 4.8±0.1 a 49±1.4 a 360±13.2 a
Tesis Doctoral
126
5. ESTUDIOS DE ESTABILIDAD DE
ACEITES DE OLIVA VÍRGENES EXTRA
ENRIQUECIDOS CON ANTIOXIDANTES
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
5.1.- INTRODUCCIÓN
Es bien conocido que los cambios de tipo químico que se producen en los aceites
de oliva pueden deberse a diversos factores, entre los que cabe destacar la exposición a
la luz, la temperatura y el transcurso del tiempo desde la obtención de los mismos. Estas
alteraciones de los aceites con respecto a sus propiedades iniciales, se pueden
monitorizar siguiendo el cambio del color de los mismos, ya que existe una estrecha
relación entre los cambios químicos y la variación del color de la matriz (degradación de
la misma).
En este sentido, seguir los cambios de color en los aceites es un método sencillo
para evaluar la estabilidad de los mismos frente a las principales causas de su
degradación. Así, en este capítulo se ha estudiado la degradación de distintos aceites
frente a la exposición a luz ultravioleta (foto-estabilidad), frente al calentamiento (termo-
estabilidad) y frente al transcurso del tiempo (estabilidad temporal). Además, se han
realizado otros estudios específicos de estabilidad para AOVE´s con distinto índice de
maduración y en aceites procedentes de diferentes variedades de fruto. En las
experiencias de influencia del índice de maduración del fruto sobre la estabilidad de los
aceites, se usaron muestras de aceite procedentes de la misma almazara, con un mismo
proceso de extracción, y lo único que varió fue la época de recolección de la aceituna
(correspondiente a los meses de Octubre, Noviembre y Diciembre de 2013), siendo ésta
de la variedad Picual. Para la experiencia de estudio de estabilidad en función de la
variedad del fruto, de nuevo todas las muestras procedían de la misma almazara y se
obtuvieron con el mismo proceso de extracción, produciéndose aceites de una misma
época dentro de la campaña 2013-2014, pero con frutos de 4 variedades diferentes:
Picual, Arbequina, Frantoio y Royal.
En todos estos estudios nuestro interés principal es comparar la degradación
sufrida por AOVE’s puros y enriquecidos con antioxidantes procedentes de la microalga
Scenedesmus almeriensis, con el fin de saber si la adición de estos antioxidantes resulta
también beneficiosa o no, desde el punto de vista de la estabilidad del producto.
Tesis Doctoral
127
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
5.2.- MATERIALES Y MÉTODOS
Se ha utilizado el extracto de antioxidantes de concentración igual a 132 mg/ml,
descrito en el capítulo 3 de esta Tesis Doctoral. Concretamente, para los estudios
realizados de foto-estabilidad y termo-estabilidad se han elegido dos concentraciones de
trabajo: 0,05 y 0,1 mg luteína/ml, con las que se aportarían al organismo 1,8 y 3,6 mg de
luteína respectivamente, con 36 ml de ingesta de AOVE diaria. Estas cantidades de
luteína, sumadas a las ingeridas con el resto de alimentos de la dieta mediterránea
tradicional, permitirían alcanzar los valores recomendados para la prevención de las
enfermedades asociadas a su déficit (3-6 mg/día).
Para las medidas de color se ha utilizado un espectrofotómetro Konica Minolta
CM-5. En este instrumento el rango de longitud de onda es de 360-740 nm con pasos de
10 nm. La fuente de luz es una lámpara de xenón pulsada. La geometría de medida es
d/8 (reflectancia) y d/0 (transmitancia). El diámetro de la esfera integradora es: 152 mm.
El rango de temperatura de operación es de 13-33 ºC y menos del 80% de humedad
relativa, mientras que el rango de valores de temperatura/humedad para el correcto
almacenamiento del instrumento es de 0-40 ºC y menos del 80% de humedad relativa. El
software utilizado ha sido SpectraMagic NX PRO USB, suministrado por el mismo
fabricante del instrumento. En todas las medidas de color hemos supuesto iluminante CIE
D65 y observador patrón CIE 1964.
En primer lugar, fue necesario calibrar el instrumento y, como las medidas se
realizaron por transmitancia, siguiendo las normas del fabricante, se utilizó una placa
negra y opaca (suministrada por el fabricante) para calibrar el cero, y agua destilada en el
interior de una cubeta transparente de cuarzo con unas dimensiones de 4,2 x 3,2 x 1,0
cm (altura x anchura x paso de luz), para calibrar el blanco de referencia (L* = 100). A
continuación, se puede proceder ya a la medida de los parámetros de color de las
muestras, proporcionando el equipo de forma inmediata los parámetros L*, a* y b*,
correspondientes a la muestra, además de la diferencia de color de dicha muestra con
respecto al estándar empleado (ΔL*, Δa*, Δb*, y ΔE*ab).
En cuanto a las medidas de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con extracto
de antioxidantes, éstas se han llevado a cabo utilizando las variaciones del color de
dichos aceites comparados con los mismos sin aditivar, como control de partida. Para las
medidas de foto-estabilidad se han sometido las muestras a exposición continua bajo la
luz ultravioleta de una cabina de control y comparación de color CAC 60 Verivide
Tesis Doctoral
128
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
(Imagen 5.1). La distribución espectral de esta fuente de luz UV se muestra en la Figura
5.1, pudiendo observarse principalmente que tiene un pico en la longitud de onda 367,0
nm con un ancho de banda a mitad de pico de 16,9 nm. En el plano donde se sitúan las
muestras la iluminancia es 4,01 lx, la irradiancia 0,311 W/m2, y las coordenadas de
cromaticidad (observador patrón CIE 1964) x= 0,1907, y= 0,1608. Las medidas de control
se hicieron a intervalos temporales de entre 1 y 7 días, distribuidos a lo largo de un
periodo de unos dos meses, y se realizaron siempre a temperatura ambiente (20 ºC).
Imagen 5.1
Muestras de aceites irradiadas en la cabina de control de iluminación CAC 60 Verivide (izquierda)
y detalle de la fuente de luz ultravioleta de dicha cabina (derecha).
Figura 5.1
Distribución espectral de potencia de la fuente de luz ultravioleta de la cabina Verivide CAC 60.
Tesis Doctoral
129
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
En los estudios de foto-estabilidad, para alcanzar las concentraciones
anteriormente mencionadas de 0,05 y 0,1 mg luteína/ml, se han pipeteado 311 y 636 µl
de extracto y llevado a cubetas de 14 ml para las determinaciones de color en el
espectrofotómetro (ver ecuaciones 3.1 y 3.2 de la sección 3.2.4, página 91).
Para el caso de las medidas de termo-estabilidad, las muestras se sumergieron en
un termostato de precisión Julabo, dotado de líquido Thermal H5S para poder trabajar a
temperaturas superiores a 100 ºC (Imagen 5.2). Las medidas de color de las muestras se
hicieron a intervalos de tiempo de entre 2 y 12 horas, aproximadamente, durante un
periodo total de tiempo de 74 horas, estando las muestras sometidas a una temperatura
constante de 120 ºC.
Imagen 5.2
Muestras de AOVE´s sometidas a 120 ºC en un baño termostático (izquierda) y detalle del
termostato (derecha).
En este caso, los tubos que albergan las muestras son de 17 ml de capacidad, por
lo que ha sido necesario pipetear 0,377 y 0,772 ml de extracto para alcanzar las
concentraciones de 0,05 y 0,1 mg de luteína/ml aceite, respectivamente.
∗ , í
í= 0,05 ; x = 0,377 ml = 377 μl extracto Ecuación 5.1
∗ , í
í= 0,1 ; x = 0,772 ml = 772 μl extracto Ecuación 5.2
Tesis Doctoral
130
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Por último, las medidas de estabilidad temporal de los aceites se realizaron a lo
largo de un periodo de 16 meses, durante el cual las muestras de aceite se mantuvieron
en la oscuridad, en un lugar seco y a una temperatura de 20 ºC.
5.3.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados que se muestran en este apartado corresponden al global de los
experimentos realizados con todos los aceites y han sido elegidos a título de ejemplo.
Además, para su mejor entendimiento, en el Anexo I (página 212) se muestran tanto las
tablas como las gráficas de todos los aceites ensayados comparando entre ellos de forma
individualizada y colectivamente.
5.3.1.- ESTABILIDAD EN FUNCIÓN DE LA RADIACIÓN INCIDENTE: FOTO-
ESTABILIDAD
Es importante evaluar en los AOVE´s el efecto producido por la exposición a la
radiación electromagnética, puesto que conlleva cierta degradación de los mismos. Se
han utilizado cinco AOVE´s diferentes: cuatro de la variedad Picual, “B” (Santuario de
Mágina), “C” (Oro Bailén), “D” (Oro de Génave) y “L” (Castillo de Canena Picual); y un
quinto de la variedad Arbequina “M” (Castillo de Canena Arbequina) (Tabla 3.1, página
86). Se han ensayado dos concentraciones de luteína diferentes: 0,05 y 0,1 mg/ml. En
todos los casos las medidas se realizaron a temperatura ambiente y las muestras
estuvieron sometidas a exposición controlada continua a luz ultravioleta en la cabina de
iluminación CAC 60 Verivide. El utilizar luz ultravioleta supone determinar la foto-
estabilidad en las condiciones menos favorables, ya que del conjunto de radiaciones que
inciden en los aceites procedentes del sol, ésta es la zona más energética y por tanto la
más agresiva para las muestras.
En las Figuras 5.2, 5.3 y 5.4 se representa la diferencia de color CIELAB (ΔE*ab)
respecto al color inicial (muestras no irradiadas), frente al tiempo de exposición a la luz
ultravioleta, considerando AOVE´s sin antioxidantes y enriquecidos con las dos
concentraciones de extracto de antioxidantes antes indicadas.
Tesis Doctoral
131
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
120
100
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 5.2
Diferencias de color CIELAB producidas en AOVE´s sin enriquecer, como consecuencia de
exposición continua a luz ultravioleta.
La Figura 5.2 muestra la evolución en la degradación de los diferentes AOVE´s sin
enriquecer con extracto de antioxidantes. Puede apreciarse que la muestra que más se
degrada por exposición a la luz ultravioleta es la correspondiente al aceite “C” (Oro
Bailén), mientras que las que menos degradación sufren son las muestras
correspondientes a los aceites “L” y “M” (Castillo de Canena variedad Picual y Castillo de
Canena variedad Arbequina). Por tomar un valor de referencia, observamos en la Figura
5.2 que, transcurridos dos meses, los aceites “C” (Oro Bailén) y “D” (Oro de Génave), que
son los que más se degradan, experimentan una variación respecto al color inicial
cercana a 100 unidades CIELAB, habiendo pasado a ser prácticamente incoloros. Para
ese mismo periodo, los otros 3 aceites experimentan un cambio de color en torno a 60
unidades CIELAB, que es también un valor muy elevado.
Las Figuras 5.3 y 5.4 muestran la variación del color con la irradiación UV para los
AOVE’s anteriores enriquecidos con extracto de antioxidantes de concentraciones 0,05 y
0,1 mg luteína/ml, respectivamente. Puede apreciarse como inicialmente (primer mes) los
aceites aguantan muy bien la exposición a luz ultravioleta, y que es a partir del segundo
mes cuando comienzan a degradarse fuertemente los aceites con la menor concentración
de antioxidante (0,05 mg luteína/ml). Se observa que al enriquecer con 0,1 mg luteína/ml
(Figura 5.4), las muestras de los 3 aceites (“B”, “C” y “D”) son muy estables e incluso
Tesis Doctoral
132
∆E*ab(D65)
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
transcurridos casi dos meses de continua irradiación la degradación sufrida no llega a
superar las 20 unidades CIELAB.
120
SM
100 OB
OG
80 CCP
CCA
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 5.3
Diferencias de color CIELAB producidas en AOVE´s enriquecidos con extracto de antioxidantes de
concentración 0,05 mg luteína/ml, como consecuencia de exposición continua a luz ultravioleta.
120
SM
100
OB
80 OG
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 5.4
Diferencias de color CIELAB producidas en AOVE´s enriquecidos con extracto de antioxidantes de
concentración 0,1 mg luteína/ml, como consecuencia de exposición continua a luz ultravioleta.
Tesis Doctoral
133
∆E*ab(D65) ∆E*ab(D65)
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Para facilitar la comparación, las Figuras 5.5 y 5.6 muestran la foto-estabilidad de
los aceites “B” y “C” enriquecidos con antioxidante de concentración 0,05 mg luteína/ml.
Se puede apreciar claramente como el aceite “B”, aguanta mejor (tanto en la muestra
control como en la muestra enriquecida) la exposición a luz ultravioleta. Pero
especialmente hay que destacar que la adición del extracto de antioxidantes mejora
mucho la foto-estabilidad de los aceites durante el primer mes de irradiación con luz
ultravioleta.
120
Control
100 Antioxidantes
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 5.5
Foto-estabilidad del AOVE “B” (Santuario de Mágina) bajo condiciones de iluminación
controlada con lámpara ultravioleta. Consideramos el AOVE puro o sin enriquecer (control) y el
enriquecido con extracto de antioxidantes de concentración 0,05 mg/ml.
Tesis Doctoral
134
∆E*ab(D65)
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
120
Control
100 Antioxidantes
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 5.6
Foto-estabilidad del AOVE “C” (Oro Bailén) bajo condiciones de iluminación controlada con
lámpara ultravioleta. Consideramos el AOVE puro o sin enriquecer (control) y el enriquecido con
extracto de antioxidantes de concentración 0,05 mg/ml.
En todos los casos ensayados, los AOVE´s enriquecidos son más estables y
aguantan mejor la degradación producida por exposición a la radiación ultravioleta. El
AOVE puro que más se degrada es “C” (Oro Bailén), llegando a experimentar un cambio
de color superior a las 100 unidades CIELAB tras dos meses de exposición continua a
luz ultravioleta. Sin embargo, en todos los casos, los AOVE´s enriquecidos en luteína
hasta una concentración de 0,1 mg/ml, muestran variaciones de color que apenas
superaron las 20 unidades CIELAB. En definitiva, podemos concluir que los AOVE´s
enriquecidos se encuentran más protegidos que los controles (AOVE´s sin aditivar) y
aguantan mejor la degradación causada por exposición a luz ultravioleta.
El resto de resultados y gráficas correspondientes a los demás aceites ensayados
se muestran en el Anexo I (apartado 9.1.1, páginas 212-223).
Tesis Doctoral
135
∆E*ab(D65)
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
5.3.2.- ESTABILIDAD EN FUNCIÓN DE LA TEMPERATURA: TERMO-ESTABILIDAD
Otra propiedad importante de los AOVE´s, que merece ser estudiada, es el
comportamiento de los mismos frente a la temperatura. Es bien conocido que la
temperatura produce degradación en los AOVE´s y por ello se ha procedido a estudiar
este hecho y cómo influye en el mismo la adición de nuestro antioxidante. Así, se han
sometido los AOVE´s a una temperatura constante de 120 ºC y se ha ido midiendo su
color periódicamente durante un intervalo de tiempo de 74 horas. Se han utilizado los
mismos AOVE´s que en el apartado anterior de foto-estabilidad y también se han
ensayado las dos mismas concentraciones de antioxidantes antes indicadas (0,05 y 0,1
mg de luteína por ml de aceite).
80
SM
70
OB
60
OG
50 CCP
40 CCA
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 5.7
Diferencias de color CIELAB de los AOVE´s sin enriquecer en función del tiempo de
calentamiento a 120 ºC.
La Figura 5.7 muestra la variación de color de los diferentes AOVE´s sin
enriquecer, y en ella puede observarse como el más estable es el aceite “D” (Oro de
Génave), mientras que el que más se degrada es el aceite “M” (Castillo de Canena
variedad Arbequina). Análogamente, las Figuras 5.8 y 5.9 muestran la evolución del color
para las muestras enriquecidas con 0,05 y 0,1 mg luteína/ml, respectivamente.
Tesis Doctoral
136
∆E*ab(D65)
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
80
SM
70
OB
60 OG
CCP
50
CCA
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 5.8
Diferencias de color CIELAB de los 5 AOVE´s enriquecidos con extracto de antioxidantes
(0,05 mg luteína/ml), en función del tiempo de calentamiento a 120 ºC.
.
80
SM
70
OB
60 OG
CCP
50
CCA
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 5.9
Diferencias de color CIELAB de los 5 AOVE´s enriquecidos con extracto de antioxidantes
(0,1 mg luteína/ml), en función del tiempo de calentamiento a 120 ºC.
Tesis Doctoral
137
∆E*ab(D65) ∆E*ab(D65)
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Observando, por ejemplo, el aceite “L” (Castillo de Canena variedad Picual), la
Figura 5.10 muestra el efecto de las dos concentraciones ensayadas para dicho aceite.
Aunque 0,1 mg luteína/ml de aceite es una concentración que “protege” algo más, el valor
de cambio de color después de 60 horas de calentamiento a 120 ºC no es muy diferente
(18 frente a 23 unidades CIELAB), pero sí que hay una diferencia de color muy grande
respecto al valor de más de 55 unidades CIELAB obtenido para el aceite sin enriquecer.
80
Control
70 CCP 0,05
60 CCP 0,1
50
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 5.10
Diferencias de color CIELAB en el AOVE “L” sin enriquecer (control) y enriquecido con
extracto de antioxidantes de concentraciones 0,05 mg luteína/ml y 0,1 mg luteína/ml, en función
del tiempo de calentamiento a 120 ºC.
Los resultados muestran cómo el aceite no enriquecido con antioxidantes se
degrada térmicamente mucho más rápido que el mismo aceite enriquecido. Así, los
aceites control, tras sometimiento a 120 ºC durante 74 horas, sufren unas diferencias de
color en el rango de 55-75 unidades CIELAB, mientras que en los aceites enriquecidos
bajo las mismas condiciones de ensayo las diferencias de color están entre 18-40
unidades CIELAB para 0,05 mg/ml y entre 14-22 unidades CIELAB para 0,1 mg/ml. Estos
resultados vuelven a demostrar el efecto protector, en este caso frente a la exposición a
temperaturas elevadas, que tiene la presencia de extracto de antioxidantes añadido al
aceite.
El resto de resultados y gráficas correspondientes a los demás aceites ensayados
se muestran en el Anexo I (apartado 9.1.2, páginas 224-237).
Tesis Doctoral
138
ΔE*ab(D65)
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
5.3.3.- ESTABILIDAD EN FUNCIÓN DEL TIEMPO: CONSUMO PREFERENTE
Otra propiedad muy deseable en los AOVE´s es el mantenimiento de sus
propiedades físico-químicas el mayor tiempo posible. Es conocido que, para los aceites
cosechados en una determinada campaña, se recomienda que se consuman en el año
posterior a su cosechado, ya que si se supera este periodo de tiempo, las propiedades
esenciales de los aceites podrían verse alteradas. En este sentido, se ha estudiado la
estabilidad de cinco AOVE´s diferentes, sin enriquecer y enriquecidos con extracto de
antioxidantes (0,05 mg luteína/ml aceite), analizando la influencia del paso del tiempo
sobre su color. Concretamente, se han realizado medidas de color a temperatura
ambiente (20 ºC), manteniendo los AOVE´s almacenados en la oscuridad y en ambiente
seco, durante un periodo de 16 meses. A modo de ejemplo, las Figuras 5.11 y 5.12
muestran los resultados obtenidos para los 5 AOVE´s ensayados (Tabla 3.1, página 86).
12
SM
10 OB
OG
8 CCP
CCA
6
4
2
0
0 100 200 300 400 500
DÍAS
Figura 5.11
Estabilidad temporal de 5 AOVE´s bajo condiciones de almacenamiento seco, en oscuridad y a
temperatura ambiente (20 ºC). Estos datos corresponden a los aceites sin enriquecer.
Tesis Doctoral
139
ΔE*ab(D65)
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
12
SM
10 OB
OG
8
CCP
6 CCA
4
2
0
0 100 200 300 400 500
DÍAS
Figura 5.12
Estabilidad temporal de 5 AOVE´s bajo condiciones de almacenamiento seco, en oscuridad
y a temperatura ambiente (20 ºC). Estos datos corresponden a los aceites enriquecidos con 0,05
mg luteína/ml aceite.
Las Figuras 5.11 y 5.12 muestran que, aunque para ambas muestras, control y
enriquecida, las variaciones de color son relativamente pequeñas, los valores obtenidos
para los aceites enriquecidos son siempre menores que los obtenidos para los aceites sin
enriquecer, lo cual vuelve a mostrar el efecto protector frente a la degradación, en este
caso temporal, de las muestras enriquecidas mediante nuestro extracto de antioxidantes.
El resto de resultados y gráficas correspondientes a los demás aceites ensayados
se muestran en el Anexo I (apartado 9.1.3, páginas 238-244).
5.3.4.- ESTUDIOS ESPECÍFICOS DE ESTABILIDAD
En este apartado, se ha prestado atención a la posible influencia que puede tener
sobre la estabilidad (foto-estabilidad y termo-estabilidad) de los aceites el enriquecimiento
realizado con el extracto de antioxidantes, considerando: 1) aceites que proceden de una
misma variedad de fruto pero con distinto grado de madurez (secciones 5.3.4.1 y 5.3.4.3);
y 2) aceites procedentes de frutos de distintas variedades (secciones 5.3.4.2 y 5.3.4.4).
Tesis Doctoral
140
ΔE*ab(D65)
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
5.3.4.1.- Foto-estabilidad en función del índice de maduración del fruto
En esta experiencia, se han usado aceites que proceden del mismo tipo de
aceituna (Picual) y en los que el proceso de elaboración ha sido exactamente el mismo,
con la única diferencia de que se han utilizados aceitunas con diferente índice de
madurez, es decir recogidas en 3 meses distintos (Octubre, Noviembre y Diciembre del
año 2013). La Figuras 5.13 y 5.14 muestran la foto-estabilidad de las tres muestras de
aceite tipo “L” (Castillo de Canena Picual) obtenidas a partir de frutos con diferente mes
de recolección, sometidas a la exposición de luz ultravioleta en cabina de control de
iluminación, considerando aceites sin enriquecer y enriquecidos con concentración de
0,05 mg luteína/ml aceite, respectivamente.
140
Octubre
120
Noviembre
100 Diciembre
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 5.13
Foto-estabilidad de los AOVE´s Castillo de Canena variedad Picual, procedentes de frutos con 3
grados distintos de maduración. Estos resultados corresponden a los aceites sin enriquecer.
Tesis Doctoral
141
ΔE*ab(D65)
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
140
Octubre
120
Noviembre
100 Diciembre
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 5.14
Foto-estabilidad de los AOVE´s Castillo de Canena variedad Picual, procedentes de frutos con 3
grados distintos de maduración, y enriquecidos con extracto de antioxidantes (0,05 mg luteína/ml
aceite).
Los resultados obtenidos muestran que, para el aceite sin enriquecer (Figura
5.13), inicialmente es más estable el correspondiente al mes de Diciembre que el
correspondiente al de Octubre, pero a partir de unos 20 días de irradiación la tendencia
es la contraria. Para los aceites enriquecidos en luteína (Figura 5.14), puede verse
claramente que son muchos más estables que los aceites sin enriquecer, como ya se
indicó en la sección 5.3.1, y además se observa de nuevo que inicialmente son un poco
más estables los aceites de Diciembre que los de Octubre, revirtiendo esta tendencia sólo
tras unos 50 días de irradiación.
Estos resultados mostrados utilizando diferentes gráficas comparando los
diferentes meses se muestran en el Anexo I (apartado 9.2.1, páginas 245-248).
Tesis Doctoral
142
ΔE*ab(D65)
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
5.3.4.2.- Foto-estabilidad en función de la variedad del fruto
Análogamente, se ha procedido a estudiar la influencia que puede tener el
enriquecimiento en extracto de antioxidantes, para el caso de aceites que proceden de
diferentes tipos de aceituna, y en los que el resto de variables de procesado se han
mantenido exactamente iguales. Concretamente, se han utilizado aceites procedentes de
cuatro variedades de fruto: Picual, Arbequina, Frantoio y Royal.
La Figuras 5.15 y 5.16 muestran la foto-estabilidad de las cuatro variedades de
aceite sin enriquecer y enriquecidos con concentración 0,05 mg luteína/ml aceite,
respectivamente.
120
Picual
100 Arbequina
Frantoio
80 Royal
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 5.15
Foto-estabilidad de los AOVE´s procedentes de frutos de 4 variedades diferentes. Estos
resultados corresponden a los aceites sin enriquecer.
Tesis Doctoral
143
ΔE*ab(D65)
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
120
Picual
100 Arbequina
Frantoio
80 Royal
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 5.16
Foto-estabilidad de los AOVE´s procedentes de frutos de 4 variedades diferentes, enriquecidos
con extracto de antioxidantes (0,05 mg luteína/ml aceite).
Las gráficas de estabilidad de los aceites sin enriquecer (Figura 5.15) muestran
que a partir de unos 20 días de irradiación la variedad Frantoio es la menos estable,
seguida por las variedades Arbequina, Royal y Picual (en ese orden). Durante los
primeros 20 días de irradiación la estabilidad de las variedades Royal, Arbequina y Picual
es muy similar, observándose para la variedad Frantoio una óptima estabilidad durante
los 10 días iniciales de irradiación, aproximadamente.
Por su parte, la Figura 5.16 muestra el comportamiento de los AOVE´s
enriquecidos con extracto de antioxidantes hasta alcanzar una concentración de 0,05 mg
luteína/ml aceite, observándose un incremento en la estabilidad muy apreciable respecto
de los mismos aceites sin enriquecer, como ya se indicó en la sección 5.3.1. Además, se
observa que durante los primeros 40 días de irradiación hay una notable estabilidad
(valores inferiores a 20 unidades CIELAB) para todas las variedades, especialmente para
la Frantoio, si bien esta tendencia cambia notablemente para dos de las variedades
(Arbequina y Frantoio) para irradiaciones más duraderas.
Estos resultados mostrados utilizando diferentes gráficas comparando las
diferentes variedades de fruto se muestran en el Anexo I (apartado 9.2.2, páginas 249-
254).
Tesis Doctoral
144
ΔE*ab(D65)
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
5.3.4.3.- Termo-estabilidad en función del índice de maduración del fruto
Para realizar este estudio se ha elegido un AOVE de la variedad Picual y
denominación de origen Castillo de Canena. Se usaron tres remesas de muestras de
aceite procedentes de los meses de Octubre, Noviembre y Diciembre del año 2013, en
las que el proceso de elaboración ha sido el mismo y por tanto la única variable que hace
diferentes a los AOVE´s es el índice de madurez de la aceituna utilizada.
60
Octubre
50 Noviembre
Diciembre
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 5.17
Termo-estabilidad de los AOVE´s Castillo de Canena variedad Picual, procedentes de frutos con 3
grados distintos de maduración. Estos resultados corresponden a los aceites sin enriquecer.
En la Figura 5.17 se muestra la evolución de la estabilidad en función del tiempo
transcurrido para los aceites sin enriquecer sometidos a 120 ºC en baño termostático.
Puede apreciarse que, las muestras más estables corresponden a los aceites
procedentes de aceituna cosechada en Octubre y por tanto con índice de madurez
inferior. Llama la atención que los resultados de Noviembre no se encuentren entre los de
Octubre y Diciembre. Transcurridos 3 días de exposición a la temperatura de 120 ºC, este
aceite del mes de Octubre sufre una variación de color de 40 unidades CIELAB frente a
las 53 y 55 unidades CIELAB de los aceites de Diciembre y Noviembre respectivamente.
Tesis Doctoral
145
∆E*ab(D65)
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
60
Octubre
50 Noviembre
Diciembre
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 5.18
Termo-estabilidad de los AOVE´s Castillo de Canena variedad Picual, procedentes de frutos con 3
grados distintos de maduración, y enriquecidos con extracto de antioxidantes (0,05 mg luteína/ml
aceite).
La Figura 5.18 muestra la estabilidad de los mismos AOVE´s enriquecidos con
extracto de antioxidantes con 0,05 mg luteína/ml aceite. Puede apreciarse que
transcurridas 72 horas de exposición térmica, las diferencias de color respecto del color
inicial se encuentran entre 10 y 22 unidades CIELAB, valores muy inferiores a los de los
aceites sin enriquecer. Se puede apreciar en la Figura 5.18 que la estabilidad es bastante
similar e independiente del mes de recolección de la aceituna siendo diferente el índice
de madurez de la misma, cosa que no sucede tanto en la Figura 5.17. Curiosamente se
observa también en la Figura 5.18 que las muestras de Octubre suelen ser las de menor
termo-estabilidad, al contrario de lo que sucede en la Figura 5.17.
Estos resultados mostrados utilizando diferentes gráficas comparando los
diferentes meses se muestran en el Anexo I (apartado 9.2.3, páginas 255-258).
Tesis Doctoral
146
∆E*ab(D65)
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
5.3.4.4.- Termo-estabilidad en función de la variedad del fruto
Se ha utilizado una temperatura en el baño termostático de 120 ºC y los aceites se
han ido midiendo a distintos tiempos transcurridos desde su preparación e inmersión en
el baño. En este caso, los AOVE´s utilizados han sido todos de la misma denominación,
elaborados siguiendo el mismo proceso. La diferencia entre ellos es el tipo de fruto
utilizado para la elaboración del aceite: Picual (aceite “L”), Arbequina (aceite “M”),
Frantoio (aceite “N”) y Royal (aceite “P”) (Tabla 3.1, página 86).
Las Figuras 5.19 y 5.20 muestran los datos de estabilidad en función del tiempo
transcurrido, para los aceites sin enriquecer y los enriquecidos con extractos de
antioxidantes con 0,05 mg luteína/ml aceite. Observando la Figura 5.19 se puede apreciar
que el aceite menos estable es el de la variedad Frantoio, mientras que las otras tres
variedades tienen una estabilidad bastante similar. Lo mismo se observa en la Figura
5.20, si bien las diferencias de color son considerablemente menores que las de la Figura
5.19 (aceites sin enriquecer), como ya se había indicado previamente en la sección 5.3.2.
80
Picual
70
Arbequina
60
Frantoio
50
Royal
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 5.19
Termo-estabilidad de los AOVE´s procedentes de frutos de 4 variedades diferentes. Estos
resultados corresponden a los aceites sin enriquecer.
Tesis Doctoral
147
∆E*ab(D65)
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
80
Picual
70
Arbequina
60
Frantoio
50
Royal
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 5.20
Termo-estabilidad de los AOVE´s procedentes de frutos de 4 variedades diferentes, enriquecidos
con extracto de antioxidantes (0,05 mg luteína/ml aceite).
Es importante resaltar que las variedades Picual, Arbequina y Royal son
suficientemente estables en comparación con los aceites sin enriquecer, produciéndose
diferencias de color CIELAB que al final del proceso de calentamiento son
aproximadamente unas cuatro veces inferiores. Se puede decir, por tanto, que el
enriquecimiento con extracto de antioxidantes produce un aumento de estabilidad muy
notable, independientemente de la variedad del fruto empleado en la elaboración del
aceite.
Estos resultados mostrados utilizando diferentes gráficas comparando las
diferentes variedades de fruto se muestran en el Anexo I (apartado 9.2.4, páginas 259-
263).
Tesis Doctoral
148
∆E*ab(D65)
5.- Estudios de estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
5.4.- CONCLUSIONES
Tras el análisis de tres de los puntos fundamentales que se relacionan con la
degradación físico-química de un AOVE (estabilidad frente a la radiación ultravioleta,
estabilidad frente a la temperatura y estabilidad frente al tiempo), así como de la
estabilidad de AOVE´s obtenidos con aceitunas de distinto índice de maduración y
variedades de fruto, se llega a la conclusión de que la adición del extracto de
antioxidantes procedente del alga Scenedesmus almeriensis a las matrices oleosas
produce una mejora importante en su estabilidad. Es decir, la estabilidad de los AOVE´s
enriquecidos con extracto de antioxidantes es mejor que la de la matriz original sin
aditivar.
Una vez analizada la estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con extracto de
antioxidantes frente a la temperatura, se obtienen resultados que podrían ser muy
beneficiosos, multiplicando la vida útil de los AOVE´s en algunos casos. Además, una de
las matrices más adecuadas para adicionar este extracto es el AOVE de la variedad
“Picual”, mientras que el de la variedad “Frantoio” ha mostrado una mayor degradación. A
pesar de que aumenta la vida útil del aceite control frente a la temperatura, su
degradación sigue siendo superior en relación a otros AOVE´s.
Los resultados obtenidos son muy positivos, ya que la adición del extracto de
antioxidantes a los AOVE´s aumentaría la vida útil de los mismos, además de incorporar
a nuestra dieta una gran cantidad de antioxidantes beneficiosos para nuestra salud (lo
que permite la prevención de la DMAE, entre otras cosas) sin tener que alterar nuestros
hábitos de consumo, ya que estarían incorporados en el propio AOVE, tanto para
consumo en crudo (prolongando el tiempo de conservación de un AOVE para que no se
degrade), como para su uso en cocina.
Tesis Doctoral
149
6. EMOCIONES Y PREFERENCIAS DE
COLOR EN AOVE´s ENRIQUECIDOS
CON ANTIOXIDANTES. ESTUDIOS DE
APRECIACIÓN VISUAL DE
POBLACIONES ACOSTUMBRADAS O
NO AL CONSUMO DE ACEITE DE OLIVA
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
6.1.- INTRODUCCIÓN
En este capítulo se ha realizado un estudio de las emociones suscitadas por el
color de los AOVE´s, tanto sin enriquecer como enriquecidos con 2 cantidades diferentes
de extracto de antioxidantes, con el objetivo principal de explorar hasta qué punto los
aceites enriquecidos con antioxidante pueden tener una aceptación diferente por parte de
posibles consumidores.
A falta de poder realizar ensayos organolépticos de cata gustativa de nuestros
aceites enriquecidos, debido a que primero deben de abordarse cuestiones de seguridad
alimentaria empleando animales de experimentación, por el momento simplemente se
aportan resultados derivados de la percepción visual del color de estos aceites. Estos
resultados pueden ser interesantes, al mostrarnos aspectos positivos y negativos de los
AOVE´s enriquecidos respecto a los no enriquecidos, a juicio de distintos tipos de
observadores tales como, por ejemplo, personas del ámbito de nuestra cultura
mediterránea o personas de otras procedencias geográficas. Actualmente estamos
llevando a cabo en el Instituto de Tecnología de Kyoto (Prof. Tetsuya Sato, KIT, Japón)
un experimento muy similar al descrito en este capítulo, pero con observadores
japoneses. Este capítulo de la Tesis Doctoral tiene como objetivo hacer una primera
evaluación de las emociones y preferencias de color suscitadas por un producto
alimenticio tan característico de la dieta mediterránea como es el aceite de oliva, en
miembros de diferentes culturas.
La metodología inicial para llevar a cabo estos estudios ha consistido en
encuestar a un grupo de personas procedentes de “países con tradición en el uso de
aceites de oliva” que podemos suponer muy acostumbrados a su consumición. Como se
verá más adelante, a partir de las entrevistas realizadas se han elegido los términos que
pensamos que mejor describen las características de los AOVE´s, según personas con
experiencia previa en el análisis sensorial y cata de AOVE´s. Aunque algunos
investigadores han hecho una distinción explícita entre “emociones de color” y
“preferencias de color”, al ser dos aspectos que están estrechamente relacionados en
esta Tesis hemos preferido considerar la preferencia como una emoción más (gusta-no
gusta), aunque no cabe duda de que es una emoción a la que conviene prestar una
atención muy especial, por su evidente relación con la decisión de compra por parte del
consumidor.
Tesis Doctoral
150
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
6.2.- MATERIALES Y MÉTODOS
En nuestro experimento han participado 28 observadores a los que se les pidió
que describieran 18 muestras (6 AOVE´s puros y también enriquecidos con 2 cantidades
de extracto de antioxidantes diferentes), conforme a un conjunto de 9 descriptores
consistentes en dos términos opuestos. En primer lugar, fue necesario buscar los mejores
descriptores posibles de las emociones relacionadas con los AOVE´s. Para ello se
realizaron entrevistas individuales a quince miembros del panel de cata de aceite de oliva
del Instituto de la Grasa (CSIC, Sevilla), expertos en el análisis sensorial del aceite de
oliva. Concretamente, se pidió a cada uno de ellos que describiesen libremente el aceite
de oliva virgen extra intentando dar respuesta a cada una de las cuatro preguntas
siguientes:
¿Cómo describiría un aceite de oliva virgen extra?
¿Cómo distingue dos aceites de oliva?
Imagine que está ante una persona de otro país, que no ha probado el aceite de
oliva, ¿cómo le explicaría qué es?
¿Cómo describiría la apariencia de un aceite?
Es destacable que en ningún momento se les explicó a los entrevistados que el
objetivo de la entrevista era hacer un estudio sobre el color del aceite de oliva, pues se
buscaban los principales descriptores generales, que, en principio, no tienen por qué
estar asociados de forma directa con el color del aceite (el estudio de dicha asociación es
precisamente el objetivo específico del experimento que se describe en este capítulo). A
partir de la grabación de estas entrevistas individuales, se contó el número de veces que
se citaron adjetivos calificativos de los aceites, y se eligieron los 9 términos más
mencionados y sus correspondientes opuestos, de manera que pudiéramos trabajar con
un número no muy alto de emociones, y que además su significado fuese fácilmente
comprensible para cualquier observador. Concretamente, los pares de términos (o
emociones) que resultaron elegidas para la descripción de los AOVE´s mediante este
procedimiento fueron los siguientes:
Tesis Doctoral
151
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
“Aromático – Inodoro”
“Amargo – Dulce”
“Fresco – Rancio”
“Saludable – No saludable”
“Gusta – No gusta”
“Natural – Artificial”
“Picante – No picante”
“Sabroso – Insípido”
“Áspero – Suave”
Aunque en algunos casos los 9 descriptores o emociones mencionadas pueden
inducir a alguna duda (por ejemplo, el mejor opuesto de “inodoro” podría ser “oloroso” y
no “aromático”), como criterio general hemos preferido usar exactamente los términos
obtenidos en las entrevistas individuales realizadas a los expertos del Instituto de la
Grasa.
Para realizar los experimentos, se han considerado 6 AOVE´s originales o sin
enriquecer (designados con la letra A) y, además, para cada uno de ellos, dos adiciones
de extracto de antioxidantes para obtener concentraciones de luteína de 0,05 mg/ml
(designados con la letra B) y de 0,1 mg/ml (designados con la letra C), de modo que
hemos evaluado un total de 18 muestras de aceite, que cubren una gama de colores
relativamente amplia o representativa (Imagen 9.3.1 del Anexo II, página 265), a fin de
poder estudiar las tendencias de las emociones y preferencias suscitadas por el color en
potenciales consumidores de AOVE´s.
En nuestro experimento han participado 28 observadores: 20 personas de
Andalucía, con tradición en el uso y consumo de AOVE´s y 8 personas de países
diversos, sin tradición en consumo de AOVE´s. En realidad la procedencia de estos
últimos 8 observadores es bastante diversa y, tratándose de un número escaso de
observadores, pensamos que los resultados de este grupo de personas son solamente
una primera tentativa que requiere confirmación mediante nuevos experimentos (por
ejemplo, el que actualmente se está desarrollando en KIT, Japón). Estos dos grupos de
observadores, como se reflejará más adelante, han generado resultados diferentes,
indicando que los hábitos alimenticios seguidos por los individuos están conectados con
sus emociones y preferencias, como cabría esperar. Durante el experimento, a cada
sujeto se le fue mostrando de forma aleatoria cada una de las 18 muestras pidiéndole
Tesis Doctoral
152
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
elegir entre las emociones opuestas citadas anteriormente. Además debían darle a la
emoción elegida una puntuación del 1 al 3, donde 1 significa “un poco”, 2
“moderadamente” y 3 “mucho”. Por ejemplo, si al ver una muestra de AOVE se piensa
que ese aceite sería muy amargo, la respuesta sería “amargo 3”; si, por el contrario, se
piensa que ese aceite sería un poco dulce la respuesta sería “dulce 1”. (Tabla 9.3.1 del
Anexo II, página 264). Cada persona repitió tres veces no consecutivas el juicio de cada
una de las 18 muestras en días diferentes presentadas siempre en orden aleatorio.
Para realizar los juicios visuales correspondientes a emociones suscitadas por el
color, las muestras de AOVE´s se presentaron en botellas de la misma forma y tamaño
(Imagen 6.1), situadas en el centro de una cabina de observación de color portátil
Verivide (fuente de luz D65), situada en una habitación oscura. En realidad, para nuestras
experiencias visuales modificamos todas las paredes originales de la cabina Verivide
portátil mediante un papel blanco no fluorescente para obtener una mayor luminosidad de
las muestras. También se indicó a los observadores que fijasen su observación
aproximadamente en la región central y homogénea marcada en la Imagen 6.1,
realizando sobre ellas sus juicios correspondientes.
Imagen 6.1
Detalle de una de las botellas utilizadas para el experimento de emociones suscitadas por el color
de los AOVE´s. El área que debe mirar el observador es la marcada con el círculo.
Las respuestas de los sujetos fueron analizadas de acuerdo a la ley del juicio
categórico de Torgerson. Con esta ley, para cada una de las 9 emociones estudiadas, se
obtienen valores z, que dan idea de la intensidad de cada estímulo. Con la información
recogida se obtiene una escala para cada emoción y cada grupo de observadores, con
Tesis Doctoral
153
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
los valores de contorno o de frontera, es decir, los puntos de la escala que, en promedio,
establecen las transiciones entre “un poco”, “moderadamente” y “mucho”, lo que permite
conseguir una aproximación a la valoración de los potenciales consumidores de los
diferentes AOVE´s mostrados.
En el Anexo II se muestran todos los datos que tienen que ver con las encuestas
realizadas y los test de apreciación visual, así como los 18 aceites mostrados a los
grupos de observadores (apartado 9.3, páginas 264-293).
6.3.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.3.1.- MUESTRAS USADAS EN EL EXPERIMENTO DE EMOCIONES DE COLOR
Se ha procedido a calcular las coordenadas CIELAB de las muestras usadas en el
experimento de emociones suscitadas por el color de AOVE´s, en el que se consideran
seis AOVE´s originales (A) y, para cada uno de ellos, dos adiciones de extracto de
antioxidantes que permiten obtener muestras con concentraciones en luteína de 0,05
mg/ml (B) y 0,1 mg/ml (C), respectivamente. Se hicieron tres medidas
espectrorradiométricas en la zona indicada en el círculo de la Imagen 6.1 para cada una
de las 18 muestras, de modo que el papel blanco de las paredes de la cabina actúa como
fondo (background), siendo los resultados promedio los de la Tabla 6.1.
Los resultados de la Tabla 6.1 son la media de tres medidas
espectrorradiométricas con muestras iluminadas por una fuente simuladora de D65 ante
un fondo blanco de coordenadas CIELAB: L* = 95,2; a* = -0,5; b* = -0,6. Es importante
hacer notar que el espectrorradiómetro se situó en la misma posición que ocupa la
cabeza de los observadores durante los experimentos visuales, a fin de poder medir con
precisión lo mismo que los observadores ven y juzgan. También es importante mencionar
que estas medidas instrumentales de color se realizaron aproximadamente cuando el
experimento visual estaba en su punto medio, de modo que se puedan dejar aparte los
posibles cambios de color de los AOVE´s con el paso del tiempo.
Según los resultados de la Tabla 6.1, tal y como se esperaba, se observa que en
general los aceites ensayados tienen valores de claridad (L*) media-alta, muy alto croma
(C*ab), y tonalidades amarillentas o amarillo-verdosas (hab). Concretamente, los valores L*
de oscilan entre 74,2 y 44,7, los de C*ab entre 104,8 y 60,5, y los del ángulo de tono hab
entre 104,3° y 75,7°.
Tesis Doctoral
154
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Tabla 6.1
Coordenadas de color CIELAB (fuente D65, observador patrón CIE 1964) correspondientes a los
seis AOVE´s originales (A) y sus dos adiciones de extracto de antioxidantes para obtener
concentraciones de 0,05 mg/ml (B) y 0,1 mg/ml (C).
Marca del Aceite Original Modo L* a* b* C*ab hab (°)
Fuenroble A 74,2 -3,5 104,7 104,8 91,9
Fuenroble B 65,8 15,3 99,1 100,3 81,2
Fuenroble C 61,3 23,8 93,1 96,1 75,7
Santuario Mágina A 65,1 -0,1 94,9 94,9 90,1
Santuario Mágina B 60,3 13,2 91,4 92,3 81,8
Santuario Mágina C 56,4 20,2 84,2 86,6 76,5
Oro Bailén A 70,4 -2,2 101,1 101,2 91,2
Oro Bailén B 63,8 14,2 96,3 97,4 81,6
Oro Bailén C 59,7 21,4 90,3 92,8 76,7
Castillo Canena (cosecha 2012) A 72,6 -4,9 103,8 103,9 92,7
Castillo Canena (cosecha 2012) B 65,4 13,2 97,8 98,7 82,3
Castillo Canena (cosecha 2012) C 60,7 22,9 92,3 95,1 76,1
Castillo Canena (Noviembre 2013) A 68,1 -12,7 97,3 98,1 97,4
Castillo Canena (Noviembre 2013) B 60,9 5,2 89,7 89,9 86,7
Castillo Canena (Noviembre 2013) C 56,0 15,3 82,8 84,2 79,5
Melgarejo A 52,2 -18,7 73,3 75,6 104,3
Melgarejo B 46,5 -3,9 66,0 66,1 93,4
Melgarejo C 44,7 0,3 60,5 60,5 89,7
La variabilidad de las tres medidas espectrorradiométricas realizadas es muy baja,
tal como muestra la Tabla 6.2, en cuyas dos últimas filas se muestran, para cada
coordenada de color CIELAB, los valores medios y los valores máximos de las
desviaciones típicas correspondientes, respectivamente. A efectos de nuestro
experimento visual sobre emociones suscitadas por el color, estas desviaciones típicas (o
variabilidad de la medida instrumental del color de las muestras) pueden considerarse
totalmente despreciables y no se considerarán en las figuras siguientes.
Tesis Doctoral
155
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Tabla 6.2
Desviaciones típicas de las coordenadas CIELAB correspondientes a las tres medidas
espectrorradiométricas de color realizadas para cada muestra, cuyos resultados promedio
aparecen en la Tabla 6.1.
Marca Aceite Modo L* a* b* C*ab hab (°)
Fuenroble A 0,11 0,05 0,34 0,33 0,04
Fuenroble B 0,02 0,09 0,05 0,06 0,05
Fuenroble C 0,27 0,05 0,47 0,46 0,06
Santuario Mágina A 0,31 0,05 0,81 0,81 0,03
Santuario Mágina B 0,12 0,03 0,09 0,08 0,02
Santuario Mágina C 0,23 0,08 1,07 1,06 0,11
Oro Bailén A 0,32 0,07 0,31 0,31 0,03
Oro Bailén B 0,19 0,02 0,41 0,40 0,05
Oro Bailén C 0,17 0,10 0,30 0,32 0,02
Castillo Canena (cosecha 2012) A 0,10 0,08 0,30 0,29 0,05
Castillo Canena (cosecha 2012) B 0,37 0,03 0,62 0,61 0,07
Castillo Canena (cosecha 2012) C 0,35 0,09 0,70 0,70 0,05
Castillo Canena (Noviembre 2013) A 0,17 0,22 0,73 0,71 0,17
Castillo Canena (Noviembre 2013) B 0,63 0,18 1,24 1,23 0,16
Castillo Canena (Noviembre 2013) C 0,51 0,02 0,80 0,78 0,11
Melgarejo A 0,72 0,22 1,63 1,63 0,15
Melgarejo B 0,06 0,02 0,12 0,12 0,03
Melgarejo C 0,03 0,07 0,28 0,28 0,06
Valores Medios - 0,26 0,08 0,57 0,57 0,07
Valores Máximos - 0,72 0,22 1,63 1,63 0,69
La Figura 6.1 muestra la evolución del color con la adición de extracto de
antioxidantes para cada una de las 6 muestras de aceite, considerando el plano a*, b* de
CIELAB, conforme a los datos de la Tabla 6.2. Los números que aparecen junto a cada
punto son los valores de L* (redondeados al entero más próximo), y los colores de las
muestras originales o sin adición de extracto (A), que son los que tienen máxima L* y
mínima a*, se han señalado mediante una flecha roja. Según muestra la Figura 6.1, la
adición de extracto produce un leve descenso de la coordenada L* (menor claridad), un
descenso de la coordenada b*, y un aumento de la coordenada a*. Estos cambios en las
coordenadas a* y b* hacen que la adición de extracto produzca un leve decrecimiento del
croma (C*ab) junto con un considerable descenso del ángulo de tono hab (véase también
Tabla 6.1). En particular, este descenso del ángulo de tono, que es el efecto más
relevante, se manifiesta en el hecho visualmente bien constatable de que las muestras
Tesis Doctoral
156
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
con extracto de antioxidantes son más rojizas que las originales, tal y como se esperaba.
Un detalle también observable en la Figura 6.1 es que el cambio de color entre las
muestras A-B es mayor que el cambio de color entre las muestras B-C, como indican las
distintas longitudes de los segmentos correspondientes. Por tanto, se puede decir que la
relación entre cambio de color y cantidad de extracto adicionado no es lineal, sino que al
principio (adición de una pequeña cantidad de extracto al aceite puro) el cambio es mayor
que al final. Es decir, con la adición del extracto de antioxidantes hay una tendencia de
saturación o aproximación a un color final, que se puede suponer cercano al color del
extracto puro.
Figura 6.1
Evolución del color con las dos adiciones de extracto de antioxidantes, para cada una de las 6
muestras de aceite (ver Tabla 6.1). Las flechas rojas indican el color del aceite puro (sin
antioxidantes procedente de microalgas). Los números junto a cada punto son los valores de la
tercera coordenada de color CIELAB, L* (claridad).
Los cambios de cada uno de los 3 principales atributos perceptivos del color en
coordenadas CIELAB como consecuencia de las dos adiciones de extracto de
antioxidantes se reflejan en la Figura 6.1a (claridad L*), 6.2b (croma C*ab) y 6.2c (tono
hab), siendo los aceites: aceites puros originales (A), con adición de 0,05 mg/ml de luteína
(B) y con adición de 0,1 mg/ml de luteína (C).
Tesis Doctoral
157
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Figura 6.2a
Cambios de claridad descritos mediante la coordenada CIELAB L*.
Figura 6.2b
Cambios de croma descritos mediante la coordenada CIELAB C*ab.
Tesis Doctoral
158
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Figura 6.2c
Cambios de tono descritos mediante la coordenada CIELAB ángulo de tono, hab
La magnitud y naturaleza de los cambios de color que sufren los aceites con las
dos adiciones de extracto de antioxidantes (llamados cambio A-B y A-C,
respectivamente) vienen también reflejadas en los resultados de la Tabla 6.2.
En la Tabla 6.3 se muestran las diferencias de color entre los aceites A-B y A-C en
unidades CIEDE2000 (E00), porque esta es la fórmula de diferencia de color
actualmente recomendada por ISO y CIE. Seguidamente, se muestran también esas
mismas diferencias de color en unidades CIELAB (E*ab), por ser ésta la fórmula de
diferencia de color con la que actualmente están más familiarizados la mayoría de los
usuarios.
Tesis Doctoral
159
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Tabla 6.3
Cambios de color entre aceites puros (A), y con adiciones de extracto para lograr concentraciones
de luteína de 0,05 mg/ml (B) y 0,1 mg/ml (C), en unidades CIEDE2000 (E00) y CIELAB (E*ab).
Las 3 últimas columnas dan el porcentaje de cambio en claridad (%L*), croma (%C*ab) y tono
(H*ab) CIELAB, y la última fila muestran los promedios de los 6 aceites.
Aceite Cambio E00 E*ab % L* % C*ab % H*ab
A-B 11,9 21,4 15,4 4,4 80,2
Fuenroble
A-C 18,3 32,3 15,9 7,2 76,9
A-B 8,4 14,6 10,9 3,3 85,8
Santuario Mágina
A-C 14,2 24,5 12,6 11,6 75,9
A-B 10,3 18,3 13,0 4,3 82,7
Oro Bailén
A-C 16,0 28,1 14,6 9,0 76,4
A-B 11,2 20,4 12,6 6,5 80,9
Castillo Canena (cosecha 2012)
A-C 18,2 32,4 13,5 7,5 79,0
A-B 11,2 20,8 12,2 16,0 71,9
Castillo Canena (Noviembre 2013)
A-C 18,8 33,8 12,9 17,0 70,1
A-B 9,8 17,5 10,4 29,7 59,8
Melgarejo
A-C 13,1 24,2 9,7 39,3 51,0
A-B 10,5 18,8 12,4 10,7 76,9
Valores Medios
A-C 16,4 29,2 13,2 15,3 71,6
Se han realizado 3 medidas, y se han calculado las desviaciones típicas de las
diferencias de color de esas 3 medidas que, en promedio para los 6 AOVE´s, son de 0.5
unidades CIELAB y de 0.2 unidades CIEDE2000 (tanto en el proceso A-B como en el A-
C), estos valores pueden considerarse despreciables teniendo en cuenta las magnitudes
de las diferencias de color que se manejan. Las diferencias de color en unidades CIELAB
se pueden además descomponer en diferencias de claridad, croma y tono, de modo que
los porcentajes de esas 3 diferencias están dados en las 3 últimas columnas de la Tabla
6.3.
Como puede observarse en la Tabla 6.3, las diferencias de color A-C son mayores
que las A-B (tanto en unidades CIEDE2000 como en unidades CIELAB), pero no el doble,
como podría quizá pensarse que podría suceder al pasar de una concentración de
extracto de antioxidantes de 0,05 mg/ml (B) a una de 0,1 mg/ml (C). En efecto, como ya
se ha indicado anteriormente, la adición de extracto no produce un cambio lineal del
color, sino que es un proceso con tendencia hacia un color (aproximadamente, el del
extracto enriquecido puro). En todo caso, se observa que las diferencias de color
promedio en unidades CIELAB son de 18.8 para A-B, y de 29.2 para A-C; es decir,
Tesis Doctoral
160
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
valores muy elevados y claramente perceptibles para el ojo humano (el umbral de
discriminación del ojo humano está en torno a 1.0 unidades CIELAB). Por otra parte, en
las diferencias de color totales el componente principal es un cambio de tono (H*ab), que
en promedio supone un 76,9 % y un 71,6% en los procesos A-B y A-C, respectivamente
(ver Tabla 6.3). Como ya se ha indicado anteriormente, este cambio de tono es en todos
los casos un enrojecimiento provocado por la adición del extracto (menor ángulo de tono
hab), como muestran los resultados de la Tabla 6.1 y la Figura 6.2c. Además, la adición de
extracto de antioxidantes produce descensos de claridad y de croma que, en promedio
son de magnitudes similares, en torno al 10%-15% de la diferencia total (véase Tabla
6.3), cada una de ellas.
Para mejor visualización, los resultados de la Tabla 6.3 se han representado a
continuación de forma gráfica en las Figuras 6.3 a, b y c:
Figura 6.3a
Diferencias de color para cada uno de los 6 aceites en los procesos A-B y A-C, en unidades
CIELAB (E*ab).
Tesis Doctoral
161
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Figura 6.3b
% promedios de cambio en claridad (%L*), croma (%C*ab) y tono (%H*ab) CIELAB de los
AOVE´s con una primera adición de extracto (proceso A-B).
Figura 6.3c
% promedios de cambio en claridad (%L*), croma (%C*ab) y tono (%H*ab) CIELAB de los
AOVE´s con una segunda adición de extracto (proceso A-C).
Tesis Doctoral
162
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
6.3.2.- VARIABILIDAD INTER-OBSERVADOR E INTRA-OBSERVADOR
En esta sección se van a describir los resultados del experimento visual sobre
emociones de color que hemos realizado. Se comienza mostrando en la Tabla 6.4 los
resultados de variabilidad inter-observador e intra-observador para cada una de las 9
emociones y para los dos grupos de observadores participantes en este experimento, que
llamaremos observadores acostumbrados y no acostumbrados al consumo de aceite de
oliva. Mientras que la variabilidad intra-observador hace referencia a las variaciones entre
las 3 medidas realizadas por cada observador para cada muestra; la variabilidad inter-
observador se refiere a la variabilidad entre el valor promedio de las 3 medidas de cada
observador y la media del total de los observadores. Estas variabilidades se han
calculado aquí mediante el error cuadrático medio (RMSE). Como era de esperar, se
puede observar que en todos los casos la variabilidad inter-observador es superior a la
variabilidad intra-observador, es decir, los observadores suelen ser más consistentes con
ellos mismos que con el promedio del grupo. Se observa que la máxima variabilidad intra-
observador es 1,13, mientras que la máxima variabilidad inter-observador asciende a
1,51 (téngase en cuenta que estos valores tienen relación directa con nuestra escala
experimental que va de -3 a +3; o sea, un rango de 6 unidades). Ciertamente estos
valores de variabilidad son altos, pero usuales en este tipo de experimentos. También
puede observarse que tanto la variabilidad inter-observador como la intra-observador son,
en general, mayores para el segundo grupo (observadores no acostumbrados), lo que
podría deberse a que la falta de costumbre en el uso de aceite de oliva puede originar
que las respuestas sean más aleatorias, o también a que estos 8 observadores son de
procedencia bastante más heterogénea que los 20 observadores del grupo de sujetos
acostumbrados al uso y consumo del aceite de oliva.
Tesis Doctoral
163
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Tabla 6.4
Resultados de variabilidad inter-observador e intra-observador para las 9 emociones consideradas y los dos
grupos de observadores participantes en nuestro experimento.
Acostumbrados No acostumbrados
Intra-observador Inter-observador Intra-observador Inter-observador
(RMSE) (RMSE) (RMSE) (RMSE)
Artificial/Natural 0,69 1,09 0,95 1,48
Dulce/Amargo 1,01 1,40 1,00 1,42
Inodoro/Aromático 0,92 1,12 1,06 1,51
Insípido/Sabroso 0,96 1,10 0,90 1,43
No/Gusta 0,67 1,05 0,86 1,40
No/Picante 1,10 1,37 0,87 1,50
No/Saludable 0,68 1,09 1,13 1,24
Rancio/Fresco 0,64 1,09 0,87 1,33
Suave/Áspero 1,10 1,29 0,89 1,35
6.3.2.1.- Escalas emocionales
Los valores de frontera (Bi), resultantes de la aplicación de la ley de Torgerson,
dan información útil de cómo es cada escala emocional en cada uno de los dos grupos de
observadores. Por ejemplo, para un grupo, cierto estímulo de color puede ser “un poco
picante” y para otro grupo el mismo estímulo puede ser “muy picante”; por tanto, cada
grupo tendría una escala emocional diferente. El primer grupo tendría un valor de frontera
muy alto para “poco picante” y el segundo grupo un valor de frontera bajo para “muy
picante”. Cuanto más cercanos estén estos valores de frontera, más improbable es que
los sujetos de cada grupo usen el término comprendido entre esos valores. Todos los
límites han sido centrados en 0, valor que nos indica el paso de una emoción a su
opuesta. Los valores más cercanos a 0 indican el paso de “un poco” a “moderadamente”,
y los más alejados de 0 indican el paso de “moderadamente” a “mucho”.
En la Tabla 6.5 (y su correspondiente Figura 6.4) se pueden observar los
resultados de los valores de frontera para las 9 escalas emocionales en cada uno de los
dos grupos de observadores. Esta representación es útil para saber qué significa la
puntuación z de cada estímulo. Por ejemplo, si para el grupo de observadores
Tesis Doctoral
164
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
acostumbrados, un estímulo tiene un valor z= -1,3 en el par de emociones “artificial-
natural” significa que está por debajo de la categoría “muy artificial” y por encima de la
categoría “un poco artificial”.
Se puede observar que hay pares de emociones cuyo escalado es asimétrico, es
decir, el escalamiento se hace de forma muy parecida para uno de los términos en los
dos grupos, pero no para la emoción opuesta. Como ejemplo, en el par “áspero-suave”
ambos grupos consideran en general los aceites igual de suaves, pero, si los aceites son
considerados ásperos, los sujetos del grupo de acostumbrados asocian el color de los
aceites a emociones más suaves que los sujetos del grupo de no acostumbrados. Es más
probable que este último grupo describa un aceite como muy áspero.
Tabla 6.5
Valores (Bi) para cada emoción en sujetos con tradición en el uso de AOVE´s y sin ella.
Acostumbrados [-3,-2] [-2,-1] [-1,1] [1,2] [2,3]
Artificial/Natural -1,52 -0,72 0 0,87 1,96
Dulce/Amargo -1,61 -0,55 0 0,69 1,95
Inodoro/Aromático -1,63 -0,66 0 0,82 2,16
Insípido/Sabroso -1,91 -0,72 0 0,81 1,96
No/Gusta -1,56 -0,86 0 1,01 2,00
No/Picante -1,36 -0,48 0 0,93 2,01
No/Saludable -1,43 -0,74 0 1,02 2,04
Rancio/Fresco -1,76 -0,82 0 0,86 1,94
Suave/Áspero -1,95 -0,53 0 0,61 2,12
No acostumbrados
Artificial/Natural -1,11 -0,53 0 0,57 1,42
Dulce/Amargo -1,59 -0,71 0 0,45 1,19
Inodoro/Aromático -1,59 -0,43 0 0,50 1,51
Insípido/Sabroso -1,28 -0,50 0 0,62 1,66
No/Gusta -1,06 -0,40 0 0,75 1,58
No/Picante -0,95 -0,42 0 0,70 1,63
No/Saludable -1,46 -0,50 0 0,77 1,57
Rancio/Fresco -1,12 -0,47 0 0,74 1,90
Suave/Áspero -1,97 -0,88 0 0,36 1,15
Tesis Doctoral
165
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Figura 6.4
Representación de los valores de frontera calculados para las 9 escalas emocionales y los 2
grupos de observadores (acostumbrados y no acostumbrados).
6.3.2.2.- Correlación entre diferentes emociones
Es posible dar a cada uno de los estímulos un valor z dentro de las escalas
elaboradas anteriormente, lo que nos da idea de qué intensidad tiene cada estímulo en
esas escalas. Este valor z se puede interpretar como un valor directamente relacionado
con el valor medio de todas las respuestas de los sujetos pero re-escalado, es decir, se
interpreta como la intensidad emocional del estímulo.
El proceso de análisis de entrevistas individuales, con el que se seleccionaron las
9 emociones sobre las que se ha realizado nuestro experimento, no nos garantiza en
absoluto que dichas emociones sean independientes entre sí. Dicho de otro modo, es
probable que varias emociones estén correlacionadas entre sí, siendo realmente como
facetas de un mismo hecho. En la Tabla 6.6 se dan los coeficientes de correlación de
Pearson (r) obtenidos entre los valores z para cada emoción y grupo de sujetos. Cuanto
más cercano a 0 sea el valor de dicho coeficiente menor será la correlación entre las
parejas de emociones y cuanto más cercano a ±1 mayor será la correlación entre
emociones. Se ha tomado como umbral de una buena correlación un valor superior a 0,9
de modo que las correspondientes celdas de la Tabla 6.6 se han coloreado en tono
amarillo.
Tesis Doctoral
166
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Tabla 6.6
Coeficientes de correlación de Pearson (r) obtenidos mediante los valores z para cada emoción y
grupo de sujetos
Inodoro/
Acostumbrados
Aromático
Dulce/ Dulce/
0,16
Amargo Amargo
Rancio/ Rancio/
0,82 -0,25
Fresco Fresco
No/ No/
0,85 -0,23 0,99
Saludable Saludable
No/
No/Gusta 0,84 -0,19 0,98 0,99
Gusta
Artificial/ Artificial/
0,85 -0,18 0,99 0,99 0,99
Natural Natural
No/ No/
Picante 0,00 0,81 -0,44 -0,44 -0,40 -0,40 Picante
Insípido/ Insípido/
0,93 -0,05 0,91 0,94 0,93 0,93 -0,23
Sabroso Sabroso
Suave/
-0,23 0,65 -0,65 -0,64 -0,62 -0,63 0,88 -0,43
Áspero
Inodoro/
No Acostumbrados
Aromático
Dulce/ Dulce/
Amargo 0,21 Amargo
Rancio/ Rancio/
-0,38 -0,84
Fresco Fresco
No/ No/
0,32 0,89 -0,87
Saludable Saludable
No/ No/
-0,42 -0,74 0,88 -0,79
Gusta Gusta
Artificial/ Artificial/N
-0,68 -0,54 0,75 -0,67 0,90
Natural atural
No/ No/
-0,44 -0,69 0,90 -0,79 0,97 0,90
Picante Picante
Insípido/ Insípido/
-0,31 -0,91 0,93 -0,88 0,89 0,73 0,87
Sabroso Sabroso
Suave/
0,27 0,93 -0,89 0,91 -0,83 -0,65 -0,81 -0,94
Áspero
Se puede observar en la Tabla 6.6 que las correlaciones son bastantes distintas
en ambos grupos. Por ejemplo, en el grupo de observadores acostumbrados al consumo
de AOVE´s hay una alta correlación entre las emociones “fresco-rancio”, “saludable-no
saludable”, “gusta-no gusta”, “sabroso-insípido”, “aromático-inodoro” y “natural-artificial”.
Es decir, un aceite que gusta se percibe también como fresco, sabroso, saludable y
aromático. En cambio, para el grupo de observadores no acostumbrados al consumo de
AOVE´s, se observa, por ejemplo, que hay una correlación alta entre “gusta-no gusta”,
“natural-artificial” y “picante-no picante”.
Tesis Doctoral
167
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Es también destacable que en este último grupo de observadores hay además
correlación inversa (r negativo) entre “sabroso-insípido” con “amargo-dulce” y “áspero-
suave”, es decir, un aceite percibido como sabroso se relaciona con aceites suaves y
dulces. Estas diferencias se podrían atribuir a que los sujetos del primer grupo, al estar
acostumbrados al consumo del aceite de oliva tienen más claro lo que para ellos es un
“buen” aceite, pues todas las emociones que correlacionan están relacionadas con
parámetros de calidad del aceite. En el caso del segundo grupo, la situación es algo más
complicada por varias razones. En primer lugar, el número de observadores es bajo y las
correlaciones son más bajas que para el primer grupo. En segundo lugar, es posible que
para estos sujetos sin tradición en el uso de los AOVE´s las respuestas sean más
aleatorias, pues son sujetos de distintas culturas y, como se ha mencionado
anteriormente, éste es un factor muy importante en las emociones de color.
6.3.2.3.- Dependencia entre valores z y cantidad de extracto de antioxidantes
Por el momento, en esta sección 6.3.2 hemos analizado solamente la respuesta
emocional de los observadores a los AOVE´s puros u originales, sin considerar el efecto
sobre la misma de las adiciones de extracto de antioxidantes. Como ya se ha dicho, la
adición de extracto de antioxidantes hace que el color de los AOVE´s ensayados cambie,
y además este cambio de color es claramente perceptible, ya que principalmente es un
cambio de tono, de manera que las muestras tienden a enrojecerse. Estudiamos ahora
los cambios en las distintas emociones cuando consideramos AOVE´s con 2
concentraciones de antioxidantes, respecto a las emociones suscitadas por los AOVE´s
puros. En todas las gráficas siguientes se ha mantenido la misma escala (valores entre -2
y +2, aproximadamente) para poder comparar mejor el cambio en las emociones. Los
valores negativos corresponden a la primera emoción de la leyenda del eje y, mientras
que los positivos corresponden a la segunda emoción mencionada en la leyenda del eje
y. Además para cada emoción presentamos en gráficas distintas los resultados de los 2
grupos de observadores (en la parte superior los sujetos acostumbrados y en la inferior
los no acostumbrados).
Tesis Doctoral
168
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Inodoro - Aromático
En la Figura 6.5 se observa como todos los aceites son percibidos por debajo de
la categoría “muy aromático” (valor +2); es decir, se consideran solamente como
“moderadamente aromáticos” o “un poco aromáticos”, tanto para el grupo de
observadores acostumbrados como el de no acostumbrados. No hay una variación
importante en cómo de aromático se espera que sea un aceite al cambiar su color
añadiendo el extracto de antioxidantes en las dos concentraciones utilizadas.
Figura 6.5
Resultados promedio (valores z) para la emoción “Inodoro/Aromático” en los sujetos
acostumbrados (superior) y no acostumbrados (inferior) al consumo de AOVE´s (a: AOVE´s puros;
b: AOVE´s con concentración de luteína de 0,05 mg/ml; c: AOVE´s con concentración de luteína
de 0,1 mg/ml).
Tesis Doctoral
169
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Dulce - Amargo
En el caso del par de emociones “dulce-amargo”, se puede comprobar en la
Figura 6.6 que los sujetos con tradición en el uso de aceite de oliva no perciben casi
ninguna variación en esta emoción al añadir el antioxidante, mientras que los sujetos sin
tradición en aceite de oliva esperan que el aceite sea ligeramente más amargo cuando se
añaden los antioxidantes. Además, se observa que este grupo de observadores, percibe
todos los AOVE´s que no han sido enriquecidos con extracto de antioxidantes, como “un
poco dulces” o “moderadamente dulces”.
Figura 6.6
Resultados promedio (valores z) para la emoción “Dulce/Amargo” en los sujetos acostumbrados
(superior) y no acostumbrados (inferior) al consumo de AOVE´s (a: AOVE´s puros; b: AOVE´s con
concentración de luteína de 0,05 mg/ml; c: AOVE´s con concentración de luteína de 0,1 mg/ml).
Tesis Doctoral
170
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Rancio - Fresco
En la Figura 6.7 se observa que cuanto más extracto de antioxidantes tiene el
aceite se considera como menos fresco, especialmente en el caso de los sujetos
acostumbrados al consumo de los AOVE´s. En el caso de los observadores
acostumbrados, es también destacable el caso del aceite “Melgarejo” en el cual la
tendencia es distinta a la de los demás aceites, pues pasa a percibirse como más fresco
al añadirle antioxidante. Este comportamiento se puede deber a que el aceite “Melgarejo”
es el único cuyo tono no se hace excesivamente rojizo al añadir extracto de
antioxidantes (véase Figuras 6.1 y 6.2c), ya que al añadirle el extracto de antioxidantes
su ángulo de tono CIELAB tiende a los 90º aproximadamente, por encima de los valores
obtenidos para los otros AOVE´s. En efecto, para el resto de aceites, al añadirle extracto
tienden a disminuir su ángulo de tono CIELAB por debajo de los 90º, pasando de un
amarillento a un anaranjado que hace que se perciba como “menos fresco”. Este
comportamiento diferencial del aceite “Melgarejo” no lo percibe el grupo de sujetos no
acostumbrados, para el que la emoción “fresco” no llega a dejar de suscitarse para
ninguno de los aceites, incluso con adición de extracto de antioxidantes.
Tesis Doctoral
171
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Figura 6.7
Resultados promedio (valores z) para la emoción “Rancio/Fresco” en los sujetos acostumbrados
(superior) y no acostumbrados (inferior) al consumo de AOVE´s (a: AOVE´s puros; b: AOVE´s con
concentración de luteína de 0,05 mg/ml; c: AOVE´s con concentración de luteína de 0,1 mg/ml).
Tesis Doctoral
172
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
No saludable - Saludable
En este par de emociones se puede comprobar cómo para el grupo de los
observadores acostumbrados al consumo de AOVE´s la situación es bastante similar a la
de la emoción con “rancio-fresco”, incluida la singularidad del aceite “Melgarejo”. En
efecto, se aprecia que con la adición de antioxidante los AOVE´s muestran una tendencia
decreciente en la emoción “saludable”. Sin embargo, es importante destacar que para el
grupo de observadores no acostumbrados al uso de AOVE´s la tendencia se invierte, de
modo que estos sujetos tienen una percepción inicial de que los colores de los AOVE´s
sin extracto no son saludables, mientras que al añadir el extracto de antioxidantes y
enrojecerse, los aceites pasan a percibirse como “un poco más saludables”.
Figura 6.8
Resultados promedio (valores z) para la emoción “No saludable/Saludable” en los sujetos
acostumbrados (superior) y no acostumbrados (inferior) al consumo de AOVE´s (a: AOVE´s puros;
b: AOVE´s con concentración de luteína de 0,05 mg/ml; c: AOVE´s con concentración de luteína
de 0,1 mg/ml).
Tesis Doctoral
173
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
No gusta - Gusta
La Figura 6.9 en el grupo de observadores acostumbrados al uso de AOVE´s es
muy similar a las Figuras 6.8 y 6.7 anteriores (es decir, hay una alta correlación entre los
resultados de estos 3 pares de emociones). En efecto, con la excepción del aceite
“Melgarejo”, los aceites puros o con menos adición de extracto de antioxidantes son los
que más gustan. Este resultado es importante, pues la emoción “gusta” puede estar
particularmente relacionada con la decisión de compra del consumidor. Así, es
interesante saber que un AOVE “Melgarejo” con adición de antioxidante gusta un poco
más que el aceite de oliva virgen extra original, en el caso de un consumidor
acostumbrado al uso o consumo de AOVE´s. Es importante destacar también que para el
grupo de observadores no acostumbrados al consumo de AOVE´s la tendencia en esta
emoción es similar a la de los observadores acostumbrados, aunque no tan fuerte (salvo
para el caso del aceite “Melgarejo”). Por otro lado, es curioso observar que en este
segundo grupo la tendencia de “gusta-no gusta” (Figura 6.9) es inversa a la de
“saludable-no saludable” (Figura 6.8), de modo que la mayoría de los AOVE´s
enriquecidos con extracto de antioxidantes gustan menos que los originales, a la vez que
se consideran más saludables, lo cual a primera vista resulta algo contradictorio, pues lo
más lógico sería que gustase más lo que se considera más saludable. El escaso número
y diversa procedencia de observadores de este segundo grupo puede ser la causa de
este resultado “anómalo” que requiere una futura revisión.
Tesis Doctoral
174
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Figura 6.9
Resultados promedio (valores z) para la emoción “No gusta/Gusta” en los sujetos acostumbrados
(superior) y no acostumbrados (inferior) al consumo de AOVE´s (a: AOVE´s puros; b: AOVE´s con
concentración de luteína de 0,05 mg/ml; c: AOVE´s con concentración de luteína de 0,1 mg/ml).
Tesis Doctoral
175
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Artificial - Natural
Como se ha comentado en la sección 6.3.2.2 referida a correlaciones entre
emociones, los resultados de este par de emociones se correlacionan bien en ambos
grupos de observadores con los de las emociones “gusta-no gusta”, y esto también es
válido cuando consideramos el cambio de AOVE´s puros a AOVE´s con antioxidantes
(véase Figura 6.10). En general, la gente asocia lo natural con algo beneficioso y por
tanto, gusta. Puede ser interesante recomendar la adición de extracto de antioxidantes a
los fabricantes del AOVE “Melgarejo”.
Figura 6.10
Resultados promedio (valores z) para la emoción “Artificial/Natural” en los sujetos acostumbrados
(superior) y no acostumbrados (inferior) al consumo de AOVE´s (a: AOVE´s puros; b: AOVE´s con
concentración de luteína de 0,05 mg/ml; c: AOVE´s con concentración de luteína de 0,1 mg/ml).
Tesis Doctoral
176
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
No picante - Picante
En el grupo de sujetos acostumbrados al uso de AOVE´s no se observa una gran
variación de esta emoción con la adición de extracto de antioxidantes (Figura 6.11). En
cambio, en el caso de los sujetos no acostumbrado la tendencia es decreciente, de modo
que los aceites con antioxidantes se valoran como menos picantes que los AOVE´s
originales (con la excepción del “Melgarejo”).
Figura 6.11
Resultados promedio (valores z) para la emoción “No picante/Picante” en los sujetos
acostumbrados (superior) y no acostumbrados (inferior) al consumo de AOVE´s (a: AOVE´s puros;
b: AOVE´s con concentración de luteína de 0,05 mg/ml; c: AOVE´s con concentración de luteína
de 0,1 mg/ml).
Tesis Doctoral
177
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Suave - Áspero
La Figura 6.12 indica que el par de emociones “suave-áspero” en el grupo de
sujetos acostumbrados muestra una tendencia creciente con la concentración de extracto
de antioxidantes (aunque no se llega a percibir ningún aceite cerca de “muy áspero”),
salvo para el aceite “Melgarejo”. Esta tendencia (aceites más ásperos al añadir
antioxidante) también se observa, incluso con más intensidad, en los resultados del grupo
de observadores “no acostumbrados”. Para el grupo de sujetos no acostumbrados la
tendencia es muy similar a la de “dulce-amargo” (Figura 6.6).
Figura 6.12
Resultados promedio (valores z) para la emoción “Suave/Áspero” en los sujetos acostumbrados
(superior) y no acostumbrados (inferior) al consumo de AOVE´s (a: AOVE´s puros; b: AOVE´s con
concentración de luteína de 0,05 mg/ml; c: AOVE´s con concentración de luteína de 0,1 mg/ml).
Tesis Doctoral
178
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
Insípido-Sabroso
En el caso de este par de emociones la tendencia en los dos grupos estudiados
es similar (Figura 6.13). Al añadir antioxidantes los aceites se perciben como más
insípidos, aunque siempre dentro de una valoración media de alimentos moderadamente
sabrosos. Al aumentar la concentración de extracto de antioxidantes la percepción es que
el aceite va a ser algo menos sabroso, llegando a considerarse un poco insípido en
algunos casos para el grupo de observadores acostumbrados al consumo de AOVE´s. En
este caso las tendencias son bastante parecidas ya que hay que tener en cuenta que los
valores de escalado de ambos grupos en estas dos emociones son distintos (véase Tabla
6.5), en el grupo de acostumbrados los límites extremos oscilan entre ±1,9
aproximadamente y en el grupo de no acostumbrados estos intervalos son menores.
Figura 6.13
Resultados promedio (valores z) para la emoción “Insípido/Sabroso” en los sujetos acostumbrados
(superior) y no acostumbrados (inferior) al consumo de AOVE´s (a: AOVE´s puros; b: AOVE´s con
concentración de luteína de 0,05 mg/ml; c: AOVE´s con concentración de luteína de 0,1 mg/ml).
Tesis Doctoral
179
6.- Emociones y preferencias de color en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes
6.4.- CONCLUSIONES
En primer lugar teniendo en cuenta todos los pares de emociones estudiados
existen importantes diferencias entre los grupos de sujetos encuestados. Así, el grupo de
“acostumbrados” ha generado mayores correlaciones que el de “no acostumbrados”.
Con respecto al par de emociones “aromático-inodoro” e “insípido-sabroso”, no
hay una variación importante de acuerdo a las opiniones de ambos grupos al añadir el
extracto de antioxidantes, es decir, la tendencia en los dos grupos estudiados es similar.
Es importante destacar también, que los pares de “rancio-fresco”, “saludable/no
saludable” y “gusta/no gusta” tienen tendencias, con respecto al grupo de observadores
acostumbrados, semejantes entre ellos. En este sentido resulta bastante curioso el dato
de que a los observadores les guste más lo que consideran menos saludable.
Por otro lado, el par “artificial-natural” también está relacionado con el par “gusta-
no gusta”. De aquí sí se puede asociar algo natural con algo beneficioso, y que por tanto,
guste a la población en mayor o menor medida.
Por último, resaltar el caso del aceite “Melgarejo”, en el que para la mayoría de los
pares de emociones, la tendencia es diferente al del resto de aceites. Así, al añadirle el
extracto de antioxidantes, pasa a percibirse por el grupo de población acostumbrada
como más fresco, saludable, natural y que gusta.
Tesis Doctoral
180
7. CONCLUSIONES
GENERALES
7.- Conclusiones Generales
7.- CONCLUSIONES GENERALES
En la presente Tesis Doctoral se ha desarrollado una metodología original para la
obtención de un extracto de antioxidantes que contiene luteína procedente de la
microalga Scenedesmus almeriensis y se ha estudiado su adición al aceite de oliva como
medio de incorporación idóneo, para ingerir las cantidades necesarias y prevenir la
aparición de ciertas enfermedades degenerativas humanas, que tienen que ver con el
déficit en nuestro organismo de este antioxidante.
Como se aprecia en los distintos capítulos, la adición del extracto de antioxidantes
procedente de la microalga Scendesmus almeriensis produce cambios significativos en el
color, la calidad, la composición y la estabilidad de los AOVE´s.
Así, se han podido solubilizar cantidades adecuadas de extracto de antioxidantes
en los diferentes AOVE´s ensayados y se han estudiado los parámetros físico-químicos
de los mismos, prestando especial atención a los cambios de color producidos por la
adición del antioxidante como variable de monitorización y estudio. Se ha procedido a
adicionar extracto de antioxidantes a diferentes AOVE´s, estudiando cómo varían los
parámetros colorimétricos a medida que va aumentando la concentración de luteína. En
este sentido, se ha utilizado un extracto de luteína de concentración igual a 2,3 mg/ml, y
se han realizado sucesivas adiciones de 100 µl hasta llegar a concentraciones en los
aceites de 0,16 mg/ml (174,3 mg luteína/kg aceite), es decir se han alcanzado
concentraciones de luteína entre 22 y 87 veces superiores a las que presentan los
aceites de oliva no enriquecidos en luteína (2-8 mg luteína/kg aceite).
La adición de extracto de antioxidantes proporciona a los AOVE´s un color más
amarillento-naranja, debido a la concentración de los pigmentos, principalmente al β-
caroteno.
Los resultados obtenidos muestran que enriqueciendo los aceites hasta una
concentración de 0,1 mg luteína/ml, se obtienen aceites con propiedades físico-químicas
y colorimétricas muy aceptables, que además permiten incorporar al organismo buena
parte de la ingesta diaria de luteína recomendada (6 mg), teniendo en cuenta el consumo
medio estimado de aceite de oliva por habitante y día para nuestro país (36 ml). De esta
forma, se pretende dotar a los AOVE´s de un valor añadido superior al que ya de por sí
tiene y ofrecer una alternativa diferente a las actuales, en la lucha contra algunas
enfermedades degenerativas humanas.
Tesis Doctoral
181
7.- Conclusiones Generales
La estabilidad oxidativa ha mejorado notablemente por adición del extracto de S.
almeriensis y también se ha mejorado la vida útil de los aceites, protegiéndolos frente a
los agentes oxidantes.
Se reduce la oxidación de los AOVE´s así como la formación de productos de
oxidación, mejorando así la calidad de los mismos. El perfil de ácidos grasos no se ve
afectado por la adición de extracto, así como el contenido de tocoferoles.
Además, la adición de extracto de antioxidantes es beneficiosa para los AOVE´s
siendo posible discriminarlos de acuerdo con la cantidad de extracto añadido. A partir de
todos los resultados obtenidos se concluye que la adición de 0,1 mg/ml no afecta de
forma decisiva a la calidad y a la composición de los AOVE´s en comparación a la de
0,05 mg/ml, por lo tanto, la concentración de 0,05 mg de extracto de S. almeriensis por
ml de aceite de oliva sería una concentración óptima, conservando todas las propiedades
y características de los AOVE´s originales, mientras que proporciona dosis importantes
de compuestos bioactivos y una mayor estabilidad oxidativa.
La posible introducción al mercado de este tipo de antioxidantes en el aceite de
oliva aumentaría la ingesta diaria de carotenoides esenciales en la dieta, con la mejora de
las propiedades para la salud de los consumidores, ya que confiere importantes activos
nutricionales. No obstante, se deben llevar a cabo futuros trabajos para evaluar la
estabilidad química de este tipo de AOVE´s durante su almacenamiento y utilización en la
cocina.
En este sentido, se han llevado a cabo en esta Tesis distintos ensayos para
evaluar la estabilidad de este tipo de AOVE´s durante el almacenamiento, y se ha
estudiado la estabilidad en función de tres variables principales de degradación: el
tiempo, la temperatura y la exposición a la luz.
Tras los análisis de tres de los puntos fundamentales que se relacionan con la
degradación físico-química de un AOVE (estabilidad frente a la radiación ultravioleta,
estabilidad frente a la temperatura y estabilidad frente al tiempo), así como de la
estabilidad de AOVE´s obtenidos con aceitunas de distinto índice de maduración y
variedades de fruto, se llega a la conclusión de que la adición del extracto de
antioxidantes procedente del alga Scenedesmus almeriensis a las matrices oleosas
produce una mejora importante en sus propiedades físico-químicas. Es decir, la
Tesis Doctoral
182
7.- Conclusiones Generales
estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con extracto de antioxidantes mejora con
respecto a los de la matriz original sin aditivar.
Una vez realizado el análisis de la estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con
extracto de antioxidantes frente a la temperatura, se obtienen resultados que podrían ser
muy beneficiosos, multiplicando la vida útil de los AOVE´s en algunos casos, siendo una
de las matrices más adecuadas para adicionar extracto el AOVE de la variedad “Picual”,
mientras que el de la variedad “Frantoio” ha mostrado una mayor degradación. A pesar
de que aumenta la vida útil del aceite control frente a la temperatura, su degradación
sigue siendo rápida en relación a otros AOVE´s.
Los resultados obtenidos son muy positivos, ya que la adición del extracto de
antioxidantes a los AOVE´s aumentaría la vida útil de los mismos, además de incorporar
a nuestra dieta una gran cantidad de antioxidantes beneficiosos para nuestra salud (lo
que permite la prevención de la DMAE, entre otras cosas) sin tener que alterar nuestros
hábitos de consumo, ya que estarían incorporados en el propio AOVE, tanto para
consumo en crudo (prolongando el tiempo de conservación de un AOVE para que no se
degrade), como para su uso en cocina (multiplicando la vida útil de los AOVE´s en la
fritura).
Respecto a las emociones y preferencias de color, los ensayos realizados
muestran diferencias importantes entre los grupos encuestados “acostumbrados” y “no
acostumbrados”. Como era de esperar, el color de los aceites influye en la apreciación de
los mismos y depende fuertemente de los pares de emociones que se tengan en cuenta
en cada momento.
En esta Tesis Doctoral también se concluye que la microalga S. almeriensis es
una buena fuente de compuestos bioactivos y podría ser explotada para la extracción de
carotenoides para su incorporación en diferentes productos alimentarios o para ser
incluida en complementos alimentarios.
Finalmente, es importante resaltar la aplicabilidad de los resultados obtenidos, la
cual produciría una línea de AOVE´s enriquecidos con nuevos antioxidantes que vendría
a sumar, tanto en estrategias de lucha contra enfermedades degenerativas humanas, así
como en el desarrollo del tejido industrial y social de nuestro entorno. Se pretende dotar
al AOVE de un valor añadido superior al que ya de por sí tiene y ofrecer una alternativa
diferente a las que existen en la actualidad, en la lucha contra la DMAE.
Tesis Doctoral
183
8. BIBLIOGRAFÍA
8.- Bibliografía
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211
9. ANEXOS
9. ANEXO I
9.1.1.- Estabilidad en función de la radiación electromagnética: Foto-estabilidad. 9.- Anexo I
Tabla 9.1.1
Diferencia de color de los AOVE´s “SM” tanto control como enriquecidos con antioxidantes a
diferentes concentraciones, izquierda (0,05 mg luteína/ml) y derecha (0,1 mg luteína/ml).
Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65)
0,05 mg/ml SM SM 0,1 mg/ml SM SM
Días Control Antioxidantes Días Control Antioxidantes
1 1,1 1,14 1 1,45 2,3
2 1,76 0,96 2 2,72 2,29
4 2,64 0,49 3 3,4 1,31
7 4,11 0,46 6 7,18 3,12
8 4,44 0,71 7 8,74 3,69
11 5,9 1,78 8 10,76 4,99
14 7,76 2,41 9 12,4 6,03
15 8,77 2,22 10 13,97 6,81
18 11,49 3,21 13 19,6 9,66
21 14,61 4,49 14 21,6 10,54
23 16,56 5,35 15 23,17 10,91
28 21,81 7,09 16 25,42 11,47
30 24,1 7,99 17 27,33 12,24
32 26,6 8,62 20 32,69 13,89
35 30,45 9,88 21 34,92 14,41
37 32,71 10,29 22 37,08 15
39 35,55 10,95 29 41,6 15,91
42 40 11,89 31 43,96 16,11
45 44,96 12,91 34 47,94 17,1
50 51,89 14,17 35 49,89 17,28
52 55,93 15,23 37 53,68 17,91
57 61,86 16,75 42 65,78 19,14
59 67,08 18,89 50 79,97 20
64 77,44 22,98 56 85,99 20,97
66 82,54 25,85
Tesis Doctoral
212
9.1.1.- Estabilidad en función de la radiación electromagnética: Foto-estabilidad. 9.- Anexo I
100
Control
80 Antioxidantes
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.1
Foto-estabilidad del AOVE “SM” bajo condiciones de iluminación controlada con lámpara
ultravioleta enriquecido con antioxidantes a una concentración de 0,05 mg luteína/ml.
100
Control
Antioxidantes
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.2
Foto-estabilidad del AOVE “SM” bajo condiciones de iluminación controlada con lámpara
ultravioleta enriquecido con antioxidantes a una concentración de 0,1 mg luteína/ml.
40
30
20
10
0
0 10 20 30 DÍAS 40 50 60 70
Figura 9.1.3
Comparativa de la Foto-estabilidad de los AOVE´s “SM” enriquecidos con antioxidantes a
diferentes concentraciones (0,05 mg luteína/ml y 0,1 mg luteína/ml) bajo condiciones de
iluminación controlada con lámpara ultravioleta.
Tesis Doctoral
213
∆E*ab(D65) ∆E*ab(D65) ∆E*ab(D65)
9.1.1.- Estabilidad en función de la radiación electromagnética: Foto-estabilidad. 9.- Anexo I
Tabla 9.1.2
Diferencia de color de los AOVE´s “OB” tanto control como enriquecidos con antioxidantes a
diferentes concentraciones, izquierda (0,05 mg luteína/ml) y derecha (0,1 mg luteína/ml).
Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65)
0,05 mg/ml OB OB 0,1 mg/ml OB OB
Días Control Antioxidantes Días Control Antioxidantes
1 0,89 1,23 1 1,45 2,33
2 1,84 1,05 2 3,63 2,16
4 3,25 0,81 3 5,23 2,55
7 5,89 1,27 6 10 5,39
8 6,73 1,65 7 11,74 6,2
11 9,69 2,41 8 12,64 7,25
14 12,92 3,22 9 14,22 8,29
15 14,4 3,61 10 15,34 8,77
18 18,4 4,83 13 19,31 11,04
21 22,49 5,74 14 20,95 11,25
23 25,45 6,5 15 21,97 11,58
28 33,45 8 16 23,53 11,94
30 37,35 9,09 17 25,23 12,53
32 41,5 10,59 20 28,87 13,4
35 48,56 13,4 21 30,91 13,71
37 52,91 15,27 22 32,48 14,22
39 57,92 18,12 29 36,55 14,79
42 67,38 23,51 31 38,12 14,93
45 78,04 30,77 34 42,19 15,53
50 93,9 43,59 35 44,25 15,84
52 100,21 53,11 37 48,53 16,3
57 106,69 68,19 42 59,13 17,34
59 109,74 82,6 50 75,77 18,72
64 112,57 107,67 56 83,34 21,81
66 113,24 115,92
Tesis Doctoral
214
9.1.1.- Estabilidad en función de la radiación electromagnética: Foto-estabilidad. 9.- Anexo I
120
Control
100 Antioxidantes
80
60
40
20
0
0 10 20 30 DÍAS 40 50 60 70
Figura 9.1.4
Foto-estabilidad del AOVE “OB” bajo condiciones de iluminación controlada con lámpara
ultravioleta enriquecido con antioxidantes a una concentración de 0,05 mg luteína/ml.
120
Control
100 Antioxidantes
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.5
Foto-estabilidad del AOVE “OB” bajo condiciones de iluminación controlada con lámpara
ultravioleta enriquecido con antioxidantes a una concentración de 0,1 mg luteína/ml.
120
100
80
60
40
20
0
0 10 20 30 DÍAS 40 50 60 70
Figura 9.1.6
Comparativa de la Foto-estabilidad de los AOVE´s “OB” enriquecidos con antioxidantes a
diferentes concentraciones (0,05 mg luteína/ml y 0,1 mg luteína/ml) bajo condiciones de
iluminación controlada con lámpara ultravioleta.
Tesis Doctoral
215
ΔE*ab(D65) ∆E*ab(D65) ∆E*ab(D65)
9.1.1.- Estabilidad en función de la radiación electromagnética: Foto-estabilidad. 9.- Anexo I
Tabla 9.1.3
Diferencia de color de los AOVE´s “OG” tanto control como enriquecidos con antioxidantes a
diferentes concentraciones, izquierda (0,05 mg luteína/ml) y derecha (0,1 mg luteína/ml).
Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65)
0,05 mg/ml OG OG 0,1 mg/ml OG OG
Días Control Antioxidantes Días Control Antioxidantes
1 0,81 1,01 1 1,72 0,89
2 1,94 0,62 2 4,52 1,22
4 4,62 0,52 3 5,9 1,56
7 7,48 1,53 6 10,1 4,43
8 8,26 1,94 7 11,04 5,12
11 10,68 3,01 8 12,06 6,08
14 13,3 3,39 9 13,26 6,97
15 14,57 3,68 10 14,85 7,39
18 17,97 4,58 13 18,13 9,18
21 21,46 5,38 14 20,74 9,59
23 23,92 5,85 15 22,22 9,8
28 30,75 6,92 16 24,16 10,26
30 33,88 7,41 17 26,45 10,73
32 37,46 8,11 20 31,22 11,5
35 43,33 9,3 21 34,31 11,74
37 46,86 9,92 22 36,73 12,07
39 51,08 11,11 29 41,98 12,93
42 58,61 12,99 31 43,72 13,1
45 67,7 15,79 34 49,94 13,42
50 83,54 20,7 35 53,42 13,8
52 92,47 24,75 37 58,17 14,13
57 102,45 31,83 42 76,36 15,21
59 107,26 38,94 50 93,27 16,65
64 111,67 57,05 56 101,57 17,73
66 112,59 67,63
Tesis Doctoral
216
9.1.1.- Estabilidad en función de la radiación electromagnética: Foto-estabilidad. 9.- Anexo I
120
Control
100
Antioxidantes
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.7
Foto-estabilidad del AOVE “OG” bajo condiciones de iluminación controlada con lámpara
ultravioleta enriquecido con antioxidantes a una concentración de 0,05 mg luteína/ml.
120
Control
100 Antioxidantes
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.8
Foto-estabilidad del AOVE “OG” bajo condiciones de iluminación controlada con lámpara
ultravioleta enriquecido con antioxidantes a una concentración de 0,1 mg luteína/ml.
120
100
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.9
Comparativa de la Foto-estabilidad de los AOVE´s “OG” enriquecidos con antioxidantes a
diferentes concentraciones (0,05 mg luteína/ml y 0,1 mg luteína/ml) bajo condiciones de
iluminación controlada con lámpara ultravioleta.
Tesis Doctoral
217
ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65)
9.1.1.- Estabilidad en función de la radiación electromagnética: Foto-estabilidad. 9.- Anexo I
Tabla 9.1.4
Diferencia de color de los 3 AOVE´s anteriores enriquecidos con antioxidantes a diferentes
concentraciones, izquierda (0,05 mg luteína/ml) y derecha (0,1 mg luteína/ml).
ΔE*ab(D65) (0,05 mg luteína/ml) ΔE*ab(D65) (0,1 mg luteína/ml)
Días SM OB OG Días SM OB OG
1 1,14 1,23 1,01 1 2,3 2,33 0,89
2 0,96 1,05 0,62 2 2,29 2,16 1,22
4 0,49 0,81 0,52 3 1,31 2,55 1,56
7 0,46 1,27 1,53 6 3,12 5,39 4,43
8 0,71 1,65 1,94 7 3,69 6,2 5,12
11 1,78 2,41 3,01 8 4,99 7,25 6,08
14 2,41 3,22 3,39 9 6,03 8,29 6,97
15 2,22 3,61 3,68 10 6,81 8,77 7,39
18 3,21 4,83 4,58 13 9,66 11,04 9,18
21 4,49 5,74 5,38 14 10,54 11,25 9,59
23 5,35 6,5 5,85 15 10,91 11,58 9,8
28 7,09 8 6,92 16 11,47 11,94 10,26
30 7,99 9,09 7,41 17 12,24 12,53 10,73
32 8,62 10,59 8,11 20 13,89 13,4 11,5
35 9,88 13,4 9,3 21 14,41 13,71 11,74
37 10,29 15,27 9,92 22 15 14,22 12,07
39 10,95 18,12 11,11 29 15,91 14,79 12,93
42 11,89 23,51 12,99 31 16,11 14,93 13,1
45 12,91 30,77 15,79 34 17,1 15,53 13,42
50 14,17 43,59 20,7 35 17,28 15,84 13,8
52 15,23 53,11 24,75 37 17,91 16,3 14,13
57 16,75 68,19 31,83 42 19,14 17,34 15,21
59 18,89 82,6 38,94 50 20 18,72 16,65
64 22,98 107,67 57,05 56 20,97 21,81 17,73
66 25,85 115,92 67,63
Tesis Doctoral
218
9.1.1.- Estabilidad en función de la radiación electromagnética: Foto-estabilidad. 9.- Anexo I
120
SM
100 OB
OG
80
60
40
20
0
0 10 20 30 DíAS 40 50 60 70
Figura 9.1.10
Diferencias de color CIELAB producidas en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes a una
concentración de 0,05 mg luteína/ml, como consecuencia de exposición continua a luz ultravioleta.
30
SM
OB
OG
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60
DÍAS
Figura 9.1.11
Diferencias de color CIELAB producidas en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes a una
concentración de 0,1 mg luteína/ml, como consecuencia de exposición continua a luz ultravioleta.
Tesis Doctoral
219
∆E*ab(D65)
∆E*ab(D65)
9.1.1.- Estabilidad en función de la radiación electromagnética: Foto-estabilidad. 9.- Anexo I
Tabla 9.1.5
Diferencia de color de los AOVE´s “CCP” (izquierda) y “CCA” (derecha) tanto control como
enriquecidos con antioxidantes a una concentración de 0,05 mg luteína/ml.
Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65)
0,05 mg/ml CCP CCP 0,05 mg/ml CCA CCA
Días Control Antioxidantes Días Control Antioxidantes
1 1,05 1,43 1 0,95 1,57
2 2,84 1,92 2 2,37 2,12
4 4,9 2,75 4 4,02 3,08
7 6,99 3,22 7 5,63 3,89
8 7,74 3,3 8 6,11 4,12
11 9,6 3,33 11 7,43 4,48
14 11,38 3,57 14 8,97 4,57
15 12,18 3,65 15 9,68 4,71
18 14,13 4,18 18 11,8 5,16
21 16,37 4,39 21 13,92 5,45
23 17,81 4,63 23 15,34 5,58
28 22,02 5,43 28 19,45 5,87
30 23,89 6,01 30 21,56 6,07
32 25,93 6,75 32 23,9 6,36
35 29,16 8,22 35 27,69 6,97
37 31,13 9,27 37 29,93 7,24
39 33,47 10,75 39 32,75 8,02
42 37,27 13,39 42 37,45 9,2
45 41,27 16,94 45 42,78 10,96
50 46,76 23,11 50 50,35 14,65
52 49,91 27,72 52 54,66 17,83
57 54,68 35,29 57 62,35 23,25
59 58,83 44,66 59 69,56 29,95
64 68 75,49 64 84,66 52,23
66 74,77 89,67 66 91 66,77
Tesis Doctoral
220
9.1.1.- Estabilidad en función de la radiación electromagnética: Foto-estabilidad. 9.- Anexo I
100
Control
Antioxidantes
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.12
Variación de los parámetros colorimétricos del AOVE “CCP” enriquecido con antioxidantes a una
concentración de 0,05 mg luteína/ml, bajo condiciones de iluminación controlada con lámpara
ultravioleta.
100
Control
80 Antioxidantes
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.13
Variación de los parámetros colorimétricos del AOVE “CCA” enriquecido con antioxidantes a una
concentración de 0,05 mg luteína/ml, bajo condiciones de iluminación controlada con lámpara
ultravioleta.
Tesis Doctoral
221
ΔE*ab(D65)
ΔE*ab(D65)
9.1.1.- Estabilidad en función de la radiación electromagnética: Foto-estabilidad. 9.- Anexo I
Tabla 9.1.6
Comparativa de la diferencia de color de los 5 AOVE´s controles.
ΔE*ab(D65) CONTROLES
Días SM OB OG CCP CCA
1 1,1 0,89 0,81 1,05 0,95
2 1,76 1,84 1,94 2,84 2,37
4 2,64 3,25 4,62 4,9 4,02
7 4,11 5,89 7,48 6,99 5,63
8 4,44 6,73 8,26 7,74 6,11
11 5,9 9,69 10,68 9,6 7,43
14 7,76 12,92 13,3 11,38 8,97
15 8,77 14,4 14,57 12,18 9,68
18 11,49 18,4 17,97 14,13 11,8
21 14,61 22,49 21,46 16,37 13,92
23 16,56 25,45 23,92 17,81 15,34
28 21,81 33,45 30,75 22,02 19,45
30 24,1 37,35 33,88 23,89 21,56
32 26,6 41,5 37,46 25,93 23,9
35 30,45 48,56 43,33 29,16 27,69
37 32,71 52,91 46,86 31,13 29,93
39 35,55 57,92 51,08 33,47 32,75
42 40 67,38 58,61 37,27 37,45
45 44,96 78,04 67,7 41,27 42,78
50 51,89 93,9 83,54 46,76 50,35
52 55,93 100,21 92,47 49,91 54,66
57 61,86 106,69 102,45 54,68 62,35
59 67,08 109,74 107,26 58,83 69,56
64 77,44 112,57 111,67 68 84,66
66 82,54 113,24 112,59 74,77 91
120
SM
100
OB
80 OG
60 CCP
40 CCA
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.14
Foto-estabilidad de los AOVE´s controles bajo condiciones de iluminación ultravioleta.
Tesis Doctoral
222
∆E*ab(D65)
9.1.1.- Estabilidad en función de la radiación electromagnética: Foto-estabilidad. 9.- Anexo I
Tabla 9.1.7
Comparativa de la diferencia de color de los 5 AOVE´s enriquecidos con antioxidantes a una
concentración de 0,05 mg luteína/ml.
ΔE*ab(D65) ANTIOXIDANTES (0,05 mg luteína /ml)
Días SM OB OG CCP CCA
1 1,14 1,23 1,01 1,43 1,57
2 0,96 1,05 0,62 1,92 2,12
4 0,49 0,81 0,52 2,75 3,08
7 0,46 1,27 1,53 3,22 3,89
8 0,71 1,65 1,94 3,3 4,12
11 1,78 2,41 3,01 3,33 4,48
14 2,41 3,22 3,39 3,57 4,57
15 2,22 3,61 3,68 3,65 4,71
18 3,21 4,83 4,58 4,18 5,16
21 4,49 5,74 5,38 4,39 5,45
23 5,35 6,5 5,85 4,63 5,58
28 7,09 8 6,92 5,43 5,87
30 7,99 9,09 7,41 6,01 6,07
32 8,62 10,59 8,11 6,75 6,36
35 9,88 13,4 9,3 8,22 6,97
37 10,29 15,27 9,92 9,27 7,24
39 10,95 18,12 11,11 10,75 8,02
42 11,89 23,51 12,99 13,39 9,2
45 12,91 30,77 15,79 16,94 10,96
50 14,17 43,59 20,7 23,11 14,65
52 15,23 53,11 24,75 27,72 17,83
57 16,75 68,19 31,83 35,29 23,25
59 18,89 82,6 38,94 44,66 29,95
64 22,98 107,67 57,05 75,49 52,23
66 25,85 115,92 67,63 89,67 66,77
140
120 SM
100 OB
80 OG
60 CCP
40 CCA
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.15
Foto-estabilidad de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes a una concentración de
0,05 mg luteína/ml bajo condiciones de iluminación ultravioleta.
Tesis Doctoral
223
∆E*ab(D65)
9.1.2.- Estabilidad en función de la temperatura: Termo-estabilidad 9.- Anexo I
Tabla 9.1.8
Diferencia de color de los AOVE´s “SM” tanto control como enriquecidos con antioxidantes a
diferentes concentraciones, izquierda (0,05 mg luteína/ml) y derecha (0,1 mg luteína/ml).
Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65)
0,05 mg/ml SM SM 0,1 mg/ml SM SM
Horas Control Antioxidantes Horas Control Antioxidantes
1 8,58 5,46 1 9,33 6,86
2 10,55 6,01 2 12 7,09
3 12,21 5,93 3 12,94 7,13
5 13,7 6,1 5 13,5 7,13
8 17,19 7,08 8 17,63 8,89
10 18,82 7,48 10 17,84 9
23 31,56 10,86 23 33,1 12,94
26 31,5 10,51 26 34,25 12,55
29 33,92 10,87 29 38,2 13,57
32 36,15 11,16 32 39,66 13,69
34 38,21 11,46 34 40,83 13,84
47 47,25 15,31 47 50,53 16,46
50 49,27 15,7 50 51,67 16,82
53 51,01 16,98 53 52,6 16,89
56 52,35 17,9 56 54,31 17,32
59 54,61 19,4 59 56,79 17,75
72 61,39 24,87 72 64,29 20,24
74 62,25 26,32 74 64 20,28
Tesis Doctoral
224
9.1.2.- Estabilidad en función de la temperatura: Termo-estabilidad 9.- Anexo I
70
60 Control
Antioxidantes
50
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80
HORAS
Figura 9.1.16
Termo-estabilidad del AOVE “SM” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC enriquecido
con antioxidantes a una concentración de 0,05 mg luteína/ml.
70
60 Control
50 Antioxidantes
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80
HORAS
Figura 9.1.17
Termo-estabilidad del AOVE “SM” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC enriquecido
con antioxidantes a una concentración de 0,1 mg luteína/ml.
30
25
20
15
10
5
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.18
Comparativa de la Termo-estabilidad de los AOVE´s “SM” enriquecidos con antioxidantes a
diferentes concentraciones (0,05 mg luteína/ml y 0,1 mg luteína/ml) en función del tiempo de
calentamiento a 120ºC.
Tesis Doctoral
225
∆E*ab(D65) ∆E*ab(D65) ∆E*ab(D65)
9.1.2.- Estabilidad en función de la temperatura: Termo-estabilidad 9.- Anexo I
Tabla 9.1.9
Diferencia de color de los AOVE´s “OB” tanto control como enriquecidos con antioxidantes a
diferentes concentraciones, izquierda (0,05 mg luteína/ml) y derecha (0,1 mg luteína/ml).
Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65)
0,05 mg/ml OB OB 0,1 mg/ml OB OB
Horas Control Antioxidantes Horas Control Antioxidantes
1 9,87 4,34 1 10,46 7,26
2 10,8 4,27 2 11,18 7,43
3 12,26 4,88 3 10,72 7,31
5 13,17 5,17 5 11,85 8,2
8 16,03 5,97 8 15,94 8,99
10 17,63 6,22 10 16,45 9,04
23 28,83 9,2 23 28,52 12,42
26 30,29 8,8 26 29,9 12,47
29 32,78 9,58 29 32,3 13,14
32 34,01 9,67 32 34 13,21
34 36,28 10,21 34 34,88 13,42
47 45,43 13,74 47 41,76 15,44
50 46,3 13,64 50 43,39 15,52
53 48,34 14,77 53 44,85 16,06
56 49,6 15,56 56 46,53 16,61
59 52 16,84 59 47,66 16,92
72 58,78 21,77 72 54,83 19,23
74 59,56 23,01 74 54,74 18,85
Tesis Doctoral
226
9.1.2.- Estabilidad en función de la temperatura: Termo-estabilidad 9.- Anexo I
70
60 Control
50 Antioxidantes
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.19
Termo-estabilidad del AOVE “OB” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC enriquecido
con antioxidantes a una concentración de 0,05 mg luteína/ml.
70
60 Control
50 Antioxidantes
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.20
Termo-estabilidad del AOVE “OB” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC enriquecido
con antioxidantes a una concentración de 0,1 mg luteína/ml.
30
25
20
15
10
5
0
0 20 40 60 80
HORAS
Figura 9.1.21
Comparativa de la Termo-estabilidad de los AOVE´s “OB” enriquecidos con antioxidantes a
diferentes concentraciones (0,05 mg luteína/ml y 0,1 mg luteína/ml) en función del tiempo de
calentamiento a 120ºC.
Tesis Doctoral
227
∆E*ab(D65) ∆E*ab(D65) ∆E*ab(D65)
9.1.2.- Estabilidad en función de la temperatura: Termo-estabilidad 9.- Anexo I
Tabla 9.1.10
Diferencia de color de los AOVE´s “OG” tanto control como enriquecidos con antioxidantes a
diferentes concentraciones, izquierda (0,05 mg luteína/ml) y derecha (0,1 mg luteína/ml).
Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65)
0,05 mg/ml OG OG 0,1 mg/ml OG OG
Horas Control Antioxidantes Horas Control Antioxidantes
1 8,37 4,21 1 8,45 7,12
2 9,51 4,49 2 9,55 7,06
3 9,96 4,4 3 9,44 7,04
5 10,31 4,46 5 9,94 7,05
8 13,09 5,26 8 12,52 8,43
10 14,98 5,48 10 13,25 8,13
23 25,25 7,71 23 21,26 11,56
26 26,38 7,82 26 26,29 11,76
29 28,75 8,27 29 30,08 12,33
32 29,27 8,21 32 32,84 12,14
34 31,44 9,2 34 34,91 12,95
47 39,84 11,82 47 43,37 15,33
50 43,05 12,69 50 45,37 15,5
53 44,57 13,91 53 47,54 15,82
56 46,92 14,84 56 49,96 16,05
59 47,85 15,34 59 52,31 16,76
72 57,18 23,61 72 60,74 19,05
74 58,72 24,94 74 61,17 19,02
Tesis Doctoral
228
9.1.2.- Estabilidad en función de la temperatura: Termo-estabilidad 9.- Anexo I
70
60 Control
50 Antioxidantes
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80
HORAS
Figura 9.1.22
Termo-estabilidad del AOVE “OG” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC enriquecido
con antioxidantes a una concentración de 0,05 mg luteína/ml.
70
60 Control
Antioxidantes
50
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.23
Termo-estabilidad del AOVE “OG” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC enriquecido
con antioxidantes a una concentración de 0,1 mg luteína/ml.
30
25
20
15
10
5
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.24
Comparativa de la Termo-estabilidad de los AOVE´s “OG” enriquecidos con antioxidantes a
diferentes concentraciones (0,05 mg luteína/ml y 0,1 mg luteína/ml) en función del tiempo de
calentamiento a 120ºC.
Tesis Doctoral
229
∆E*ab(D65) ∆E*ab(D65) ∆E*ab(D65)
9.1.2.- Estabilidad en función de la temperatura: Termo-estabilidad 9.- Anexo I
Tabla 9.1.11
Diferencia de color de los AOVE´s “CCP” tanto control como enriquecidos con antioxidantes a
diferentes concentraciones, izquierda (0,05 mg luteína/ml) y derecha (0,1 mg luteína/ml).
Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65)
0,05 mg/ml CCP CCP 0,1 mg/ml CCP CCP
Horas Control Antioxidantes Horas Control Antioxidantes
1 12,15 5,26 1 8,45 7,12
2 13,93 5,89 2 9,55 7,06
3 15,03 6,18 3 9,44 7,04
5 16,93 6,87 5 9,94 7,05
8 20,89 8,02 8 12,52 8,43
10 22,61 8,56 10 13,25 8,13
23 35,93 12,46 23 21,26 11,56
26 37,51 12,23 26 26,29 11,76
29 39,53 12,91 29 30,08 12,33
32 41,24 13,14 32 32,84 12,14
34 42,85 13,42 34 34,91 12,95
47 52 18,97 47 43,37 15,33
50 52,73 19,87 50 45,37 15,5
53 54,18 21,63 53 47,54 15,82
56 55,26 22,58 56 49,96 16,05
59 56,64 23,65 59 52,31 16,76
72 63,43 31,48 72 60,74 19,05
74 63,39 34,13 74 61,17 19,02
Tesis Doctoral
230
9.1.2.- Estabilidad en función de la temperatura: Termo-estabilidad 9.- Anexo I
70
60 Control
50 Antioxidantes
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.25
Termo-estabilidad del AOVE “CCP” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC enriquecido
con antioxidantes a una concentración de 0,05 mg luteína/ml.
70
60 Control
50 Antioxidantes
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.26
Termo-estabilidad del AOVE “CCP” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC enriquecido
con antioxidantes a una concentración de 0,1 mg luteína/ml.
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.27
Comparativa de la Termo-estabilidad de los AOVE´s “CCP” enriquecidos con antioxidantes a
diferentes concentraciones (0,05 mg luteína/ml y 0,1 mg luteína/ml) en función del tiempo de
calentamiento a 120ºC.
Tesis Doctoral
231
ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65)
9.1.2.- Estabilidad en función de la temperatura: Termo-estabilidad 9.- Anexo I
Tabla 9.1.12
Diferencia de color de los AOVE´s “CCA” tanto control como enriquecidos con antioxidantes a
diferentes concentraciones, izquierda (0,05 mg luteína/ml) y derecha (0,1 mg luteína/ml).
Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65)
0,05 mg/ml CCA CCA 0,1mg/ml CCA CCA
Horas Control Antioxidantes Horas Control Antioxidantes
1 10,44 6,21 1 10,9 7,28
2 12,94 6,66 2 14,08 7,71
3 15,36 6,8 3 14,02 8,49
5 18,33 7,27 5 16,65 9,3
8 23,4 8,95 8 21,58 11,46
10 26,23 9,55 10 25,04 11,63
23 43,12 13,82 23 42,28 16,38
26 46,24 14,12 26 45,7 16,96
29 49,38 14,67 29 48,34 17,6
32 51,2 15,36 32 51,13 18,17
34 54,29 16,4 34 52,87 18,36
47 64,21 21,61 47 62,73 21,27
50 65,71 23,01 50 63,87 21,62
53 67,5 24,85 53 65,67 22,2
56 69,09 25,72 56 67,42 22,64
59 70,74 28,41 59 69,14 23,17
72 76,78 38,58 72 75,71 23,78
74 77,39 40,01 74 76,08 25,03
Tesis Doctoral
232
9.1.2.- Estabilidad en función de la temperatura: Termo-estabilidad 9.- Anexo I
90
80 Control
70 Antioxidantes
60
50
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80
HORAS
Figura 9.1.28
Termo-estabilidad del AOVE “CCA” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC enriquecido
con antioxidantes a una concentración de 0,05 mg luteína/ml.
80
70 Control
60 Antioxidantes
50
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80
HORAS
Figura 9.1.29
Termo-estabilidad del AOVE “CCA” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC enriquecido
con antioxidantes a una concentración de 0,1 mg luteína/ml.
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0 20 40 60 80
HORAS
Figura 9.1.30
Comparativa de la Termo-estabilidad de los AOVE´s “CCA” enriquecidos con antioxidantes a
diferentes concentraciones (0,05 mg luteína/ml y 0,1 mg luteína/ml) en función del tiempo de
calentamiento a 120ºC.
Tesis Doctoral
233
ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65)
9.1.2.- Estabilidad en función de la temperatura: Termo-estabilidad 9.- Anexo I
Tabla 9.1.13
Comparativa en la diferencia de color de los 5 AOVE´s controles para el ensayo de
0,05 mg luteína/ml.
ΔE*ab(D65) CONTROLES
Horas SM OB OG CCP CCA
1 8,58 9,87 8,37 12,15 10,44
2 10,55 10,8 9,51 13,93 12,94
3 12,21 12,26 9,96 15,03 15,36
5 13,7 13,17 10,31 16,93 18,33
8 17,19 16,03 13,09 20,89 23,4
10 18,82 17,63 14,98 22,61 26,23
23 31,56 28,83 25,25 35,93 43,12
26 31,5 30,29 26,38 37,51 46,24
29 33,92 32,78 28,75 39,53 49,38
32 36,15 34,01 29,27 41,24 51,2
34 38,21 36,28 31,44 42,85 54,29
47 47,25 45,43 39,84 52 64,21
50 49,27 46,3 43,05 52,73 65,71
53 51,01 48,34 44,57 54,18 67,5
56 52,35 49,6 46,92 55,26 69,09
59 54,61 52 47,85 56,64 70,74
72 61,39 58,78 57,18 63,43 76,78
74 62,25 59,56 58,72 63,39 77,39
90
SM
80
70 OB
60 OG
50 CCP
40 CCA
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.31
Termo-estabilidad de los AOVE´s controles en función del tiempo de calentamiento a 120ºC.
Estos datos corresponden a los aceites control sin enriquecer.
Tesis Doctoral
234
9.1.2.- Estabilidad en función de la temperatura: Termo-estabilidad 9.- Anexo I
Tabla 9.1.14
Comparativa en la diferencia de color de los 5 AOVE´s controles para el ensayo de
0,1mg luteína/ml.
ΔE*ab(D65) CONTROLES
Horas SM OB OG CCP CCA
1 9,33 10,46 8,45 11,83 10,9
2 12 11,18 9,55 12,57 14,08
3 12,94 10,72 9,44 13,18 14,02
5 13,5 11,85 9,94 15,19 16,65
8 17,63 15,94 12,52 19,28 21,58
10 17,84 16,45 13,25 20,59 25,04
23 33,1 28,52 21,26 34,33 42,28
26 34,25 29,9 26,29 35,74 45,7
29 38,2 32,3 30,08 38,66 48,34
32 39,66 34 32,84 40,12 51,13
34 40,83 34,88 34,91 41,92 52,87
47 50,53 41,76 43,37 49,16 62,73
50 51,67 43,39 45,37 50,28 63,87
53 52,6 44,85 47,54 51,57 65,67
56 54,31 46,53 49,96 52,84 67,42
59 56,79 47,66 52,31 54,26 69,14
72 64,29 54,83 60,74 60,84 75,71
74 64 54,74 61,17 60,79 76,08
90
80 SM
70 OB
60 OG
50 CCP
40 CCA
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.32
Termo-estabilidad de los AOVE´s controles en función del tiempo de calentamiento a 120ºC. Estos
datos corresponden a los aceites control sin enriquecer.
Tesis Doctoral
235
9.1.2.- Estabilidad en función de la temperatura: Termo-estabilidad 9.- Anexo I
Tabla 9.1.15
Comparativa en la diferencia de color de los 5 AOVE´s enriquecidos con antioxidantes a una
concentración de 0,05 mg luteína/ml.
ΔE*ab(D65) ANTIOXIDANTES (0,05 mg luteína/ml)
OB OG CCP CCA
Horas SM
1 5,46 4,34 4,21 5,26 6,21
2 6,01 4,27 4,49 5,89 6,66
3 5,93 4,88 4,4 6,18 6,8
5 6,1 5,17 4,46 6,87 7,27
8 7,08 5,97 5,26 8,02 8,95
10 7,48 6,22 5,48 8,56 9,55
23 10,86 9,2 7,71 12,46 13,82
26 10,51 8,8 7,82 12,23 14,12
29 10,87 9,58 8,27 12,91 14,67
32 11,16 9,67 8,21 13,14 15,36
34 11,46 10,21 9,2 13,42 16,4
47 15,31 13,74 11,82 18,97 21,61
50 15,7 13,64 12,69 19,87 23,01
53 16,98 14,77 13,91 21,63 24,85
56 17,9 15,56 14,84 22,58 25,72
59 19,4 16,84 15,34 23,65 28,41
72 24,87 21,77 23,61 31,48 38,58
74 26,32 23,01 24,94 34,13 40,01
45
SM
40
35 OB
30 OG
25
CCP
20
15 CCA
10
5
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.33
Variación de los parámetros colorimétricos en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes a una
concentración de 0,05 mg luteína/ml.
Tesis Doctoral
236
9.1.2.- Estabilidad en función de la temperatura: Termo-estabilidad 9.- Anexo I
Tabla 9.1.16
Comparativa en la diferencia de color de los 5 AOVE´s enriquecidos con antioxidantes a una
concentración de 0,1 mg luteína/ml.
ΔE*ab(D65) ANTIOXIDANTES (0,1 mg luteína/ml)
SM OB OG CCP CCA
Horas
1 6,86 7,26 7,12 7,37 7,28
2 7,09 7,43 7,06 7,57 7,71
3 7,13 7,31 7,04 7,53 8,49
5 7,13 8,2 7,05 8,43 9,3
8 8,89 8,99 8,43 10,02 11,46
10 9 9,04 8,13 9,71 11,63
23 12,94 12,42 11,56 15,11 16,38
26 12,55 12,47 11,76 14,77 16,96
29 13,57 13,14 12,33 15,3 17,6
32 13,69 13,21 12,14 15,87 18,17
34 13,84 13,42 12,95 16,05 18,36
47 16,46 15,44 15,33 18,83 21,27
50 16,82 15,52 15,5 18,62 21,62
53 16,89 16,06 15,82 19,24 22,2
56 17,32 16,61 16,05 19,48 22,64
59 17,75 16,92 16,76 19,83 23,17
72 20,24 19,23 19,05 22,68 23,78
74 20,28 18,85 19,02 22,73 25,03
30 SM
25 OB
OG
20 CCP
15 CCA
10
5
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.34
Variación de los parámetros colorimétricos en AOVE´s enriquecidos con antioxidantes a una
concentración de 0,1 mg luteína/ml.
Tesis Doctoral
237
9.1.3.- Estabilidad en función del tiempo: Consumo preferente 9.- Anexo I
Tabla 9.1.17
Diferencia de color de los AOVE´s “SM” tanto control como enriquecidos con antioxidantes a
una concentración de 0,05 mg luteína/ml.
Concentración 0,05 ΔE*ab(D65) SM ΔE*ab(D65) SM
Días Control Antioxidantes
1 0,09 0,12
2 0,13 0,18
4 0,13 0,19
7 0,16 0,2
8 0,16 0,2
15 0,2 0,22
22 0,23 0,24
29 0,27 0,24
37 0,3 0,29
43 0,3 0,29
50 0,31 0,3
57 0,36 0,34
64 0,44 0,42
71 0,44 0,57
94 0,46 0,62
105 0,51 0,65
114 0,73 0,66
126 0,77 0,73
141 0,88 0,8
155 1,01 0,84
172 1,22 0,85
205 1,29 0,95
226 1,41 1,01
262 1,53 1,07
287 1,86 1,1
322 2,62 1,2
353 3,23 1,35
385 3,31 1,36
421 3,52 1,41
486 3,58 1,47
4
3,5 Control
3 Antioxidantes
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0 100 200 300 400 500
DÍAS
Figura 9.1.35
Estabilidad temporal del AOVE “SM” bajo condiciones de almacenamiento seco y en oscuridad
a temperatura ambiente (20 ºC).
Tesis Doctoral
238
ΔE*ab(D65)
9.1.3.- Estabilidad en función del tiempo: Consumo preferente 9.- Anexo I
Tabla 9.1.18
Diferencia de color de los AOVE´s “OB” tanto control como enriquecidos con antioxidantes a
una concentración de 0,05 mg luteína/ml.
Concentración 0,05 ΔE*ab(D65) OB ΔE*ab(D65) OB
Días Control Antioxidantes
1 0,58 0,34
2 0,61 0,34
4 0,61 0,35
7 0,61 0,36
8 0,64 0,38
15 0,64 0,4
22 0,71 0,4
29 0,75 0,42
37 0,77 0,48
43 0,94 0,49
50 0,96 0,54
57 0,96 0,54
64 0,99 0,59
71 1,02 0,83
94 1,13 0,84
105 1,41 0,86
114 1,57 1,02
126 1,75 1,14
141 2,24 1,15
155 2,72 1,25
172 2,87 1,33
205 3,68 1,34
226 5,36 1,38
262 6,52 1,62
287 7,31 1,67
322 8,23 1,88
353 9,01 1,9
385 9,62 1,97
421 9,94 2,09
486 10,18 2,16
12
10 Control
Antioxidantes
8
6
4
2
0
0 100 200 300 400 500
DÍAS
Figura 9.1.36
Estabilidad temporal del AOVE “OB” bajo condiciones de almacenamiento seco y en oscuridad
a temperatura ambiente (20 ºC).
Tesis Doctoral
239
ΔE*ab(D65)
9.1.3.- Estabilidad en función del tiempo: Consumo preferente 9.- Anexo I
Tabla 9.1.19
Diferencia de color de los AOVE´s “OG” tanto control como enriquecidos con antioxidantes a
una concentración de 0,05 mg luteína/ml.
Concentración 0,05 ΔE*ab(D65) OG ΔE*ab(D65) OG
Días Control Antioxidantes
1 0,07 0,12
2 0,07 0,14
4 0,07 0,14
7 0,07 0,15
8 0,1 0,15
15 0,29 0,15
22 0,36 0,16
29 0,38 0,16
37 0,44 0,18
43 0,56 0,18
50 0,58 0,3
57 0,7 0,36
64 0,76 0,51
71 0,77 0,86
94 0,85 0,93
105 0,86 0,95
114 1 1,07
126 1,17 1,08
141 1,27 1,12
155 1,44 1,44
172 1,95 1,55
205 2 2,22
226 2,62 2,29
262 3,31 2,31
287 3,91 2,67
322 4,14 2,86
353 4,28 3,03
385 5,42 3,09
421 5,52 3,28
486 5,91 4,45
7
6 Control
5 Antioxidantes
4
3
2
1
0
0 100 200 300 400 500
DÍAS
Figura 9.1.37
Estabilidad temporal aceite del AOVE “OG” bajo condiciones de almacenamiento seco y en
oscuridad a temperatura ambiente (20 ºC).
Tesis Doctoral
240
ΔE*ab(D65)
9.1.3.- Estabilidad en función del tiempo: Consumo preferente 9.- Anexo I
Tabla 9.1.20
Diferencia de color de los AOVE´s “CCP” tanto control como enriquecidos con antioxidantes a
una concentración de 0,05 mg luteína/ml.
Concentración 0,05 ΔE*ab(D65) CCP ΔE*ab(D65) CCP
Días Control Antioxidantes
1 0,54 0,1
2 0,57 0,18
4 0,63 0,22
7 0,64 0,24
8 0,64 0,37
15 0,64 0,53
22 0,64 0,59
29 0,67 0,68
37 0,69 0,75
43 0,81 0,86
50 0,92 1,07
57 0,95 1,08
64 1,01 1,09
71 1,43 2,06
94 1,59 2,08
105 1,74 2,12
114 1,88 2,12
126 2,09 2,16
141 2,45 2,16
155 2,86 2,17
172 3,15 2,71
205 3,49 2,9
226 4,76 3,08
262 5,86 3,28
287 6,63 3,34
322 8,78 3,53
353 9,28 3,65
385 9,87 3,75
421 10,27 3,78
486 11,21 3,95
12
10 Control
Antioxidantes
8
6
4
2
0
0 100 200 300 400 500
DÍAS
Figura 9.1.38
Estabilidad temporal del AOVE “CCP” bajo condiciones de almacenamiento seco y en
oscuridad a temperatura ambiente (20 ºC).
Tesis Doctoral
241
ΔE*ab(D65)
9.1.3.- Estabilidad en función del tiempo: Consumo preferente 9.- Anexo I
Tabla 9.1.21
Diferencia de color de los AOVE´s “CCA” tanto control como enriquecidos con antioxidantes a
una concentración de 0,05 mg luteína/ml.
Concentración 0,05 ΔE*ab(D65) CCA ΔE*ab(D65) CCA
Días Control Antioxidantes
1 0,66 0,21
2 0,67 0,24
4 0,69 0,49
7 0,74 0,5
8 0,75 0,6
15 0,78 0,7
22 0,79 0,76
29 0,81 0,86
37 0,82 0,95
43 0,83 1,14
50 0,85 1,16
57 0,87 1,21
64 0,88 1,32
71 1,25 1,67
94 1,41 1,91
105 1,5 1,96
114 1,57 2,01
126 1,67 2,03
141 1,94 2,23
155 2,29 2,27
172 2,55 2,37
205 2,95 2,67
226 4,03 2,85
262 5,24 3,23
287 6,05 3,36
322 8,22 3,74
353 8,59 3,9
385 9,47 4,11
421 10,33 4,28
486 11,39 4,37
12
Control
10
Antioxidantes
8
6
4
2
0
0 100 200 300 400 500
DÍAS
Figura 9.1.39
Estabilidad temporal del AOVE “CCA” bajo condiciones de almacenamiento seco y en
oscuridad a temperatura ambiente (20 ºC).
Tesis Doctoral
242
ΔE*ab(D65)
9.1.3.- Estabilidad en función del tiempo: Consumo preferente 9.- Anexo I
Tabla 9.1.22
Parámetros colorimétricos de los AOVE´s controles (sin enriquecer).
ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) Días
SM OB OG CCP CCA
1 0,09 0,58 0,07 0,54 0,66
2 0,13 0,61 0,07 0,57 0,67
4 0,13 0,61 0,07 0,63 0,69
7 0,16 0,61 0,07 0,64 0,74
8 0,16 0,64 0,1 0,64 0,75
15 0,2 0,64 0,29 0,64 0,78
22 0,23 0,71 0,36 0,64 0,79
29 0,27 0,75 0,38 0,67 0,81
37 0,3 0,77 0,44 0,69 0,82
43 0,3 0,94 0,56 0,81 0,83
50 0,31 0,96 0,58 0,92 0,85
57 0,36 0,96 0,7 0,95 0,87
64 0,44 0,99 0,76 1,01 0,88
71 0,44 1,02 0,77 1,43 1,25
94 0,46 1,13 0,85 1,59 1,41
105 0,51 1,41 0,86 1,74 1,5
114 0,73 1,57 1 1,88 1,57
126 0,77 1,75 1,17 2,09 1,67
141 0,88 2,24 1,27 2,45 1,94
155 1,01 2,72 1,44 2,86 2,29
172 1,22 2,87 1,95 3,15 2,55
205 1,29 3,68 2 3,49 2,95
226 1,41 5,36 2,62 4,76 4,03
262 1,53 6,52 3,31 5,86 5,24
287 1,86 7,31 3,91 6,63 6,05
322 2,62 8,23 4,14 8,78 8,22
353 3,23 9,01 4,28 9,28 8,59
385 3,31 9,62 5,42 9,87 9,47
421 3,52 9,94 5,52 10,27 10,33
486 3,58 10,18 5,91 11,21 11,39
12
SM
10
OB
8
OG
6
CCP
4
CCA
2
0
0 100 200 300 400 500
DÍAS
Figura 9.1.40
Estabilidad temporal de los AOVE´s controles bajo condiciones de almacenamiento seco y en
oscuridad a temperatura ambiente (20 ºC).
Tesis Doctoral
243
ΔE*ab(D65)
9.1.3.- Estabilidad en función del tiempo: Consumo preferente 9.- Anexo I
Tabla 9.1.23
Parámetros colorimétricos de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes a una concentración
de 0,05 mg luteína/ml.
ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) Días
SM OB OG CCP CCA
1 0,12 0,34 0,12 0,1 0,21
2 0,18 0,34 0,14 0,18 0,24
4 0,19 0,35 0,14 0,22 0,49
7 0,2 0,36 0,15 0,24 0,5
8 0,2 0,38 0,15 0,37 0,6
15 0,22 0,4 0,15 0,53 0,7
22 0,24 0,4 0,16 0,59 0,76
29 0,24 0,42 0,16 0,68 0,86
37 0,29 0,48 0,18 0,75 0,95
43 0,29 0,49 0,18 0,86 1,14
50 0,3 0,54 0,3 1,07 1,16
57 0,34 0,54 0,36 1,08 1,21
64 0,42 0,59 0,51 1,09 1,32
71 0,57 0,83 0,86 2,06 1,67
94 0,62 0,84 0,93 2,08 1,91
105 0,65 0,86 0,95 2,12 1,96
114 0,66 1,02 1,07 2,12 2,01
126 0,73 1,14 1,08 2,16 2,03
141 0,8 1,15 1,12 2,16 2,23
155 0,84 1,25 1,44 2,17 2,27
172 0,85 1,33 1,55 2,71 2,37
205 0,95 1,34 2,22 2,9 2,67
226 1,01 1,38 2,29 3,08 2,85
262 1,07 1,62 2,31 3,28 3,23
287 1,1 1,67 2,67 3,34 3,36
322 1,2 1,88 2,86 3,53 3,74
353 1,35 1,9 3,03 3,65 3,9
385 1,36 1,97 3,09 3,75 4,11
421 1,41 2,09 3,28 3,78 4,28
486 1,47 2,16 4,45 3,95 4,37
5 SM
4,5
4 OB
3,5 OG
3
2,5 CCP
2
1,5 CCA
1
0,5
0
0 100 200 300 400 500
DÍAS
Figura 9.1.41
Estabilidad temporal de los AOVE´s enriquecidos con bajo condiciones de almacenamiento
seco y en oscuridad a temperatura ambiente (20 ºC).
Tesis Doctoral
244
ΔE*ab(D65)
9.2.1.-Foto-estabilidad en función del índice de maduración del fruto 9.- Anexo I
Tabla 9.1.24
Parámetros colorimétricos de los AOVE´s con diferentes índices de madurez en los meses de
Octubre, Noviembre y Diciembre, tanto control como enriquecidos con antioxidantes a una
concentración de 0,05 mg luteína/ml.
I.MADUREZ ΔE*ab(D65) OCTUBRE ΔE*ab(D65) NOVIEMBRE ΔE*ab(D65) DICIEMBRE
Días Control Antioxidantes Control Antioxidantes Control Antioxidantes
1 4,75 3,67 4,23 3,41 1,36 0,95
2 7,57 5,03 6,73 4,84 1,99 0,65
3 9,56 6,02 7,63 5,58 2,28 0,46
4 12,29 7,53 8,12 6,73 2,86 0,47
7 14,45 10,65 8,28 8,43 4,33 1,48
9 14,85 12,51 8,72 9,02 5,65 1,99
11 14,78 14,17 9,41 9,47 6,73 2,65
14 14,34 15,86 10,78 9,76 8,95 3,52
16 14,12 16,18 11,97 9,87 10,5 4,08
18 13,89 17,27 13,13 9,84 12,02 4,57
22 13,48 18,1 16,23 9,91 17,02 6,12
25 13,54 18,55 19,09 10,36 21,41 7,34
29 14,42 19,51 23,17 10,47 26,34 8,92
32 14,94 19,89 25,37 10,63 29,99 9,59
36 16,38 20,18 29,64 10,49 37,54 11,09
39 17,99 20,78 33,04 10,49 43,94 12,43
43 21,41 20,91 38,95 10,21 55,99 15,28
46 24,5 20,86 43,35 10,08 65,9 18,24
50 28,72 20,79 48,64 10,07 78,65 22,84
53 35,6 20,28 56,42 10,78 96,48 31,85
57 44,55 19,31 67,38 12,7 112,19 45,17
60 52,48 18,4 80,64 16,3 118,29 58,11
64 61,49 17,47 93,25 22,13 121,05 72,39
66 72,38 18,27 102,99 32,93 122,52 87,59
Tesis Doctoral
245
9.2.1.-Foto-estabilidad en función del índice de maduración del fruto 9.- Anexo I
80
70 Control
60 Antioxidantes
50
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.42
Foto-estabilidad del AOVE “CCP” bajo condiciones de iluminación ultravioleta, procedentes de
fruto con diferente grado de maduración. (Mes de Octubre), (0,05 mg luteína/ml).
120
100 Control
Antioxidantes
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.43
Foto-estabilidad del AOVE “CCP” bajo condiciones de iluminación ultravioleta, procedentes de
fruto con diferente grado de maduración. (Mes de Noviembre), (0,05 mg luteína/ml).
140
120 Control
100 Antioxidantes
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.44
Foto-estabilidad del AOVE “CCP” bajo condiciones de iluminación ultravioleta, procedentes de
fruto con diferente grado de maduración. (Mes de Diciembre), (0,05 mg luteína/ml).
Tesis Doctoral
246
∆E*ab(D65) ∆E*ab(D65) ∆E*ab(D65)
9.2.1.-Foto-estabilidad en función del índice de maduración del fruto 9.- Anexo I
Tabla 9.1.25
Parámetros colorimétricos de los AOVE´s procedentes de fruto con distinto grado de
maduración. Los datos de la izquierda corresponden a los AOVE´s sin enriquecer, los de la
derecha a los enriquecidos en 0,05 mg luteína/ml.
ΔE*ab(D65) (CONTROLES) ΔE*ab(D65) (ANTIOXIDANTES)
Días Octubre Noviembre Diciembre Días Octubre Noviembre Diciembre
1 4,75 4,23 1,36 1 3,67 3,41 0,95
2 7,57 6,73 1,99 2 5,03 4,84 0,65
3 9,56 7,63 2,28 3 6,02 5,58 0,46
4 12,29 8,12 2,86 4 7,53 6,73 0,47
7 14,45 8,28 4,33
7 10,65 8,43 1,48
9 14,85 8,72 5,65 9 12,51 9,02 1,99
11 14,78 9,41 6,73 11 14,17 9,47 2,65
14 14,34 10,78 8,95 14 15,86 9,76 3,52
16 14,12 11,97 10,5 16 16,18 9,87 4,08
18 13,89 13,13 12,02 18 17,27 9,84 4,57
22 13,48 16,23 17,02 22 18,1 9,91 6,12
25 13,54 19,09 21,41 25 18,55 10,36 7,34
29 14,42 23,17 26,34 29 19,51 10,47 8,92
32 14,94 25,37 29,99 32 19,89 10,63 9,59
36 16,38 29,64 37,54 36 20,18 10,49 11,09
39 17,99 33,04 43,94 39 20,78 10,49 12,43
43 21,41 38,95 55,99 43 20,91 10,21 15,28
46 24,5 43,35 65,9 46 20,86 10,08 18,24
50 28,72 48,64 78,65 50 20,79 10,07 22,84
53 35,6 56,42 96,48 53 20,28 10,78 31,85
57 44,55 67,38 112,19 57 19,31 12,7 45,17
60 52,48 80,64 118,29 60 18,4 16,3 58,11
64 61,49 93,25 121,05 64 17,47 22,13 72,39
66 72,38 102,99 122,52 66 18,27 32,93 87,59
Tesis Doctoral
247
9.2.1.-Foto-estabilidad en función del índice de maduración del fruto 9.- Anexo I
140
Octubre
120
Noviembre
100
Diciembre
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.45
Foto-estabilidad de los AOVE´s de la variedad “Picual” bajo condiciones de iluminación
ultravioleta, procedente de fruto con diferente grado de maduración. Estos datos corresponden
a los aceites sin enriquecer.
100
90 Octubre
80 Noviembre
70 Diciembre
60
50
40
30
20
10
0
0 20 40 60
DÍAS
Figura 9.1.46
Foto-estabilidad de los AOVE´s de la variedad “Picual” bajo condiciones de iluminación
ultravioleta, procedente de fruto con diferente grado de maduración enriquecidos con
antioxidantes (0,05 mg luteína/ml).
Tesis Doctoral
248
ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65)
9.2.2.-Foto-estabilidad en función de la variedad del fruto 9.- Anexo I
Tabla 9.1.26
Parámetros colorimétricos de AOVE´s de la variedad “Picual” (izquierda) y “Royal” (derecha)
enriquecidos con antioxidantes a una concentración de 0,05 mg luteína/ml.
Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65)
0,05 mg/ml PICUAL PICUAL 0,05 mg/ml ROYAL ROYAL
Días Control Antioxidantes Días Control Antioxidantes
1 5,1 3,78 1 4,68 2,84
2 8,35 5,13 2 7,46 3,95
3 10 6 3 8,65 4,81
4 11,29 7,45 4 9,25 6,13
7 11,7 10,32 7 9,8 8,33
9 11,61 11,68 9 10,05 9,44
11 11,45 12,76 11 10,08 10,55
14 11,38 13,9 14 10,05 11,42
16 11,58 14,32 16 10,08 11,76
18 11,99 14,69 18 10,19 12
22 13,6 15,13 22 10,72 12,32
25 15,67 15,59 25 11,74 12,87
29 18,41 15,97 29 13,69 14,01
32 19,8 16,25 32 14,79 14,46
36 22,64 16,56 36 17,48 14,78
39 25,06 16,85 39 20,4 14,82
43 29,28 16,8 43 26,25 14,45
46 32,99 16,65 46 32,03 14,1
50 37,64 16,25 50 40,32 13,7
53 44,46 15,51 53 54,96 13,39
57 53,17 14,89 57 76,53 14,14
60 61,47 15,44 60 91,68 16,48
64 71,25 18,24 64 101,7 22,42
66 83,16 25,49 66 108,35 32,81
Tesis Doctoral
249
9.2.2.-Foto-estabilidad en función de la variedad del fruto 9.- Anexo I
90
80 Control
70 Antioxidantes
60
50
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.47
Foto-estabilidad del AOVE “CCP” bajo condiciones de iluminación ultravioleta, procedentes de
diferentes frutos enriquecidos con antioxidantes (0,05 mg luteína/ml).
120
100 Control
Antioxidantes
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.48
Foto-estabilidad del AOVE “CCR” bajo condiciones de iluminación ultravioleta, procedentes de
diferentes frutos enriquecidos con antioxidantes (0,05 mg luteína/ml).
Tesis Doctoral
250
∆E*ab(D65) ∆E*ab(D65)
9.2.2.-Foto-estabilidad en función de la variedad del fruto 9.- Anexo I
Tabla 9.1.27
Parámetros colorimétricos de AOVE´s de la variedad “Arbequina” (izquierda) y “Frantoio”
(derecha) enriquecidos con antioxidantes a una concentración de 0,05 mg luteína/ml.
Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65) Concentración ΔE*ab(D65) ΔE*ab(D65)
0,05 mg/ml ARBEQUINA ARBEQUINA 0,05 mg/ml FRANTOIO FRANTOIO
Días Control Antioxidantes Días Control Antioxidantes
1 4,69 3,66 1 1,38 0,79
2 7,78 5,15 2 2,64 0,5
3 8,8 6,1 3 3,57 0,33
4 9,89 7,59 4 5,16 0,44
7 11,17 9,7 7 7,31 1,15
9 11,75 10,45 9 9,07 1,77
11 12,01 10,93 11 10,95 2,38
14 12,49 11,18 14 13,96 3,43
16 13,04 11,43 16 16,29 4,04
18 13,71 11,6 18 18,54 4,6
22 15,84 11,37 22 24,49 6,19
25 18,52 11,55 25 29,38 7,68
29 23,21 12,35 29 36,89 9,12
32 25,64 12,11 32 41,45 9,91
36 30,9 11,64 36 50,22 12,28
39 35,77 11,47 39 58,47 14,99
43 44,67 11,75 43 73,55 20,69
46 55,84 13,71 46 87,42 26,19
50 72,28 19,7 50 100,54 34,02
53 90,12 36,72 53 109,26 47,48
57 103,63 64,32 57 113,04 66,52
60 108,99 84,8 60 114,21 83,19
64 111,83 99,54 64 114,83 99,06
66 113,5 109,84 66 115,26 111,78
Tesis Doctoral
251
9.2.2.-Foto-estabilidad en función de la variedad del fruto 9.- Anexo I
120
Control
100
Antioxidantes
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.49
Foto-estabilidad del AOVE “CCA” bajo condiciones de iluminación ultravioleta, procedentes de
diferentes frutos enriquecidos con antioxidantes
(0,05 mg luteína/ml).
120
Control
100 Antioxidantes
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.50
Foto-estabilidad del AOVE “CCF” bajo condiciones de iluminación ultravioleta, procedentes de
diferentes frutos enriquecidos con antioxidantes
(0,05 mg luteína/ml).
Tesis Doctoral
252
∆E*ab(D65) ∆E*ab(D65)
9.2.2.-Foto-estabilidad en función de la variedad del fruto 9.- Anexo I
Tabla 9.1.28
Parámetros colorimétricos de los AOVE´s sin enriquecer procedentes de diferentes frutos.
ΔE*ab(D65) CONTROLES
Días Picual Arbequina Frantoio Royal
1 5,1 4,69 1,38 4,68
2 8,35 7,78 2,64 7,46
3 10 8,8 3,57 8,65
4 11,29 9,89 5,16 9,25
7 11,7 11,17 7,31 9,8
9 11,61 11,75 9,07 10,05
11 11,45 12,01 10,95 10,08
14 11,38 12,49 13,96 10,05
16 11,58 13,04 16,29 10,08
18 11,99 13,71 18,54 10,19
22 13,6 15,84 24,49 10,72
25 15,67 18,52 29,38 11,74
29 18,41 23,21 36,89 13,69
32 19,8 25,64 41,45 14,79
36 22,64 30,9 50,22 17,48
39 25,06 35,77 58,47 20,4
43 29,28 44,67 73,55 26,25
46 32,99 55,84 87,42 32,03
50 37,64 72,28 100,54 40,32
53 44,46 90,12 109,26 54,96
57 53,17 103,63 113,04 76,53
60 61,47 108,99 114,21 91,68
64 71,25 111,83 114,83 101,7
66 83,16 113,5 115,26 108,35
140
Picual
120
Arbequina
100
80 Frantoio
60 Royal
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.51
Foto-estabilidad de los AOVE´s sin enriquecer bajo condiciones de iluminaciones ultravioleta,
procedentes de diferentes frutos.
Tesis Doctoral
253
9.2.2.-Foto-estabilidad en función de la variedad del fruto 9.- Anexo I
Tabla 9.1.29
Parámetros colorimétricos de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes a una concentración
de 0,05 mg luteína/ml procedentes de diferentes frutos.
ΔE*ab(D65) ANTIOXIDANTES
Días Picual Arbequina Frantoio Royal
1 3,78 3,66 0,79 2,84
2 5,13 5,15 0,5 3,95
3 6 6,1 0,33 4,81
4 7,45 7,59 0,44 6,13
7 10,32 9,7 1,15 8,33
9 11,68 10,45 1,77 9,44
11 12,76 10,93 2,38 10,55
14 13,9 11,18 3,43 11,42
16 14,32 11,43 4,04 11,76
18 14,69 11,6 4,6 12
22 15,13 11,37 6,19 12,32
25 15,59 11,55 7,68 12,87
29 15,97 12,35 9,12 14,01
32 16,25 12,11 9,91 14,46
36 16,56 11,64 12,28 14,78
39 16,85 11,47 14,99 14,82
43 16,8 11,75 20,69 14,45
46 16,65 13,71 26,19 14,1
50 16,25 19,7 34,02 13,7
53 15,51 36,72 47,48 13,39
57 14,89 64,32 66,52 14,14
60 15,44 84,8 83,19 16,48
64 18,24 99,54 99,06 22,42
66 25,49 109,84 111,78 32,81
120
Picual
100
Arbequina
80
Frantoio
60
Royal
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
DÍAS
Figura 9.1.52
Foto-estabilidad de los AOVE´s bajo condiciones de iluminaciones ultravioleta, procedentes de
diferentes frutos, enriquecidos con antioxidantes (0,05 mg luteína/ml).
Tesis Doctoral
254
9.2.3.- Termo-estabilidad en función del índice de maduración del fruto 9.- Anexo I
Tabla 9.1.30
Parámetros colorimétricos de los AOVE´s con diferentes índices de madurez en los meses de
Octubre, Noviembre y Diciembre tanto control como enriquecidos con antioxidantes a una
concentración de 0,05 mg luteína/ml.
I.MADUREZ ΔE*ab(D65) OCTUBRE ΔE*ab(D65) NOVIEMBRE ΔE*ab(D65) DICIEMBRE
Horas Control Antioxidantes Control Antioxidantes Control Antioxidantes
1 5,31 3,69 7,95 4,28 8,38 5,72
2 6,42 3,24 10,4 2,92 8,41 5,22
3 7,1 4,38 11,6 2,98 8,23 5,33
5 7,61 7,19 12,17 3,79 9,15 5,46
8 9,43 9,09 14,97 4,84 11,82 6,37
10 10,2 9,76 16,35 5,14 13,44 6,73
23 14,79 13,09 26,11 7,62 21,71 9,01
26 15,88 12,99 27,34 7,43 22,6 9,1
29 16,95 13,22 29,32 7,57 24,65 9,4
32 18,04 13,45 31,02 7,84 26,59 9,9
34 19,6 13,57 32,93 8,06 28,33 10,31
47 26,75 14,49 42,11 10,24 37,57 13,19
50 28,15 14,5 42,73 10,18 38,33 13,53
53 29,58 14,76 44,41 10,7 40,03 14,22
56 31,55 14,11 45,82 11,28 41,69 15,05
59 32,29 14,14 46,46 11,78 43,09 14,87
72 40,82 14,03 53,95 16,11 51,2 20,74
74 41,44 13,82 54,24 16,77 51,84 21,21
60
Control
50
Antioxidantes
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.53
Termo-estabilidad del AOVE “CCP” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC,
procedentes de frutos con diferente grado de maduración. (Mes Octubre).
Tesis Doctoral
255
∆E*ab(D65)
9.2.3.- Termo-estabilidad en función del índice de maduración del fruto 9.- Anexo I
60
Control
50
Antioxidantes
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.54
Termo-estabilidad del AOVE “CCP” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC,
procedentes de frutos con diferente grado de maduración. (Mes Noviembre).
60
Control
50
Antioxidantes
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.55
Termo-estabilidad del AOVE “CCP” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC,
procedentes de frutos con diferente grado de maduración. (Mes Diciembre).
Tesis Doctoral
256
dE*ab(D65) ∆E*ab(D65)
9.2.3.- Termo-estabilidad en función del índice de maduración del fruto 9.- Anexo I
Tabla 9.1.31.
Parámetros colorimétricos de los AOVE´s procedentes de fruto con distinto grado de
maduración. Los datos de la izquierda corresponden a los AOVE´s sin enriquecer, los de la
derecha a los enriquecidos en 0,05 mg luteína/ml.
ΔE*ab(D65) (CONTROLES) ΔE*ab(D65) (ANTIOXIDANTES)
Horas Octubre Noviembre Diciembre Horas Octubre Noviembre Diciembre
1 5,31 7,95 8,38 1 3,69 4,28 5,72
2 6,42 10,4 8,41 2 3,24 2,92 5,22
3 7,1 11,6 8,23 3 4,38 2,98 5,33
5 7,61 12,17 9,15 5 7,19 3,79 5,46
8 9,43 14,97 11,82 8 9,09 4,84 6,37
10 10,2 16,35 13,44 10 9,76 5,14 6,73
23 14,79 26,11 21,71 23 13,09 7,62 9,01
26 15,88 27,34 22,6 26 12,99 7,43 9,1
29 16,95 29,32 24,65 29 13,22 7,57 9,4
32 18,04 31,02 26,59 32 13,45 7,84 9,9
34 19,6 32,93 28,33 34 13,57 8,06 10,31
47 26,75 42,11 37,57 47 14,49 10,24 13,19
50 28,15 42,73 38,33 50 14,5 10,18 13,53
53 29,58 44,41 40,03 53 14,76 10,7 14,22
56 31,55 45,82 41,69 56 14,11 11,28 15,05
59 32,29 46,46 43,09 59 14,14 11,78 14,87
72 40,82 53,95 51,2 72 14,03 16,11 20,74
74 41,44 54,24 51,84 74 13,82 16,77 21,21
Tesis Doctoral
257
9.2.3.- Termo-estabilidad en función del índice de maduración del fruto 9.- Anexo I
60
Octubre
50
Noviembre
40 Diciembre
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.56
Termo-estabilidad del AOVE “CCP” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC,
procedentes de frutos con diferente grado de maduración. Estos datos corresponden a los
aceites sin enriquecer.
30
Octubre
Noviembre
20 Diciembre
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.57
Termo-estabilidad del AOVE “CCP” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC,
procedentes de frutos con diferente grado de maduración enriquecidos con antioxidantes
(0,05 mg luteína/ml).
Tesis Doctoral
258
∆E*ab(D65) ∆E*ab(D65)
9.2.4.- Termo-estabilidad en función de la variedad del fruto 9.- Anexo I
Tabla 9.1.32
Parámetros colorimétricos de los AOVE´s de las variedades “Picual”, “Arbequina” y “Royal”,
enriquecidos con antioxidantes a una concentración de 0,05 mg luteína/ml.
VARIEDAD ΔE*ab(D65) PICUAL ΔE*ab(D65) ARBEQUINA ΔE*ab(D65) ROYAL
Horas Control Antioxidantes Control Antioxidantes Control Antioxidantes
1 8,07 2,91 10,77 4,64 7,71 3,79
2 9,12 3,17 11,13 3,92 8,2 3,98
3 9,47 4,65 11,65 3,56 8,42 4,22
5 10,8 5,43 12,34 3,79 8,89 5,3
8 12,15 7,39 14,74 5,41 12,07 6,69
10 13,26 7,72 15,13 5,72 12,59 6,98
23 18,96 9,87 23,61 7,76 20,53 8,94
26 20,67 10,01 25,23 7,93 22,43 9,41
29 22,36 10,1 26 7,98 24,06 9,01
32 23,21 10,2 28,78 8,48 25,14 9,21
34 24,19 10,36 29,99 8,9 25,99 9,69
47 33,07 10,85 39,11 11,48 37,09 11,3
50 33,9 10,81 39,83 11,73 38,7 11,36
53 35,98 11,13 42,16 12,58 40,69 11,79
56 37,42 10,89 43,43 13,7 42,69 12,97
59 39,26 11,19 45,6 14,83 44,53 13,96
72 46,59 14,16 52,5 20,78 51,88 19,48
74 47,05 14,28 53,4 21,63 53,33 20,54
Tesis Doctoral
259
9.2.4.- Termo-estabilidad en función de la variedad del fruto 9.- Anexo I
60
Control
50 Antioxidantes
40
30
20
10
0
0 20 HORAS 40 60 80
Figura 9.1.58
Termo-estabilidad del AOVE “CCP” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC,
procedentes de diferentes frutos enriquecidos con antioxidantes (0,05 mg luteína/ml).
60
Control
50 Antioxidantes
40
30
20
10
0
0 20 HORAS 40 60 80
Figura 9.1.59
Termo-estabilidad del AOVE “CCA” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC,
procedentes de diferentes frutos enriquecidos con antioxidantes (0,05 mg luteína/ml).
60
Control
50
Antioxidantes
40
30
20
10
0
0 20 HORAS40 60 80
Figura 9.1.60
Termo-estabilidad del AOVE “CCR” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC,
procedentes de diferentes frutos enriquecidos con antioxidantes (0,05 mg luteína/ml).
Tesis Doctoral
260
∆E*ab(D65) ∆E*ab(D65) ΔE*ab(D65)
9.2.4.- Termo-estabilidad en función de la variedad del fruto 9.- Anexo I
Tabla 9.1.33
Parámetros colorimétricos de los AOVE´s de la variedad “Frantoio”, enriquecidos con
antioxidantes a una concentración de 0,05 mg luteína/ml.
ΔE*ab(D65) FRANTOIO
Horas Control Antioxidantes
1 12,48 6,61
2 14,87 7,26
3 16,46 7,73
5 19,15 8,51
8 25,14 10,68
10 26,2 10,61
23 40,38 15,43
26 41,58 16,21
29 43,96 17,15
32 46 18,21
34 47,22 19,21
47 56,79 25,16
50 57,11 27,63
53 58,74 29,92
56 60,4 31,89
59 61,71 34,28
72 67,46 42,61
74 68,27 43,89
80
70 Control
60 Antioxidantes
50
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.61
Termo-estabilidad del AOVE “CCF” en función del tiempo de calentamiento a 120ºC,
procedentes de diferentes frutos enriquecidos con antioxidantes (0,05 mg luteína/ml).
Tesis Doctoral
261
∆E*ab(D65)
9.2.4.- Termo-estabilidad en función de la variedad del fruto 9.- Anexo I
Tabla 9.1.34
Parámetros colorimétricos de los AOVE´s sin enriquecer procedentes de diferentes frutos.
ΔE*ab(D65) CONTROLES
Horas Picual Arbequina Frantoio Royal
1 8,07 10,77 12,48 7,71
2 9,12 11,13 14,87 8,2
3 9,47 11,65 16,46 8,42
5 10,8 12,34 19,15 8,89
8 12,15 14,74 25,14 12,07
10 13,26 15,13 26,2 12,59
23 18,96 23,61 40,38 20,53
26 20,67 25,23 41,58 22,43
29 22,36 26 43,96 24,06
32 23,21 28,78 46 25,14
34 24,19 29,99 47,22 25,99
47 33,07 39,11 56,79 37,09
50 33,9 39,83 57,11 38,7
53 35,98 42,16 58,74 40,69
56 37,42 43,43 60,4 42,69
59 39,26 45,6 61,71 44,53
72 46,59 52,5 67,46 51,88
74 47,05 53,4 68,27 53,33
80
70 Picual
60 Arbequina
50 Frantoio
Royal
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.62
Termo-estabilidad de los AOVE´s en función del tiempo de calentamiento a 120ºC, procedentes
de frutos con diferente grado de maduración. Estos datos corresponden a los aceites sin
enriquecer.
Tesis Doctoral
262
∆E*ab(D65)
9.2.4.- Termo-estabilidad en función de la variedad del fruto 9.- Anexo I
Tabla 9.1.35
Parámetros colorimétricos de los AOVE´s enriquecidos con antioxidantes a una concentración
de 0,05 mg luteína/ml procedentes de diferentes frutos.
ΔE*ab(D65) ANTIOXIDANTES
Horas Picual Arbequina Frantoio Royal
1 2,91 4,64 6,61 3,79
2 3,17 3,92 7,26 3,98
3 4,65 3,56 7,73 4,22
5 5,43 3,79 8,51 5,3
8 7,39 5,41 10,68 6,69
10 7,72 5,72 10,61 6,98
23 9,87 7,76 15,43 8,94
26 10,01 7,93 16,21 9,41
29 10,1 7,98 17,15 9,01
32 10,2 8,48 18,21 9,21
34 10,36 8,9 19,21 9,69
47 10,85 11,48 25,16 11,3
50 10,81 11,73 27,63 11,36
53 11,13 12,58 29,92 11,79
56 10,89 13,7 31,89 12,97
59 11,19 14,83 34,28 13,96
72 14,16 20,78 42,61 19,48
74 14,28 21,63 43,89 20,54
50
Picual
40
Arbequina
30 Frantoio
Royal
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
HORAS
Figura 9.1.63
Termo-estabilidad los AOVE´s en función del tiempo de calentamiento a 120ºC, procedentes
de frutos con diferente grado de maduración enriquecidos con antioxidantes
(0,05 mg luteína/ml).
Tesis Doctoral
263
∆E*ab(D65)
9. ANEXO II
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
Tabla 9.3.1
Detalle de las parejas de palabras y posibilidades de valoración de las mismas, en los test de
apreciación visual de los aceites.
COLOR EMOTION TEST
Nombre y Apellidos:
Edad: Sexo:
País de procedencia:
Profesión:
Tipo Aceite:
Número de test:
PAREJAS DE PARÁMETROS A VALORAR
AMARGO DULCE
Valoración Valoración
Un poco Moderadamente Mucho Un poco Moderadamente Mucho
1 2 3 1 2 3
AROMÁTICO INODORO
Valoración Valoración
Un poco Moderadamente Mucho Un poco Moderadamente Mucho
1 2 3 1 2 3
FRESCO RANCIO
Valoración Valoración
Un poco Moderadamente Mucho Un poco Moderadamente Mucho
1 2 3 1 2 3
SALUDABLE NO SALUDABLE
Valoración Valoración
Un poco Moderadamente Mucho Un poco Moderadamente Mucho
1 2 3 1 2 3
SABROSO INSÍPIDO
Valoración Valoración
Un poco Moderadamente Mucho Un poco Moderadamente Mucho
1 2 3 1 2 3
ÁSPERO SUAVE
Valoración Valoración
Un poco Moderadamente Mucho Un poco Moderadamente Mucho
1 2 3 1 2 3
PICANTE NO PICANTE
Valoración Valoración
Un poco Moderadamente Mucho Un poco Moderadamente Mucho
1 2 3 1 2 3
NATURAL ARTIFICIAL
Valoración Valoración
Un poco Moderadamente Mucho Un poco Moderadamente Mucho
1 2 3 1 2 3
GUSTA NO GUSTA
Valoración Valoración
Un poco Moderadamente Mucho Un poco Moderadamente Mucho
1 2 3 1 2 3
Tesis Doctoral
264
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
Imagen 9.3.1
Detalle de los 18 AOVE´s utilizados para los test de valoración visual por potenciales
consumidores.
a b c
Imagen 9.3.2
Variación del color en AOVE tipo “B”: (a) control; (b) enriquecido en luteína hasta 0,05
mg/ml y (c) enriquecido hasta 0,1 mg/ml.
Tesis Doctoral
265
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
9.3.1.- RESULTADOS CON POBLACIÓN ACOSTUMBRADA AL CONSUMO DE
ACEITE DE OLIVA
COLOR EMOTION TEST
Nombre Yolanda Fecha 27/01/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x x x
Dulce x x x x x x x
Aromático x x x x x x x x x x x x x x x
Inodoro x x x
Fresco x x x x x x x x x x x x x x
Rancio x x x x
Saludable x x x x x x x x x x x x x
No saludable x x x x x
Sabroso x x x x x x x x x x x x
Insípido x x x x x x
Áspero x x x x x x x
Suave x x x x x x x x x x x
Picante x x x x x x
No picante x x x x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Yolanda Fecha 05/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x
Dulce x x x x x x x x x
Aromático x x x x x x x x x x x x x x x
Inodoro x x x
Fresco x x x x x x x x x x x x x
Rancio x x x x x
Saludable x x x x x x x x x x
No saludable x x x x x x x x
Sabroso x x x x x x x x x x x x x
Insípido x x x x x
Áspero x x x x x x x
Suave x x x x x x x x x x x
Picante x x x x x
No picante x x x x x x x x x x x x x
Natural x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Yolanda Fecha 12/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x x
Dulce x x x x x x x x
Aromático x x x x x x x x x x x x x x x
Inodoro x x x
Fresco x x x x x x x x x x x x x x
Rancio x x x x
Saludable x x x x x x x x x x x
No saludable x x x x x x x
Sabroso x x x x x x x x x x x x x x
Insípido x x x x
Áspero x x x x x x x
Suave x x x x x x x x x x x
Picante x x x x
No picante x x x x x x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x
Tesis Doctoral
266
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Laura María Fecha 29/01/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x x x x x x x x x
Dulce x
Aromático x x x x x x x x x x x x x x x x x
Inodoro x
Fresco x x x x x x x x x x x x x x x x
Rancio x x
Saludable x x x x x x x x x x x x x x x x x
No saludable x
Sabroso x x x x x x x x x x x x x x x x x x
Insípido
Áspero x x x x x
Suave x x x x x x x x x x x x x
Picante x x x x x x x x x
No picante x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x x x x x x
Artificial x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x x x x x x
No gusta x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Laura María Fecha 07/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x x x x x x x x x x
Dulce
Aromático x x x x x x x x x x x x x x x x x x
Inodoro
Fresco x x x x x x x x x x x x x x x x x
Rancio x
Saludable x x x x x x x x x x x x x x x x x x
No saludable
Sabroso x x x x x x x x x x x x x x x x x x
Insípido
Áspero x x x x x x x x x
Suave x x x x x x x x x
Picante x x x x x x x x x x
No picante x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x x x x x x x x x x
Artificial
Gusta x x x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Laura María Fecha 26/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x x x x x x x
Dulce x x x
Aromático x x x x x x x x x x x x x x x x x x
Inodoro
Fresco x x x x x x x x x x x x x x x x x x
Rancio
Saludable x x x x x x x x x x x x x x x x x x
No saludable
Sabroso x x x x x x x x x x x x x x x x x x
Insípido
Áspero x x x x x x x x x
Suave x x x x x x x x x
Picante x x x x x x x x x
No picante x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x x x x x x x x x x
Artificial
Gusta x x x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x
Tesis Doctoral
267
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Ildefonso Fecha 29/01/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x
Dulce x x x x x x x x x x x x x
Aromático x x x x x x x x x x x x x
Inodoro x x x x x
Fresco x x x x x x x x x
Rancio x x x x x x x x x
Saludable x x x x x x x x x x x x x x
No saludable x x x x
Sabroso x x x x x x x x x x
Insípido x x x x x x x x
Áspero x x x x x x x
Suave x x x x x x x x x x x
Picante x x x x x x
No picante x x x x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Ildefonso Fecha 06/03/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x
Dulce x x x x x x x x x x
Aromático x x x x x x x x x x x
Inodoro x x x x x x x
Fresco x x x x x x x x x x x x
Rancio x x x x x x
Saludable x x x x x x x x x x
No saludable x x x x x x x x
Sabroso x x x x x x x x x x
Insípido x x x x x x x x
Áspero x x x x x x x x x x
Suave x x x x x x x x
Picante x x x x
No picante x x x x x x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Ildefonso Fecha 11/03/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x x
Dulce x x x x x x x x
Aromático x x x x x x x x x x
Inodoro x x x x x x x x
Fresco x x x x x x x
Rancio x x x x x x x x x x x
Saludable x x x x x x x x
No saludable x x x x x x x x x x
Sabroso x x x x x x x x x x x
Insípido x x x x x x x
Áspero x x x x x x x x
Suave x x x x x x x x x x
Picante x x x x x x
No picante x x x x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x
Tesis Doctoral
268
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Juan Antonio Fecha 29/01/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Juan Antonio Fecha 06/03/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Juan Antonio Fecha 08/05/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Tesis Doctoral
269
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Eva Fecha 30/01/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x x x x x x x
Artificial x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Eva Fecha 11/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x x x x x x x x
Artificial x x x
Gusta x x x x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Eva Fecha 25/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Tesis Doctoral
270
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre José Antonio Fecha 30/01/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Gusta x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x
Nombre José Antonio Fecha 07/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Artificial x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x
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Nombre José Antonio Fecha 21/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Saludable x x x x x x x x
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Picante x x x x x x
No picante x x x x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x x
Tesis Doctoral
271
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Jorge Fecha 30/01/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Artificial x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Jorge Fecha 05/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x x
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COLOR EMOTION TEST
Nombre Jorge Fecha 05/03/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Tesis Doctoral
272
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Pedro Javier Fecha 03/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Artificial x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Pedro Javier Fecha 16/05/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Pedro Javier Fecha 23/05/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Gusta x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x
Tesis Doctoral
273
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Francisco Miguel Fecha 03/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x x
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COLOR EMOTION TEST
Nombre Francisco Miguel Fecha 20/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x x x x x
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Gusta x x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Francisco Miguel Fecha 23/05/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Saludable x x x x x x x x x x
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Sabroso x x x x x x x x x x x x x
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Picante x x x x x x
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Natural x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x
Tesis Doctoral
274
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre José Miguel Fecha 03/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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No picante x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre José Miguel Fecha 20/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x x x x x x x x x x
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No picante x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre José Miguel Fecha 15/05/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x x x
Tesis Doctoral
275
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Gala Fecha 03/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Gala Fecha 20/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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No picante x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Gala Fecha 15/05/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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No picante x x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x x
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Gusta x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x
Tesis Doctoral
276
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Tomás Javier Fecha 05/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Picante x x x x x x x x x x
No picante x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Tomás Javier Fecha 07/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x x x x
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Rancio x x x x x x x x
Saludable x x x x x x x x x x
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Sabroso x x x x x x x x x
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Áspero x x x x x x x x x
Suave x x x x x x x x x
Picante x x x x x x x x x x
No picante x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Tomás Javier Fecha 18/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x x x x x
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Fresco x x x x x x x x
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Saludable x x x x x x x x
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Sabroso x x x x x x
Insípido x x x x x x x x x x x x
Áspero x x x x x x x x x x x
Suave x x x x x x x
Picante x x x x x x x x x
No picante x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x
Tesis Doctoral
277
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre José Fecha 05/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x x x x x x x
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COLOR EMOTION TEST
Nombre José Fecha 12/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre José Fecha 19/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Gusta x x x x x x x x
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Tesis Doctoral
278
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Juan Fecha Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Picante x x x x x x x x x
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Natural x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Juan Fecha 19/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Insípido x x x x x x x x x x
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Picante x x x x x x x x x x x x x
No picante x x x x x
Natural x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Juan Fecha 27/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Artificial x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x
Tesis Doctoral
279
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Francisco José Fecha 12/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Picante x x x x x x x x
No picante x x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Francisco José Fecha 19/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Insípido x x x x x x x
Áspero x x x x x x x x x x x
Suave x x x x x x x
Picante x x x x x x x x x x x x x
No picante x x x x x
Natural x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Francisco José Fecha 26/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Sabroso x x x x x x x x x x x x x x
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Natural x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x
Tesis Doctoral
280
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre María Fecha 12/07/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre María Fecha 18/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre María Fecha 26/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x
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Gusta x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x
Tesis Doctoral
281
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Julia Fecha 12/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Julia Fecha 27/03/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Julia Fecha 07/05/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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No picante x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x
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Gusta x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x
Tesis Doctoral
282
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Pablo Antonio Fecha 18/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Saludable x x x x x x x x x x x
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Áspero x x x x x x x x
Suave x x x x x x x x x x
Picante x x x x x
No picante x x x x x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Pablo Antonio Fecha 26/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x
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Saludable x x x x x x x x x x x x x
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Picante x x x x x x x
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Natural x x x x x x x x x x x x x x x
Artificial x x x
Gusta x x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Pablo Antonio Fecha 05/03/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x
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Saludable x x x x x x x x x x x x x x x x
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Natural x x x x x x x x x x x x x x x x x
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Gusta x x x x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x
Tesis Doctoral
283
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Diego Fecha 20/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x
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Picante x x x x
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Natural x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Diego Fecha 26/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Diego Fecha 06/03/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x
Tesis Doctoral
284
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Vicente Fecha 10/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Rancio x x x x x x x x
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Natural x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Vicente Fecha 30/05/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x
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Fresco x x x x x x
Rancio x x x x x x x x x x x x
Saludable x x x x x x x x
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Sabroso x x x x x x x x
Insípido x x x x x x x x x x
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Suave x x x x x x x x x x x x x
Picante x x x x x x
No picante x x x x x x x x x x x x
Natural x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Vicente Fecha 06/11/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x
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Rancio x x x x x x x x
Saludable x x x x x x x x x x
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Sabroso x x x x x x
Insípido x x x x x x x x x x x x
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Picante x x x
No picante x x x x x x x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x
Tesis Doctoral
285
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
9.3.2.- RESULTADOS CON POBLACIÓN NO ACOSTUMBRADA AL CONSUMO DE
ACEITE DE OLIVA
COLOR EMOTION TEST
Nombre José Fecha 29/01/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x x x
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Fresco x x x x x x x x
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Saludable x x x x x x x x x x x
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Sabroso x x x x x x x x x
Insípido x x x x x x x x x
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Picante x x x x x x x x x x
No picante x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre José Fecha 06/03/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x
Dulce x x x x x x x x x x
Aromático x x x x x x x x x x x x
Inodoro x x x x x x
Fresco x x x x x x x x
Rancio x x x x x x x x x x
Saludable x x x x x x x x x x x x
No saludable x x x x x x
Sabroso x x x x x x x x x x x x
Insípido x x x x x x
Áspero x x x x x x x x x x
Suave x x x x x x x x
Picante x x x x x x x x x x x
No picante x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre José Fecha 11/03/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x x
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Saludable x x x x x x x x x x x x x
No saludable x x x x x
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Picante x x x x x x x x x x
No picante x x x x x x x x
Natural x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x
Tesis Doctoral
286
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Amine Fecha 05/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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No picante x x x
Natural x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Amine Fecha 19/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Amine Fecha 27/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x
Tesis Doctoral
287
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Juan Fecha 07/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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No picante x x x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Juan Fecha 12/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x x x
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COLOR EMOTION TEST
Nombre Juan Fecha 17/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x
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No gusta x x x x
Tesis Doctoral
288
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Cayetano Fecha 07/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x x x x x x
No gusta x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Cayetano Fecha 18/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo
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Natural x x x x x x x x x x x x x x
Artificial x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x x x x x x x
No gusta x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Cayetano Fecha 30/05/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Natural x x x x x x x x x x x x x x x x x x
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Gusta x x x x x x x x x x x x x x x x x
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Tesis Doctoral
289
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Gabino Fecha 18/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x x x
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Picante x x x x x x x
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Natural x x x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Gabino Fecha 07/03/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
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Insípido x x x x x x
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Picante x x x x x x x x x x x x
No picante x x x x x x
Natural x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x x x x x
No gusta x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Gabino Fecha 12/03/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x x
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Picante x x x x x x x x x x
No picante x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x x x
Tesis Doctoral
290
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Georgiama Fecha 18/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x
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Natural x x x x x x x x x x x x x x x x x x
Artificial
Gusta x x x x x x x x x x x x x x x x x x
No gusta
COLOR EMOTION TEST
Nombre Georgiama Fecha 30/04/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x
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Sabroso x x x x x x x x x x x x x x x x x x
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Picante x x x x x x x x x
No picante x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x x x x x x x x x x
Artificial
Gusta x x x x x x x x x x x x x x x x x x
No gusta
COLOR EMOTION TEST
Nombre Georgiama Fecha 16/05/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x
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Aromático x x x x x x x x x x x x x x x x x x
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Fresco x x x x x x x x x x x x x x x x x x
Rancio
Saludable x x x x x x x x x x x x x x x x x x
No saludable
Sabroso x x x x x x x x x x x x x x x x x x
Insípido
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Picante x x x x x x x
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Natural x x x x x x x x x x x x x x x x x x
Artificial
Gusta x x x x x x x x x x x x x x x x
No gusta x x
Tesis Doctoral
291
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Monain Fecha 18/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x x
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Saludable x x x x x x x x x
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Sabroso x x x x x x x
Insípido x x x x x x x x x x x
Áspero x x x x x x x x x
Suave x x x x x x x x x
Picante x x x x x x
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Natural x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Monain Fecha 24/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x x
Dulce x x x x x x x x
Aromático x x x x x x x x x x x
Inodoro x x x x x x x
Fresco x x x x x x x x
Rancio x x x x x x x x x x
Saludable x x x x x x x x
No saludable x x x x x x x x x x
Sabroso x x x x x x x x
Insípido x x x x x x x x x x
Áspero x x x x x x x x x x
Suave x x x x x x x x
Picante x x x x x x x x x
No picante x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Monain Fecha 04/03/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x x
Dulce x x x x x x x x
Aromático x x x x x x x x
Inodoro x x x x x x x x x x
Fresco x x x x x x x x
Rancio x x x x x x x x x x
Saludable x x x x x x x x
No saludable x x x x x x x x x x
Sabroso x x x x x x x x
Insípido x x x x x x x x x x
Áspero x x x x x x x x x x
Suave x x x x x x x x
Picante x x x x x x x x x x
No picante x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x
Tesis Doctoral
292
9.3.- Experimento de emociones suscitadas por el color 9.- Anexo II
COLOR EMOTION TEST
Nombre Anne Paola Fecha 21/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x
Dulce x x x x x x x x x x
Aromático x x x x x x x x x x x x
Inodoro x x x x x x
Fresco x x x x x x x x x x x x x x
Rancio x x x x
Saludable x x x x x x x x x
No saludable x x x x x x x x x
Sabroso x x x x x x
Insípido x x x x x x x x x x x x
Áspero x x x x x x x
Suave x x x x x x x x x x x
Picante x x
No picante x x x x x x x x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x
Gusta x x x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Anne Paola Fecha 27/02/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x x x x x
Dulce x x x x x
Aromático x x x x x x x x x
Inodoro x x x x x x x x x
Fresco x x x x x x x x x x x x x
Rancio x x x x x
Saludable x x x x x x x x x
No saludable x x x x x x x x x
Sabroso x x x x x x x x x
Insípido x x x x x x x x x
Áspero x x x x x
Suave x x x x x x x x x x x x x
Picante x x
No picante x x x x x x x x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x x x
Gusta x x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x x x
COLOR EMOTION TEST
Nombre Anne Paola Fecha 07/03/2014 Telfno
Tipo Aceite 4c 2a 5c 7c 6b 2c 7a 1c 2b 5a 4b 6a 7b 6c 1a 1b 5b 4a
Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor
Parámetros 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Amargo x x x x x x x x x x x x x
Dulce x x x x x
Aromático x x x x x x x x x x
Inodoro x x x x x x x x
Fresco x x x x x x x x x x x x x
Rancio x x x x x
Saludable x x x x x x x x
No saludable x x x x x x x x x x
Sabroso x x x x x
Insípido x x x x x x x x x x x x x
Áspero x x x x x x x
Suave x x x x x x x x x x x
Picante x x x x x x x
No picante x x x x x x x x x x x
Natural x x x x x x x x x x x
Artificial x x x x x x x
Gusta x x x x x
No gusta x x x x x x x x x x x x x
Tesis Doctoral
293
10. SUMMARY
10.- Summary
Thesis title:
EXTRA VIRGIN OLIVE OILS ENRICHED WITH NEW ANTIOXIDANTS FROM
MICROALGAE. PHYSICAL–CHEMICAL CHARACTERIZATION, COLORIMETRIC AND
STABILITY TEST.
1.- INTRODUCTION
2.- MATERIALS AND METHODS
2.1.- Production conditions of microalgae S. almeriensis
2.2.- Extraction methods
2.3.- Physicochemical characterization of lutein and oils. Stability measures
2.4.- Extra virgin olive oils
2.5.- Chemical characterization of oils enriched with antioxidants
2.6.- Color emotion studies
3.- RESULTS AND DISCUSSION
3.1.- Stability based on incident radiation: photo-stability
3.2.- Stability as a function of temperature: thermostability
3.3.- Stability as a function of time: preferential consumption
3.4.- Specific stability studies
3.4.1.- Photo-stability according to the ripeness index of the fruit
3.4.2.- Photo-stability depending on the variety of the fruit
3.4.3.- Thermostability according to the ripeness index of the fruit
3.4.4.- Thermostability depending on the variety of the fruit
3.5.- Studies of chemical quality parameters
3.6.- Studies of visual appreciation of oils. Color Emotion Studies
4.- CONCLUSIONS
5.- REFERENCES
Doctoral Thesis
294
10.- Summary
1.- INTRODUCTION
There is a growing interest in the development of functional foods, which are those
that are capable of providing health benefits, in addition to their nutritional or energy value.
These products are usually traditional foods enriched in one or more components, which
exert or promote a beneficial effect for human health.
Interest in carotenoids has recently increased based on studies suggesting the
protective effect of an adequate intake of these compounds in the prevention and
evolution of human degenerative diseases, such as ophthalmologic and dermatological
diseases. At present, there are no drugs that can correct these diseases, so the only
viable strategy to prevent them. However, the recommended dose of carotenoids for risk
groups can hardly be covered by dietary modifications. For this reason, one of the
prevention routes with better prospects is the intake of foods enriched in antioxidants.
On the other hand, it is well known that olive oil possesses due to its chemical
composition important properties that make it a very healthy and recommended food,
whilst presenting a high factor of digestibility, a very important parameter in food. There
are many scientific works that support the importance of its incorporation into a balanced
diet, showing very beneficial effects on health, among which we can mention: reduction of
cholesterol level; decreased risk of arterial infarction and thrombosis; efficacy in the fight
against ulcers, gastritis and acidity in general; regulation of intestinal transit and
stimulation of bone growth and prevention of many human degenerative diseases.
Extra virgin olive oil is a very balanced food that consists of a large variety of
molecules: hydrocarbon compounds, sterols, diterpene and triterpenic compounds,
aliphatic alcohols, tocopherols, pigments, chlorophylls and carotenoids.
Within the family of carotenoids, lutein and β-carotene are found in very small
amounts in olive oil in their original composition, being below recommended values for the
prevention of human degenerative diseases (e.g., The Senile Macular Degeneration,
AMD). However, it is important to note that olive oil may be an adequate means of
transporting these carotenoids because of their characteristics and because they contain
small amounts of these carotenoids. Increasing the concentration of previously existing
components should not lead to severe stability problems, a fact that could occur when
trying to add chemical compounds totally foreign to the receiving environment.
Doctoral Thesis
295
10.- Summary
In the current state of research on the role of antioxidants such as lutein in the
prevention of AMD, one of the main concerns is to determine the extent to which the lutein
supplied by different dietary sources is digested and adsorbed (digestibility-
bioaccessibility studies). This concern extends to commercial extracts currently used in
nutritional supplements containing lutein. In this sense, only products of known and
adequate digestibility are useful as a contribution of lutein in the human diet. Moreover,
only products of known digestibility will be useful in future studies of the role of lutein in
the prevention of diseases such as ocular diseases. Thus, there are in vitro studies, which
show how fat-rich food matrices, such as olive oil and the like, can facilitate and/or benefit
the bioasimilation process of this type of carotenoids (Rangaswamy et al., 2007; Granado
et al., 2009, 2010; Nidhi and Baskaran, 2011). There are also studies of thermal
degradation of carotenoids in olive oils and the like, which can affect the physicochemical
and coloring properties of the oils and therefore their appearance and acceptability by the
consumer (Aparicio et al., 2011). In a previous patent, it has been proposed to incorporate
olive oil of different carotenoids in the use of Marigold flower (European Patent, 2006).
In this context, this Doctoral Thesis aims to obtain new functional foods based on
extra virgin olive oils, enriched in antioxidants from marine microalgae, for the prevention
of degenerative diseases associated with antioxidant deficiency.
Thus, the necessary methodology for obtaining extracts of carotenoids from the
marine microalga Scenedesmus almeriensis (a species rich in lutein and β-carotene) has
been developed, which have been used to enrich carotenoids in different types of virgin
olive oils. These oils constitute a potential medium for the incorporation of carotenoids in
the appropriate doses to the human organism, through a food so important and
characteristic of the Mediterranean.
Therefore, it is sought to provide the oils with an added value superior to that
already exists. This has been proven that the enrichment in antioxidants improves the
stability characteristics of the oils against typical variables of degradation in food, such as
the exposure to light, temperature and the passage of time.
The extra virgin olive oils enriched in carotenoids, have been characterized
physicochemically, to know all their parameters and thus to be able to evaluate the effect
of the improvement of the antioxidant fraction in them. Initially, the most suitable
Doctoral Thesis
296
10.- Summary
concentration of carotenoids to be reached in the oils tested was carried out by performing
different experiments in which the amount of extract was added progressively.
Subsequently, the oils enriched in the new antioxidants have been subjected to different
characterizations of physicochemical type to compare them with the same oils without
enriching them, which have been used as a method of control. Thus, a complete analysis
of chemical parameters has been carried out: referring to the quality of the oils (free
acidity, primary and secondary oxidation compounds, peroxide index, K232, K270, p-
anisidine, composition (profile of fatty acids, tocopherols, pigments,...) and parameters
related to bioactivity (total phenolic compounds, DPPH and ABTS). With respect to
physical type studies, monitoring has been carried out by measuring the color of oils,
which has allowed us to obtain information on the stability of the samples against the main
degradation variables discussed: time, temperature and exposure to the light. In addition,
the stability of the enriched oils has been studied as a function of the maturation index of
the fruit and its variety.
Another part of this report has been dedicated to the studies of emotions provoked
by the color of the samples and the changes of color that the oils undergo when enriched
in antioxidants. Thus, it is sought to know if these color changes are accepted and to what
extent, by potential consumers, a very important aspect if we want to address the
industrial development of the business idea based on the procurement and marketing of
these new functional foods based on olive oils.
These results support the idea of being able to use extra virgin olive oil as a means
of incorporating the necessary quantities of carotenoids into the body. Thus, giving the
olive oil an added value which is superior to the ones already available whilst at the same
time offering an alternative solution from the current ones in the fight against certain
degenerative human diseases.
Finally, it is important to highlight the applicability of the results obtained, which
would produce a line of olive oils enriched in new antioxidants that would add to both
strategies to fight human degenerative diseases, as well as in the development of the
industrial and social fabric of our environment.
Doctoral Thesis
297
10.- Summary
2.- MATERIALS AND METHODS
2.1.- Production conditions of microalgae S. almeriensis
The microalgae S. almeriensis (Figure 1) CCAP 276/24 was produced in an
industrial size outdoor tubular photo bioreactor (3.000 L), in continuous mode at 0.30
L/day dilution rate, on Almería (Spain) at spring (Figure 2). Culture medium used was
prepared on freshwater using fertilizers (NaNO3, KH2PO4, micronutrients). To avoid
contamination the culture medium was ozonized and passed by ultrafiltration up to 0.02
µm. The cultures were performed at pH=8.0 by on-demand injection of CO2, and below
30 ºC by passing thermostated water through a heat exchanger located inside the reactor.
The biomass was daily harvested by centrifugation, then being lyophilized and stored at -
18 ºC. Lyophilized biomass was used as raw material (Acién et al., 2012).
Figure 1
Images of S. almeriensis taken by optical and electronic microscope.
Doctoral Thesis
298
10.- Summary
Figure 2
Tubular photo bioreactors used for biomass production of S. almeriensis microalgae.
2.2.- Extraction methods
Lutein is currently separated and purified from marigold flowers by saponification-
extraction-recrystallization method (Morita et al., 2002). A modification of this method has
been used to recover carotenoids from lyophilized biomass of S. almeriensis (Figure 3)
(Cerón et al., 2008).
Figure 3
Lyophilized biomass of Scenedesmus almeriensis.
The Figure 4 shows the general outline of the process of extraction and
purification. First step is a cell disruption process, with alumina in a 1:1 w/w proportion,
using a beads mill (Staatlich Berlin Ku 4) at rotation speed of 120 rpm and with beads of
28 mm diameter for 5 min to remove fatty acids soaps. Second step is a saponification
Doctoral Thesis
299
10.- Summary
performed using 4% w/v KOH with a biomass concentration of 100 g/L for 5 min. Longer
alkaline treatments or the use of higher KOH concentrations reduced the yield of the
process. Finally, extraction with hexane is performed using a 1:1 ratio hexane to sample
volume, a total of three steps being performed to recover more than 90% of carotenoids
contained in the processed biomass. In each step a volume of ethanol equal to 1% of the
total volume was added for avoiding emulsion (Camacho et al., 2007). Hexane was
removed from the extract by high vacuum distillation.
Figure 4
General process for the obtaining of antioxidant extract from microalgae biomass.
2.3.- Physicochemical characterization of lutein and oils. Stability measures.
With the idea of incorporating a quantity of lutein sufficient for the prevention of
Age-related Macular Degeneration (AMD), which ranges from 3 to 6 mg/day (Jhonson-
Down et al., 2002, Krinsky et al., 2003; Silva, 2004) , oils have been prepared with lutein
concentrations of between 0.02 to 0, 16 mg/ml oil.
According to the IOC 2011, the average consumption of AOVE in Spain per day
per inhabitant is 36 ml. With the oil samples prepared in this way would give the organism
between 0.72 - 5.76 mg of lutein per day. In this sense, oils with two working
concentrations, 0.05 and 0.1 mg lutein/ml of oil, have been chosen for the studies (photo-
Doctoral Thesis
300
10.- Summary
stability and thermostability), which are within the range indicated above (0.02 - 0.16
mg/ml oil). At these concentrations, 1.8 and 3.6 mg of lutein were added to the body,
respectively, with 36 ml of daily AOVE intake. These amounts added to those ingested
with the rest of the foods in a Mediterranean diet, would allow reaching the amounts of
lutein recommended for the prevention of diseases associated with their deficit (3-6
mg/day) (Krinsky et al., 2003; Silva, 2004).
To perform the stability measurements of lutein-enriched oils, they have been
carried out using the color variations of said oils compared without adding them as a
starting control (Figure 5).
A B
Figure 5
Some of the different oils tested.
Oil control (before addition) (A), oil enriched after addition (B).
Spectrophotometric determination of color has been used to characterize and
monitor oil samples using a Konica Minolta CM-5 spectrocolorimeter connected to a
computer equipped with Spectra Magic NX PRO USB software. The equipment provides
measurements in the CIELAB color space using D65 illuminator and CIE 1931
colorimetric observer.
14 ml of oil was placed in a transparent quartz cuvette with dimensions of 4.2 x 3.2
x 1.0 cm and values of colorimetric parameters of each sample (L*, a*, b*), as well as
those corresponding to the variations thereof by comparison with the control oil (ΔL*, Δa*,
Δb* and ΔE*ab) were measured.
Doctoral Thesis
301
10.- Summary
For the photo-stability measurements, the samples were exposed continuously to
ultraviolet light in a control and color comparison booth CAC 60 Verivide (Figure 6).
Control measures were taken at time intervals distributed over two months and they were
performed at room temperature (20 ° C).
Figure 6
Samples of oils subjected to illumination in lighting control booth (right) and detail of ultraviolet light
source (left).
In the case of thermo-stability measurements of the enriched oils, the samples
were immersed in a Julabo precision thermostat, equipped with Thermal H5S liquid to be
able to work at temperatures above 100°C (Figure 7). The color measurements of the
samples were made at time intervals of about 2 to about 12 hours for a total period of time
of 74 hours, with the samples being subjected to a constant temperature of 120°C.
Figure 7
EVOO´s samples subjected to 120 ºC in a thermostatic bath (left) and thermostat detail (right).
Doctoral Thesis
302
10.- Summary
2.4.- Extra virgin olive oils
Extra virgin olive oils (EVOO´s) from different olive varieties have been used:
“Picual”, “Arbequina”, “Hojiblanca”, “Frantoio” and “Royal”. The oils have been obtained
commercially and they come mainly from the province of Jaén, although oils from the
provinces of Granada, Córdoba and Málaga have also been studied (Table 1).
In the experiments related to the influence of the index of maturation on the
stability of the oils, the oil samples were obtained in the same oil mil with the same
extraction process and the only thing that changed was the time of harvesting. Thus, olive
oil from the “Picual” variety was used in the months of October, November and December
2013.
For the experience related to the stability according to the variety of the fruit, the oil
samples were obtained in the same oil mil with the same extraction process, in the same
period of the 2013-2014 season, but using different types of fruit: “Picual”, “Arbequina”,
“Frantoio” and “Royal”.
Table 1
EVOO´s used in the enrichment experiments on lutein from the algae S. almeriensis.
Olive oil Origin Variety L* a* b*
A: Fuenroble (FR) Jaén Picual 78,8 6,9 123,1
B: Santuario de Mágina (SM) Jaén Picual 81,9 5,1 122,3
C: Oro Bailén (OB) Jaén Picual 83,7 1,8 119,2
D: Oro Génave (OG) Jaén Picual 86,4 2,6 120,5
E: Hojiblanca Málaga Hojiblanca 87,8 1,7 111,8
F: La Cántara Jaén Picual 87,5 0,3 107,9
G: Melgarejo Jaén Picual 88,8 1,3 109,0
H: Carbonell Nacional Picual 88,0 0,7 105,3
I: Garay Córdoba Arbequina 88,2 0,7 102,6
J: Baena Córdoba Picual 88,8 0,5 102,1
K: Abades Granada Picual 89,1 -0,03 102,7
L: Castillo Canena Picual (CCP) Jaén Picual 80,3 3,1 121,0
M: Castillo Canena Arbequina (CCA) Jaén Arbequina 81,7 -1,1 118,3
N: Castillo Canena Frantoio (CCF) Jaén Frantoio 86,2 3,3 116,3
P: Castillo Canena Royal (CCR) Jaén Royal 80,1 4,9 121,5
Doctoral Thesis
303
10.- Summary
2.5.- Chemical characterization of oils enriched with antioxidants
To carry out the chemical study of oils, five commercial extra-virgin olive oil
(EVOO’s) representatives from Jaén region were selected for the present study (A, B, C,
D and F). Three bottles of 750 ml of each olive oil were obtained (n=3). From each bottle,
three samples of 50 ml were constituted: control (I - olive oils without extract); olive oil with
0.1 mg of extract per ml of oil (II); and olive oil with 0.21 mg of extract per ml of oil (III). All
olive oils were filtrated in the presence of sulphate sodium anhydrous before use. Once
prepared, samples were homogenized and kept under 4 ºC prior to any analysis.
Free acidity (FA), peroxide value (PV) and coefficients of specific extinction at 232
and 270 nm (K232 and K270) were determined according to European Union standard
methods (Annexes II and IX in European Community Regulation EEC/2568/91 from 11th
July). In addition, the following parameters have also been analyzed: p-anisidine value
determination, oxidative stability, fatty acids composition, tocopherols composition and
pigments composition.
Free acidity
It has been determined by titration of the sample of oil dissolved in ethanol: ether
(1:1, v/v) using ethanolic solution from potassium hydroxide.
Peroxide value
The peroxide index value, expressed as milliequivalents of active oxygen per
kilogram of oil (mequiv/kg), was determined as follows: 3:2 (v/v) a mixture of oil and
chloroform/acetic acid was allowed to react with a saturated and dark potassium iodide
solution; the free iodide was then titrated with a solution of sodium thiosulfate.
Determination coefficients of specific extinction K232 y K270
For the determination of the extinction coefficients K232 y K270, the absorbance at
these two wavelengths of a 1% (m/v) solution in isooctane was measured using a 1 cm
quartz cuvette in a Lambda 20 spectrophotometer (Perkin Elmer).
Doctoral Thesis
304
10.- Summary
p-anisidine value determination
Unsaturated aldehydes, secondary oxidation products, were estimated by the
anisidine value (p-AV), as detailed in ISO 6885 (2006). This measurement is based on the
absorbance increase per g of oil, measured at 350 nm (Genesys 10UV), of an olive oil
solution in iso-octane, before and after reaction with p-anisidine reagent in the dark.
Oxidative stability
The oxidative stability was estimated by measuring the oxidation induction time, on
a Rancimat 743 apparatus (Metrohm CH, Switzerland). Filtered, cleaned, dried air (20 L/h)
was bubbled through the oil (3.00 g) heated at 120 ± 1.6 ºC, with the volatile compounds
being collected in water, and the increasing water conductivity continuously measured.
The time taken to reach the conductivity inflection was recorded.
Fatty acids composition
Fatty acids were evaluated as their methyl esters after cold alkaline
transesterification with methanolic potassium hydroxide solution (European Community
Regulation EEC/2568/91 from 11th July) and extraction with n-heptane. The fatty acid
profile was determined with a Chrompack CP 9001 chromatograph.
Tocopherols composition
Tocols were evaluated following the international standard ISO 9936 (2006), with
some modifications as described by Malheiro et al., (2013). Tocopherols standards (α, β,
and ) were purchased from Calbiochem (La Jolla, San Diego, CA) and Sigma (Spain),
while the internal standard 2-methyl-2-(4,8,12-trimethyltridecyl)chroman-6-ol (tocol) was
from Matreya Inc. (Pleasant Gap, PA).
Pigments composition
The extracts were prepared in accordance with Achir et al., (2010). Briefly, olive oil
samples (200 mg) were added with an appropriate amount of internal standard β-apo-
carotenal (Sigma-Aldrich), mixed with 2 ml acetone, vortexed for 10 s, and left overnight at
Doctoral Thesis
305
10.- Summary
−20 °C for triacylglycerol crystallization. Triacylglycerols were separated by rapid sampling
followed by centrifugation at 13,000 rpm.
2.6.- Color emotion studies
The amounts of carotenoids that are found in human tissues are almost exclusively
from dietary origin, mainly from fruits and vegetables, or from supplements. It has been
reported that the uptake of β-carotene reduces the risk of age-related macular
degeneration (Teikari, 1998). In addition, it has been shown that olive oil with extract from
microalgae known as Scenedesmus almeriensis brought changes in olive oils, quality,
composition, color and stability giving. Therefore, olive oil with an addition of microalgae
extract could be a good convoy to improve and enhance the intake of carotenoids in a
daily basis. Although this change in color may not change its taste or smell, the subjective
perception of these factors can change (Zellner, 2003) and color emotion techniques help
to quantify the expectation of a product when it is perceived by the human eye (Wei,
2014). As color is one of the critical factors influencing customers´satisfactory, an
understanding of color sensations is thus important in selecting a product. Color
sensations for single colors have long been studied (Sato, T. et al., 2000). It has been
analyzed how the color of extra virgin olive oils changes when we add lutein and β-
carotene enriched extract from the Scenedesmus almeriensis in order to find out how the
human has perceived this change in color by using color semantic methods (Ou, 2004).
Six samples of different extra-virgin olive oils have been selected, five of them
obtained in the same harvest season: “Fuenroble”, “Santuario de Mágina”, “Oro Bailén”,
“Castillo de Canena” and “Melgarejo 1”; and another one from the previous harvest
season “Melgarejo 2”. For each one of these samples we have prepared three different
samples by adding different concentration of extract of microalgae: 0.00 mg/ml, 0.05mg/ml
and 0.1 mg/ml.
18 samples have been used, 6 oils × 3 concentrations. Each one of the samples
was poured into bottles with dimensions of 1.5 cm x 1.5cm x 6.0 cm and a capacity of
about 20 ml (Figure 8). These bottles have rectangular prism shapes and their flat faces
allow homogenous color of the oils, making it easier for their color measurement and color
perception. All the samples were kept in a controlled environment during the entire
experiment.
Doctoral Thesis
306
10.- Summary
Figure 8
Detail of the 18 AOVE's used for visual assessment tests by potential consumers.
Color measurement of the samples has been made placing the samples in a
Verivide Portable cabinet (Verivide, Leicester, United Kingdom) using a D65 light source
simulator. The walls of the cabinets were covered by white non fluorescent paper in order
to avoid shades in the samples and have a lighter background behind the samples. The
color was measured using a Konica Minolta CS2000A spectroradiometer (Konika Minolta,
Nieuwegein, Netherlands) in the same position that the observers performed the visual
experiment (Figure 9). Tristimulus values were computed assuming CIE64 standard
observer. Three replicas of the measurements were made. (Gómez-Robledo et al., 2015).
Figure 9
Geometry of the color measurement of the samples.
Doctoral Thesis
307
10.- Summary
Different observers were asked to describe each of the samples following 9 pairs
of opposite descriptors: Aromatic-Odourless, Bitter-Sweet, Fresh-Rancid, Healthy-
Unhealthy, Like-Dislike, Natural-Artificial, Spicy-Non spicy, Tasty-Insipid and Textured-
Smooth. These 9 descriptors were obtained from 15 interviews to olive oil tasters, trying to
describe olive oil appearance in an appropriate way.
For each pair they had to choose one of the descriptors and after decide if that
descriptor described the oil as “a little”, “moderately” or “very”. For example, oil can be
described as: moderately aromatic, a little bitter, very rancid, moderately unhealthy, very
dislike, very artificial, a little tasty and very textured. Each one of the samples was shown
to each observer 3 times, in the same conditions as it was measured by the
spectroradiometer, following a random order. Each person performed the test three times
using different days and evaluating the same oils but in a different order of appearance
(Table 2).
To perform the visual assessment, the oil sample was placed in a bottle and in a
room without light. The bottle has been placed in controlled lighting cabin in front of the
person who is going to carry out the assessment, which has been indicated to observe in
the homogeneous region marked in the image shown in Figure 10.
Figure 10
Detail of the bottle used for the visual evaluation of the oils. The area that the respondent should
look at is the one marked with the circle.
Doctoral Thesis
308
10.- Summary
Table 2
Detail of the pairs of words and possibilities of evaluation of the same, in the tests of visual
appreciation of the oils.
PARAMETERS
BITTER SWEET
Appreciation Appreciation
A little Moderately A lot A little Moderately A lot
1 2 3 1 2 3
AROMATIC ODOURLESS
Appreciation Appreciation
A little Moderately A lot A little Moderately A lot
1 2 3 1 2 3
FRESH RANCID
Appreciation Appreciation
A little Moderately A lot A little Moderately A lot
1 2 3 1 2 3
HEALTHY UNHEALTHY
Appreciation Appreciation
A little Moderately A lot A little Moderately A lot
1 2 3 1 2 3
TASTY INSÍPID
Appreciation Appreciation
A little Moderately A lot A little Moderately A lot
1 2 3 1 2 3
TEXTURED SMOOTH
Appreciation Appreciation
A little Moderately A lot A little Moderately A lot
1 2 3 1 2 3
SPICY NON SPICY
Appreciation Appreciation
A little Moderately A lot A little Moderately A lot
1 2 3 1 2 3
NATURAL ARTIFICIAL
Appreciation Appreciation
A little Moderately A lot A little Moderately A lot
1 2 3 1 2 3
LIKE DISLIKE
Appreciation Appreciation
A little Moderately A lot A little Moderately A lot
1 2 3 1 2 3
Torgerson’s law of Categorical Judgement was applied to the mean of the answers
of the observers. This law allow us to create psychophysical scales where each z score
means the intensity in which a stimulus is perceived inside that emotional scale.
Doctoral Thesis
309
10.- Summary
3.- RESULTS AND DISCUSSION
3.1.- Stability based on incident radiation: photo-stability
An important parameter to evaluate in virgin olive oils is the effect produced by
exposure to electromagnetic radiation, which leads to their degradation. Photo-stability
studies were carried out using five different olive oils: four “Picual” variety: “B”, “C”, “D”
and “L”; and a fifth oil of variety “Arbequina” (oil “M”). Two different concentrations of lutein
have been tested: 0.05 and 0.1 mg/ml. In all cases the measurements were performed at
room temperature and the samples were subjected to continuous exposure to ultraviolet
light in a controlled lighting booth. The use of ultraviolet light supposes to determine the
photo stability in the less favorable conditions, since the set of radiations that come from
the sun can affect the oils, this is the most energetic and therefore the most aggressive for
the samples.
Thus, the value indicating the color variation (ΔE*ab) versus the time elapsed from
the beginning to exposure to ultraviolet light has been represented.
Figure 11
Variation of colorimetric parameters in EVOO´s. These data correspond to control oils without
enriching.
Doctoral Thesis
310
10.- Summary
Figure 11 shows the evolution in the degradation of the different oils used in the
control samples, that is, the oils without enriching in antioxidant extract. It can be seen
that the sample that is most degraded by exposure to ultraviolet light is the one
corresponding to oil "C", while the samples with the least degradation are the control
samples corresponding to oils "L" and "M". By taking a reference value, after two months,
oils “C” and “D”, are the most degraded, generating a variation of color with respect to the
initial (ΔE*ab) near 100 units (having become practically colorless). For the same period,
oils “L” and “M” generate a color change value of no more than 60 CIELAB units.
Figures 12 and 13 show the color variation of lutein-enriched oils samples to a
concentration of 0.05 and 0.1 mg/ml respectively. It can be seen that initially (first month)
the oils withstand very well to the exposure to ultraviolet light and that is from the second
month when they begin to degrade. If we compare concentrations of lutein, it is observed
that when enriching up to 0.1 mg/ml, the samples are more stable and even after two
months the degradation does not reach the 20 CIELAB units.
Figure 12
Variation of colorimetric parameters in EVOO´s. These data correspond to oils enriched in lutein at
0.05 mg/ml.
Doctoral Thesis
311
10.- Summary
Figure 13
Variation of colorimetric parameters in EVOO´s. These data correspond to oils enriched in lutein at
0.1 mg/ml.
As an example, Figures 14 and 15 show the photo-stability of the “B” and “C” oils
enriched in lutein to 0.1 mg/ml. It can be clearly seen how oil “B”, holds much better (both
in the control sample and in the enriched sample) the exposure to ultraviolet light.
Figure 14
Photo-stability of virgin olive oil "B" under controlled lighting conditions with ultraviolet lamp
enriched in lutein at 0.05 mg/ml.
Doctoral Thesis
312
10.- Summary
Figure 15
Photo-stability of virgin olive oil "C" under controlled lighting conditions with ultraviolet lamp
enriched in lutein at 0.05 mg/ml.
In all cases tested, lutein-enriched oils are more stable and better withstand the
degradation produced by exposure to ultraviolet radiation. Oils “C” and “D” degraded the
most after 2 months of exposure, and both oils generate a color difference value ΔE*ab
close to 100 units. However, in all cases, lutein-enriched oils up to a concentration of 0.1
mg/ml show color variations barely exceeding 15 units (we must remember that a value of
10 units indicates the human visual perception threshold of difference color). These
results indicate that lutein-enriched oils are more protected than controls and therefore
withstand the degradation caused by exposure to electromagnetic radiation much better.
Doctoral Thesis
313
10.- Summary
3.2.- Stability as a function of temperature: thermostability
Another important property of virgin olive oils, which deserves to be studied, is
their behaviour against temperature. It is well known that the temperature is another
variable that produces degradation in the oils and for that reason the stability of the oils
has been studied. Thus, a temperature of 120°C has been used and the oils have been
analyzed at different times subjected to that temperature value. The same oils as in the
previous photo stability section have been used and two different concentrations of lutein
(0.05 and 0.1 mg/ml) have also been tested.
Figure 16
Variation of colorimetric parameters in EVOO´s. These data correspond to the control oils without
enriching.
Figure 16 shows the color variation of the different control oils and in it can be
observed that oil “D” is the most stable, while the oil “M” is degraded.
Doctoral Thesis
314
10.- Summary
Figures 17 and 18 show the color evolution for samples enriched in lutein and in it
can be seen that there are no large differences between enrichments at 0.05 and 0.1
mg/ml respectively.
Figure 17
Variation of colorimetric parameters in EVOO´s. These data correspond to oils enriched in lutein at
0.05 mg/ml.
Figure 18
Variation of colorimetric parameters in EVOO´s. These data correspond to oils enriched in lutein at
0.1 mg/ml.
Doctoral Thesis
315
10.- Summary
If we look at the oil “L” as an example, Figures 19 and 20 show the effect of the
two concentrations tested for the same type of oil. Although 0.1 mg/ml lutein is a
concentration that protects a bit more, the color change value at 60 hours is very different
from 18 to 23 units of CIELAB color variation when using 0.05 and 0.1 mg/ml respectively.
Figure 19
Variation of colorimetric parameters in extra virgin olive oil “L” enriched in lutein at 0.05 mg/ml.
Figure 20
Variation of colorimetric parameters in extra virgin olive oil “L” enriched in lutein at 0.1 mg/ml.
Doctoral Thesis
316
10.- Summary
The results show how the control oil is thermally degraded much faster than the
same oil enriched in lutein. Thus, control oils after subjection to 120°C for 74 hours,
generate color variation values between 55-75 units, while oils enriched under the same
test conditions generate values of color variation between 18-40 units to 0.05 mg /ml and
between 14-22 units to 0.1 mg/ml.
These results again prove the protective effect that lutein added to the oil has
against exposure to high temperatures.
3.3.- Stability as a function of time: preferential consumption
Another desirable property in oils is the maintenance of their physicochemical
properties as long as possible. It is well known that for oils harvested in a particular
season, they are recommended to be consumed in the year after harvesting, because if
this period is exceeded, the essential properties of the oils could be altered. In this sense,
the stability of five different oils, without enriching and enriched in lutein at 0.05 mg/ml,
has been studied, analyzing the effects over time. For this, the tests were performed at
room temperature and under conditions of dark storage and dry environment. For
example, Figure 21 shows the results obtained for virgin olive oil "L".
Figure 21
Temporal stability virgin olive oil "L" under dry storage conditions and in darkness at room
temperature (20 ° C).
Doctoral Thesis
317
10.- Summary
This experience shows that for both, control and enriched samples, only color
variations are observed. The values obtained for oils enriched in lutein always generate
less units of color variation (ΔE*ab), which, again, shows the protector effect against the
degradation in the samples with lutein. However, it is to be hoped that differences will
appear when the time increases and the months elapsed since the elaboration begin to
have importance.
3.4.- Specific stability studies
In this section of the work, attention has been paid to the influence that the
enrichment of the new antioxidants can have on oils from different types of fruit and also
for oils that come from the same variety of fruit but with different degree of maturity.
3.4.1.- Photo-stability according to the ripeness index of the fruit
In this experiment, we have tried to analyze the influence that enrichment can have
on lutein, with oils that come from the same type of fruit and with exactly the same
elaboration (manufacturing) process. But the difference has been the use of olives with
different maturity index, that have been picked in different months, (months from October
to December 2013). Figures 22 and 23 show the stability of three oil samples ("L" type),
subjected to ultraviolet light in a lighting control booth, the difference being the month of
fruit picking.
Figure 22
Photo-stability of virgin olive oil type "L" under conditions of ultraviolet illumination, coming from
fruit with different degree of maturation.
Doctoral Thesis
318
10.- Summary
Figure 23
Photo-stability of virgin olive oil type "L" under conditions of ultraviolet illumination, from fruit with
different degree of maturation and enriched in lutein at 0.05 mg/ml.
The results obtained through this experience show that the control oil less stable is
the one corresponding to December and that the most stable oil corresponds to that
elaborated in October. Observing the behaviour of oils enriched in lutein, it can be clearly
deduced that they are much more stable than controls and that all stabilize in a similar
way, maintaining colorimetric variations always lower than 20 CIELAB units after exposure
to ultraviolet light for two months. Nevertheless, it seems that the enriched oil
corresponding to the month of December begins to have an increase in the degradation
from the first 50 days of test, compared to the other two oils used.
3.4.2.- Photo-stability depending on the variety of the fruit
Similarly, the influence of enrichment on lutein has been studied in the case of oils
from different types of olives and in which the other processing variables have remained
exactly the same. Thus, oils from four varieties of fruit have been used: “Picual”,
“Arbequina”, “Frantoio” and “Royal”.
Doctoral Thesis
319
10.- Summary
Figures 24 and 25 show the stability of three "L" type oil samples, subjected to
ultraviolet light in a lighting control booth, where the difference is in the fruit variety.
Figure 24
Photo-stability of oils (● L, ○ M, ▼ N and ΔP) under ultraviolet illumination conditions, from different
fruits.
Figure 25
Photo-stability of oils (● L, ○ M, ▼ N and ΔP) under ultraviolet illumination conditions, from
different fruits enriched in lutein at 0.05 mg/ml.
Doctoral Thesis
320
10.- Summary
The graphs of stability of the control oils show that the “Frantoio” variety is the
least stable of the tested ones and on the contrary, the most stable are “Picual” and
“Royal”. The “Arbequina” variety shows an intermediate behaviour against exposure to
ultraviolet light.
Figure 25 shows the performance of lutein-enriched oils up to 0.05 mg/ml,
indicating a very appreciable increase in stability over the same control oils. Thus, the first
50 days show data indicating that they are very stable and only from this time on the
varieties “Arbequina” and “Frantoio” initiate a slight increase in the degradation due to the
action of light.
3.4.3.- Thermostability according to the ripeness index of the fruit
To carry out this study, it has been chosen an extra virgin olive oil of the Picual
variety “L”. Three consignments of oil samples from the months of October, November
and December have been enriched. The elaboration (manufacturing) process has been
the same and therefore the only variable that makes oils different is the maturity index of
the olive used for its elaboration.
Figure 26
Variation of colorimetric parameters in Picual olive oil "L". These data correspond to control oils
with different maturity indexes.
Doctoral Thesis
321
10.- Summary
Figure 26 shows the evolution of the stability as a function of time elapsed for the
control oils subjected to 120 ºC in thermostatic bath. It can be seen that the most stable
samples are oils from olive harvested in October and therefore with a lower maturity
index. After 3 days of exposure to the temperature of 120 ºC this October oil generates a
color variation of 40 CIELAB units compared to the 53 and 55 units generated by the oils
of December and November respectively.
Figure 27
Variation of colorimetric parameters in extra virgin olive oil "L". These data correspond to oil
enriched in lutein at 0.05 mg/ml.
Figure 27 shows the stability of the same oils enriched in lutein to 0.05 mg/ml. It
can be seen that after 72 hours of thermal exposure, the values indicating the colorimetric
variation are between 10 and 20 units, much lower values than the control oils. From
these results it can be clearly deduced that antioxidant enriched oils are much more stable
to the effect of temperature than unenriched oils and that the stability is very in spite of
being the harvest month different. Therefore the index of maturity is also different.
Doctoral Thesis
322
10.- Summary
3.4.4.- Thermostability depending on the variety of the fruit
As in the previous tests, a bath temperature of 120 °C has been used and the oils
have been measured at different times from the moment they were put in the bath. In this
case, the oils used have been “L”, “M”, “N” and “P”, all of the same denomination,
elaborated following the same process and with the same treatment variables. The
difference between them is the type of fruit used to make the oil: L: Picual; M: Arbequina;
N: Frantoio and P: Royal.
Figures 28 and 29 show stability data as a function of temperature and elapsed
time for control oils and those enriched with lutein to 0.05 mg/ml. Observing Figure 28
it can be seen that the oil less stable is N (variety “Frantoio”), while the other three
varieties have a very similar stability. Similarly, Figure 29 shows that the enriched oils are
more stable than the controls ones, although the “N” variety remains the least stable
among all the enriched in lutein.
Figure 28
Variation of colorimetric parameters in EVOO´s. These data correspond to control oils without
enriching.
Doctoral Thesis
323
10.- Summary
Figure 29
Variation of colorimetric parameters in EVOO´s. These data correspond to enriched oils in lutein at
0.05 mg/ml.
It is important to point out that the other three varieties “L”, “M” and “P” are very
stable in comparison with the control oils, generating values of ΔE*ab four times inferior to
those obtained by them. We can therefore say that the enrichment in lutein produces a
very remarkable increase of stability irrespective of the variety of the fruit used in the
elaboration of the oil.
3.5.- Studies of chemical quality parameters
The quality of the olive oils was assessed to verify if the addition of S. almeriensis
extracts cause quality changes. The global observations clearly highlight that no quality
degradation is undertaken by extract addition (Table 3). Regarding FA values in four of
the five olive oils studied, no significant changes were observed. In one olive oil (olive oil
“C”), extract addition reduces the levels of free fatty acids in them, but without significant
changes between olive oils with extract. Such results are positive, since the addition of
extracts doesn’t trigger hydrolytic reactions in the olive oils, maintaining the levels of free
fatty acids.
The possible occurrence of oxidative processes in the EVOO’s was monitored by
several quality parameters (PV, K232, K270, ΔK, and p-AV) reported in Table 3. The
peroxidation of the EVOO’s is reduced by S. almeriensis extracts, since in all olive oils,
Doctoral Thesis
324
10.- Summary
except olive oil “F”, a significant decrease in PV was observed. Therefore the formation of
primary oxidation products (mainly hydroperoxides) (Laguerre et al., 2007) is inhibited,
acting the S. almeriensis extracts as antioxidants. Specific extinction coefficients at 232
and 270 nm (K232 and K270 respectively) also corroborate that extracts addition doesn’t
affect olive oils quality. In K232 and ΔK no significant changes were observed in the olive
oils, however the addition of extracts to olive oil increase significantly K270 values. K270 is
indicative of the formation of secondary products of oxidation, meanwhile, by evaluating
the values obtained in p-AV, we clearly conclude that the addition of extracts doesn’t inflict
secondary oxidation in olive oils, and those results obtained in K270 could be related to the
color conferred to olive oils by the extracts.
According to Malheiro et al., (2011) p-AV is an empirical determination used to
assess advanced oxidative rancidity of vegetable oils. The analytical method is based on
the reactiveness of the aldehyde carbonyl bond on the p-anisidine amine groups, leading
to the formation of Schiff base that absorbs at 350 nm. It allows the estimation of
secondary products of oxidation of unsaturated fatty acids, mainly dienals and 2-alkenals
(Labrinea et al., 2001). Therefore, by studying the data obtained in quality parameters
(Table 3) of the EVOO’s, it is clear that extracts addition inflicts neither primary (PV and
K232) nor secondary (p-AV) oxidative reactions.
Regarding all the values obtained in the quality parameters of the olive oils with
and without S. almeriensis extracts, all oils could be classified as EVOO’s according to the
European Community legislation (Commission Implementing Regulation (EU), nº
299/2013).
Doctoral Thesis
325
10.- Summary
Table 3
Quality parameters of oils: (FA, PV, ΔK, (ρ-AV), without enrichment (I) and enriched (II = 0.1
mg/ml, III=0.21 mg/ml).
PV
EVOO´s FA (%) K K ΔK ρ-AV
(mEq. O2/kg)
232 270
A
I 0.19±0.00 9±0 0.82±0.05 0.13±0.01 -0.003±0.001 15±1
II 0.19±0.00 6±1 0.84±0.04 0.15±0.02 -0.004±0.002 16±1
III 0.20±0.00 6±1 0.81±0.05 0.16±0.01 -0.002±0.001 16±1
B
I 0.30±0.04 9±1 0.86±0.15 0.15±0.02 -0.003±0.002 17±1
II 0.31±0.05 6±1 0.83±0.09 0.15±0.01 -0.003±0.001 16±0
III 0.30±0.04 7±2 0.94±0.12 0.19±0.03 -0.001±0.002 16±1
C
I 0.28±0.00 9±1 0.94±0.17 0.13±0.02 -0.002±0.005 12±0
II 0.19±0.00 6±1 0.86±0.18 0.12±0.01 -0.005±0.002 13±1
III 0.19±0.00 6±0 1.17±0.55 0.16±0.01 -0.003±0.004 13±1
D
I 0.28±0.00 8±1 1.00±0.07 0.13±0.02 -0.003±0.001 14±1
II 0.24±0.05 5±1 0.93±0.08 0.13±0.02 -0.009±0.017 14±1
III 0.28±0.00 5±1 1.01±0.03 0.16±0.01 -0.002±0.002 14±1
F
I 0.28±0.00 9±0 0.84±0.07 0.18±0.02 -0.001±0.003 13±1
II 0.28±0.00 8±0 0.88±0.03 0.21±0.02 -0.007±0.008 14±1
III 0.28±0.00 8±1 0.92±0.04 0.24±0.03 -0.003±0.002 13±1
According to the whole data obtained in the studied EVOO’s, it is clear that the
main changes inflicted are related to carotenoids concentration of the extracts, namely β-
carotene and lutein, as expected. Carotenoids are important components of several
biological processes in the human organism, having repercussions in human health
(Granado et al., 2003).
Doctoral Thesis
326
10.- Summary
3.6.- Studies of visual appreciation of oils. Color Emotion Studies
Figure 30 shows results corresponding to color measurements. In figure 30 we can
see that adding lutein and β-carotene produced a decrease of lightness L* and b*
coordinates and an increase of a* coordinate. In Table 4 we have summarized color
change of the oils from pure extra-virgin olive oil to oils with the 2 concentrations of
microalgae extract. Second and third columns in Table 4 indicate a high color change,
clearly perceptible by human observers with normal color vision. Last column indicates
that the color change is mainly due to a hue change. Combining data from Figure 30 and
Table 4 we can conclude that enriching the oils with lutein and β-carotene extract makes
the oils become more reddish and darker. All the oils except “Melgarejo” (the greenest oil)
undergo a color change from yellow to yellowish-orange hues.
Figure 30
Color coordinates of the samples changing the concentration of microalgae extract.
(a) Plane a*b* (black arrow indicates direction of color change when extract concentration is
increased). (b) Lightness dependence with concentration.
Doctoral Thesis
327
10.- Summary
Table 4
Mean color change from pure extra-virgin olive oils in CIELAB and CIEDE2000 units. Three last
columns show percentage of change in Lightness, Chroma and Hue in CIELAB units.
Change ΔE00 ΔEab % ΔL* % ΔC*ab % ΔH*ab
From 0.00 mg/ml to 0.05 mg/ml 10.5 18.8 12.4 10.7 76.9
From 0.00 mg/ml to 0.1 mg/ml 16.4 29.2 13.2 15.3 71.6
Results from visual experiment are summarized in Table 5. In this table we have
correlation coefficients between z scores of different emotions. We can see that there are
a high correlation between Fresh-Rancid, Healthy-Unhealthy, Like-Dislike, Natural-
Artificial and Tasty-Insipid. That means that when oil is perceived as Fresh it is perceived
also as Healthy, Natural and it is liked. This result agrees with the meaning of these
descriptors, all of them are related with preferences and can be interpreted as like-dislike.
The remaining emotions are descriptors that are related to taste and smell but for
observers who are not olive oils experts they do not give a value of preference to the oil.
Table 5
Correlation coefficient (r2) of z scores obtained from color emotion experiment. Yellow cells show
correlation coefficients greater than 0.8.
Doctoral Thesis
328
10.- Summary
Emotional responses corresponding to the pair of emotions Like-Dislike are plotted
in Figure 31, in left axis we can check the z-score and in right axis we can see the
linguistical meaning of the z-scores. The oils are perceived as less liked when the
concentration of microalgae additive increases for most of the samples, and this trend is
very similar for the emotions well correlated with Like-Dislike. If we add an additive that
makes the oil more reddish, the olive oil is perceived as less natural and it is not like.
There is only one exception, the oil “Melgarejo” follows an opposite trend to the other
samples: when the concentration of lutein and β-carotene increases, the emotion “Like”
increases. The explanation to this behaviour can be explained with color measurements
(Figure 30). This sample is the only one in which its color turns from greenish to yellower.
The rest of the samples turns into a reddish color.
Figure 31
Emotional responses for each sample in scale “Like-Dislike”. Right axis and horizontal lines shows
the linguistic term associated to each z score.
Doctoral Thesis
329
10.- Summary
4.- CONCLUSIONS
In the present work an original methodology for the extraction of lutein from the
microalgae Scenedesmus almeriensis has been developed. In addition, olive oil has been
studied as a suitable means of incorporation to ingest the necessary amounts and to
prevent the occurrence of certain degenerative human diseases, which have to do with
the deficit in our organism of this antioxidant.
It has been possible to solubilize adequate amounts of antioxidant extract in the
different EVOO's tested and the physical-chemical parameters of them which have been
studied, paying special attention to the color changes produced by the addition of the
antioxidant as a monitoring and study variable. It has proceeded to add extract of
antioxidants to different EVOO's, studying how the colorimetric parameters vary as the
concentration of lutein increases. In this sense, a lutein extract with a concentration of 2.3
mg/ml has been used, and successive additions of 100 μl have been made up in oil
concentrations of 0.16 mg/ml (174.3 mg lutein/kg oil), i.e. lutein concentrations between
22 and 87 times higher than those of olive oils not enriched in lutein (2-8 mg lutein/kg oil).
The addition of the antioxidant extract from Scendesmus almeriensis microalgae
carries significant changes in the color, quality, composition and stability of EVOO's.
The addition of extracts confers to the EVOO's more yellow-orange color, due to
the concentration of the pigments, mainly to the β-carotene.
The results obtained show that enriching the oils to a concentration of 0.1 mg
lutein/ml, obtain oils with very acceptable physicochemical and colorimetric properties.
This allows the incorporation of a good part of the daily intake of lutein (6 mg) when taking
into account the estimated average consumption of olive oil per inhabitant per day for our
country is 36 ml. In this way, it is intended to provide the EVOO's with an added value
superior to what it already has and offers a different alternative to the current ones, in the
fight against some human degenerative diseases.
The addition of S. almeriensis extract leads to significant changes in the color,
quality, composition and stability of EVOO's. The addition of extracts gives EVOO's a
more yellow-orange color due to the concentration of pigments, mainly β-carotene.
Oxidative stability has been greatly improved by the addition of the S. almeriensis extract
Doctoral Thesis
330
10.- Summary
and the shelf life of the oils has also been improved, protecting them against oxidizing
agents. The peroxidation of EVOO's is reduced as well as the formation of oxidation
products, so an improvement in the quality of these EVOO's is produced. The fatty acid
profile is not affected by the addition of extract, as well as the content of tocopherols. In
general, the addition of antioxidant extract is beneficial in discriminating the different olive
oils according to the amount of extract added. From all the results obtained, it is
concluded that the addition of 0.21 mg/ml does not contribute decisively to the quality and
composition of EVOO's compared to 0.1 mg/ml. Therefore, the concentration of 0.1 mg/ml
of S. almeriensis extract would be an optimum concentration, since all the properties and
characteristics of the original EVOO´s are conserved, while providing important doses of
bioactive compounds and one greater stability to oxidation.
The possible introduction of this type of antioxidant in olive oil would increase the
daily intake of essential carotenoids in the diet, with improved properties for the health of
consumers as it confers important nutritional assets. In addition, several tests have been
carried out in this thesis to evaluate the stability of these types of EVOO's during storage,
and stability has been studied as a function of three main variables of degradation: time,
temperature and exposure to the light.
After analysis of three of the fundamental points that relate to the physicochemical
degradation of an EVOO (stability against ultraviolet radiation, stability against
temperature and stability against time), as well as the stability of EVOO's obtained with
olives of different ripeness index and varieties, it is concluded that the addition of the
antioxidant extract from the alga Scenedesmus almeriensis to oily matrices produces a
significant improvement in its stability. That is, the stability of EVOO's enriched with
antioxidant extracts are better than that of the original matrix without additive. After
analysing the stability of EVOO's enriched with antioxidant extract against temperature,
results are obtained that could be very beneficial, multiplying the useful life of EVOO's in
some cases. In addition, one of the most suitable matrices to add extract to is the EVOO
of the "Picual" variety, while the one of the variety "Frantoio" has shown a greater
degradation. Although it increases the useful life of the oil control against the temperature,
its degradation continues being superior in relation to other EVOO's.
The results obtained are very positive, since the addition of the antioxidant extract
to the EVOO's would increase the useful life of the same ones, besides incorporating to
our diet a great amount of antioxidants beneficial for our health (which allows the
Doctoral Thesis
331
10.- Summary
prevention of the AMD, among other things) without having to alter our consumption
habits. This is because they would be incorporated in the EVOO itself, both for
consumption in crude oil (prolonging the shelf life of an EVOO so that it does not
degrade), and for its use in kitchen.
Taking into account all pairs of emotions studied, the group of accustomed
individuals has higher correlations than that of unaccustomed ones.
With regard to the pair of emotions "Aromatic-Odourless" and "Tasteless-Tasty",
there is no significant variation in the opinions of both groups when adding the antioxidant,
i.e. the trend in the two groups studied is similar.
It should also be noted that the pairs of "Rancid-Fresh", "Healthy-Unhealthy" and
"Like-Do not like" tend to be perceived in the same way in the group of habitual observers.
It is striking that observers enjoy what is considered less healthy.
The pair "Artificial-Natural" is also related to the "Like-Do not like", that is, the
population seems to associate something natural with something beneficial, and therefore,
like the consumers.
Color measurements show that adding lutein and β-carotene enriched extract from
microalga Scenedesmus almeriensis to extra virgin olive oils produces a change in color
of the oils. That makes them decrease slightly in their chroma and lightness, and
produces a high decrease from greenish or yellow to reddish. The obtained color
differences are far from a just-noticeable color difference, the change in color being clearly
perceptible by human eye.
From the studied descriptors by a color-emotion experiment some of them are
highly correlated. The meaning of these emotions can be related to the terms Like-Dislike.
From the 6 studied oils there is only one that is liked more when we add extract from
microalgae, because it changes from green to yellow.
Finally, highlighted in the case of the oil "Melgarejo", in which for most pairs of
emotions, the trend is different from the rest of oils evaluated. As the antioxidant is added,
it is perceived as fresher, healthier, more natural and granter liked by the group of people
accustomed.
Doctoral Thesis
332
10.- Summary
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Doctoral Thesis
335
11. PUBLICACIONES Y
COMUNICACIONES
11.- Publicaciones y comunicaciones
11.- PUBLICACIONES Y COMUNICACIONES
PUBLICACIONES
AUTORES: P. M. Limón; R. Gavara; F. Pina.
TÍTULO: Thermodynamics and Kinetics of Cyanidin 3-Glucoside and Caffeine
Copigments.
REF. REVISTA: Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61 (22); 5245–5251
(2013)
AUTORES: P. Limón, R. Malheiro, F.G. Acién, J.M. Fernández, S. Casal., N.
Rodrigues, R.Cruz, R. Bermejo and J. A. Pereira.
TÍTULO: Improvement of stability and carotenoids fraction of virgin olive oils by
addition of microalgae Scenedesmus almeriensis extracts.
REF. REVISTA: Food Chemistry 174; 203-211(2015).
CAPÍTULOS DE LIBRO
AUTORES: Ruperto Bermejo, Piedad Limón, José M. Fernández y F. Gabriel
Acién.
TÍTULO: Aceites de oliva virgen enriquecidos en nuevos antioxidantes
procedentes de microalgas para la prevención de enfermedades degenerativas.
REF. LIBRO: (Eds. Castillo de Canena Olive Juice S.L.) Gráficas La Paz, Jaén-
Spain (2014)
ISBN: 978-84-617-2115-3.
Tesis Doctoral
336
11.- Publicaciones y comunicaciones
COMUNICACIONES EN CONGRESOS
Autores: R. Gavara, A. M. Diniz, Y. Leydet, J. C. Lima, P. M. Limón, A. J. Parola,
V. Petrov, A. Quintas, F. Pina.
Título: Studies of self-aggregation and co-pigmentation involving anthocyanidin 3-
glucosides.
Tipo de participación: Comunicación (Póster)
Congreso: Conference: European Winter School on Physical Organic Chemistry
(e-WISPOC)
Lugar celebración: Bressanone (Italy) Fecha: 2013
Autores: R. Bermejo, P. Limón, F. Gabriel Acién, J.M. Fernández- Sevilla y M.
Melgosa.
Título: Aceites de oliva virgen enriquecidos con nuevos antioxidantes procedentes
de microalgas para prevención de enfermedades degenerativas.
Tipo de participación: Comunicación (Oral)
Congreso: XVI Scientific-Technical Symposium of olive oil (Expoliva 2013).
Lugar celebración: Jaén Fecha: 2013
Autores: R. Bermejo, P. Limón, F. Gabriel Acién, J.M. Fernández- Sevilla y M.
Melgosa.
Título: Measuring color in virgin olive oils enriched with lutein from microalgae.
Tipo de participación: Comunicación (Oral)
Congreso: X Congreso Nacional del Color.
Lugar celebración: Valencia Fecha: 2013
Tesis Doctoral
337
11.- Publicaciones y comunicaciones
Autores: R. Bermejo, P. Limón, F. Gabriel Acién, J.M. Fernández- Sevilla y M.
Melgosa.
Título: Using B-phycoerythrin from microalgae as a natural colorant to reproduce
the color in commercial strawberry yogurts.
Tipo de participación: Comunicación (Póster)
Congreso: 12th International AIC Congress 2013 (Congreso Internacional de la
Asociación Internacional del Color, AIC 2013).
Lugar celebración: Newcastle (England) Fecha: 2013
Autores: R. Bermejo, P. Limón, A. Navarro, A. Ortiz, M.P. Fernández, F. Gabriel
Acién, J.M. Fernández y M. Melgosa.
Título: Stability assessement of virgin olive oils enriched with new antioxidants
using spectrophotometric color monitorization.
Tipo de participación: Comunicación (Póster)
Congreso: XXIV Reunión Nacional de Espectroscopía. VII Congreso Ibérico de
Espectrocopía
Lugar celebración: Logroño-LaRioja (Spain) Fecha: 2014
Autores: R. Bermejo, P. Limón, R. Malheiro, J.A. Pereira, M. Melgosa y F. Gabriel
Acién.
Título: Mejora de la estabilidad y de la fracción antioxidante de aceites de oliva
virgen extra mediante la adición de extractos de carotenoides procedentes de
microalgas.
Tipo de participación: Comunicación (Póster). ISBN: 978-84-938900-5-6.
Congreso: XVII Scientific-Technical Symposium of olive oil (Expoliva 2015).
Lugar celebración: Jaén Fecha: 2015
Tesis Doctoral
338
11.- Publicaciones y comunicaciones
Autores: L. Gómez-Robledo, P. Limón, R. Bermejo y M. Melgosa.
Título: Colour emotions for antioxidant-enriched virgin olive oils
Tipo de participación: Comunicación (Oral)
Congreso: AIC2015 TOKYO Color and Image Congress (Midterm Meeting of the
International Colour Association).
Lugar celebración: Tokyo (Japón) Fecha: 2015
Tesis Doctoral
339
ARTÍCULO PUBLICADO
AUTORES: P. M. Limón, R. Gavara y F. Pina.
TÍTULO: Thermodynamics and Kinetics of Cyanidin 3-Glucoside and Caffeine
Copigments.
REF. REVISTA: Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61 (22); 5245–
5251 (2013)
Article
pubs.acs.org/JAFC
Thermodynamics and Kinetics of Cyanidin 3‑Glucoside and Caffeine
Copigments
Piedad M. Limoń,† Raquel Gavara,*,‡ and Fernando Pina*,‡
†Department of Physical and Analytical Chemistry, Jaeń University, EPS of Linares, Alfonso X El Sabio, n° 28, 23700 Linares, Jaeń,
Spain
‡REQUIMTE, Departamento de Química, Faculdade de Cien̂cias e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa, 2829-516 Monte de
Caparica, Portugal
ABSTRACT: The multiequilibrium system of reactions of cyanidin 3-glucoside at acidic and mildly acidic pH values was studied
in the presence of caffeine as a copigment. The thermodynamic and kinetic constants were determined using the so-called direct
and reverse pH jump experiments that were followed by conventional UV−vis spectroscopy or stopped flow coupled to a UV−
vis detector, depending on the rate of the monitored process. Compared with that of free anthocyanin, the copigmentation with
caffeine extends the domain of the flavylium cation up to less acidic pH values, while in a moderately acidic medium, the
quinoidal base becomes more stabilized. As a consequence, the hydration to give the colorless hemiketal is difficult over the
entire range of pH values. At pH 1, two adducts were found for the flavylium cation−caffeine interaction, with stoichiometries of
1:1 and 1:2 and association constants of 161 M−1 (K1) and 21 M
−1 (K2), respectively.
KEYWORDS: anthocyanin, cyanidin 3-glucoside, caffeine, copigmentation, color stabilization, hydration
■ INTRODUCTION On the other hand, the hemiketal (chromene) reacts via a
Anthocyanins are the ubiquitous compounds responsible for tautomeric process that leads to a ring opening with formation
most of the red and blue colors found in flowers and fruits.1 of a cis-chalcone species (Cc). This reaction usually occurs on a
subsecond to second time scale [Figure 1, tautomerization (eq
Noncovalent interactions involving the colored species related
3)].
to anthocyanins (namely, flavylium cation and quinoidal base) The hydration reaction is strongly dependent on the proton
and other natural compounds are a matter of great importance concentration, while the tautomerization is catalyzed at very
with regard to color expression in plants. Noncovalent acidic and basic pH values.12 In Figure 2, a simulation of the
interactions have been extensively studied under the category rate constant of these two kinetic processes is given. Below pH
of copigmentation.2−5 2, hydration is much faster than tautomerization and occurs on
Anthocyanins in acidic to moderately acidic solutions are a millisecond to subsecond time scale. However, at pH >2.5,
involved in a pH-dependent network of reversible reactions
6−9 hydration is usually much slower than tautomerization.(Figure 1). The flavylium cation (usually red colored) is the In conclusion, after a pH jump from a very acidic solution
only stable species under very acidic conditions, and at higher containing the flavylium cation to a moderately acidic solution,
pH values, the colorless hemiketal is the dominant species quinoidal base is formed immediately and constitutes a kinetic
together with quinoidal base (blue color), with chalcones as product (because it is usually less stable thermodynamically)
minor components. A convenient way to study the network of that slowly disappears to reach a pseudoequilibrium involving
chemical reactions involving anthocyanins and related com- all the species except the trans-chalcone.
pounds is to conduct pH jumps:10 a direct pH jump is here Finally, the thermodynamic equilibrium is attained from the
defined as a change in pH from equilibrated solutions at very cis-chalcone isomerization to give the trans-chalcone (Ct), in a
low pH values (where flavylium cation is stable) to higher pH process that in anthocyanins usually takes a few hours [Figure
values. Conversely, reverse pH jumps11 are defined as the 1, isomerization (eq 4)].
addition of acid to equilibrated solutions at higher pH values The three kinetic processes are simulated in Figure 3 for the
(typically pH 4−6) to reach a very acidic pH where flavylium is case of anthocyanins, and because of their clear separation in
stable. time, they can be studied separately, which simplifies the kinetic
When a direct pH jump is performed, the flavylium cation analysis of the system. Moreover, the change of regime in the
(AH+) transfers a proton to water, leading to a zwitterionic case of the second kinetic process is also illustrated in the
species that rearranges to the quinoidal base A [Figure 1, figure. Only at lower pH values is the tautomerization reaction
deprotonation (eq 1)]. slower than the hydration.
The flavylium cation is also involved in a parallel reaction
that is much slower than the previous one because of the Received: February 9, 2013
addition of water at position 2, giving hemiketal species B2 Revised: May 1, 2013
(which will hereafter be termed B) [Figure 1, hydration (eq Accepted: May 3, 2013
2)].a Published: May 23, 2013
© 2013 American Chemical Society 5245 dx.doi.org/10.1021/jf4006643 | J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 5245−5251
Journal of Agricultural and Food Chemistry Article
Figure 1. Network of chemical reactions of cyanidin 3-glucoside in acidic to moderately acidic solutions.
Figure 2. Simulation of the pH-dependent rate constants of hydration Figure 3. Simulation of the rate constants of the three well-separated
and tautomerization using the values reported in this paper: kh = 0.07 kinetic processes taking place in anthocyanins, first kinetics (),
s−1; k = 95 s−1 −1−h M ; kt = 0.07 s
−1; and k−t = 0.6 s
−1. Reliable acid and second kinetics (−−− and −-−), and third kinetics (···): ka = 104 s−1;
basic catalysis constants for the tautomerization reaction were k = 107.4 s−1 M−1; k = 0.07 s−1; k = 95 s−1 −1−a h −h M ; Ka = 10
−3.36; Kt =
estimated to be kH = 10 and kOH = 107 s−1 M−1, respectively. 0.09; K = 7.3 × 10−4 M−1; k = 7.4 × 10−6 s−1h i ; k−i = 2.5 × 10
−5 s−1; kt
+ k = 0.7 s−1; kH = 10 s−1 M−1; and kOH = 107 s−1−t M
−1.
In spite of numerous and well-documented works regarding
the copigmentation with anthocyanins, the effect of copigmen-
tation on the rate and equilibrium constants of the network
described above has been less studied.13,14 For this purpose, the
copigmentation involving cyanidin 3-glucoside and caffeine was
selected (Figure 4). The copigmentation effect of caffeine has
been studied for malvin13,15 and several synthetic flavylium
compounds.16−18 The main driving force for the association
seems to be π−π stacking between the chromophore and the
copigment.15 Figure 4. Chemical structures of cyanidin 3-glucoside and caffeine.
Caffeine and derivatives of cyanidin 3-glucoside are found
together in seeds of cacao19 and in the leaves of a line of red tea interesting to know how its presence can affect the reactivity of
recently developed by natural crossing.20 Additionally, caffeine anthocyanins, usually employed as food colorants. Recently, we
is a common food additive, and from this point of view, it is reported on the effect of self-aggregation on the thermody-
5246 dx.doi.org/10.1021/jf4006643 | J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 5245−5251
Journal of Agricultural and Food Chemistry Article
Figure 5. (A) Spectral variations upon addition of caffeine to cyanidin 3-glucoside (2.3 × 10−5 M) at pH 1.0. The spectra correspond to 0, 0.002,
0.006, 0.02, 0.04, 0.06, and 0.08 M caffeine. The spectra for 0 and 0.08 M caffeine are shown as bold lines. (B) Mathematical treatment of the data in
panel A allowed us to obtain the pure spectra corresponding to the 1:1 (−−−) and 1:2 (···) flavylium cation−caffeine adducts. The spectrum of free
anthocyanin is plotted as a solid line. The inset shows the molar fractions of the adducts and free anthocyanin as a function of caffeine concentration.
namics and kinetics of the six most common anthocyanidin 3- The 1:1 stoichiometry has been proposed for a number of
glucosides, including cyanidin 3-glucoside.11 In this work, we flavylium cation−copigment complexes, usually resulting, like
report for the first time an extensive study of the effect of here, in a bathochromic shift and a small decrease in the molar
caffeine copigmentation on the thermodynamics and kinetics of extinction coefficient.18,23−25 The formation of a second
the network of chemical reactions of cyanidin 3-glucoside in complex with a 1:2 stoichiometry has been less reported. In
diluted solutions, where self-aggregation effects can be this case, we have to take into account the possibility that the
neglected. formation of this complex will vary, depending on the chemical
structure of anthocyanin and copigment as well as the
■ MATERIALS AND METHODS anthocyanin:copigment molar ratio, among other factors.18
Cyanidin 3-glucoside chloride (Kuromanin chloride) was purchased Several years ago, the formation of the 1:2 complex was
from Extrasynthese; caffeine was purchased from Merck. All the proposed for the 4-methyl-7-hydroxyflavylium−caffeine and 4′-
reagents (≥96%) were used without any further purification. The hydroxyflavylium−caffeine systems at high copigment concen-
solutions were prepared in Millipore water. The pH of the solutions trations, but in both cases, the complexation to additional
was adjusted by the addition of HCl, NaOH, and 8.3 × 10−3 M citrate caffeine induced a greater decrease in the molar extinction
buffer and was measured on a CRISON pH-Meter BASIC 20+ coefficient. Here the effect is different; i.e., the formation of the
instrument. The ionic strength of the solutions was kept constant at
− second adduct provokes the increase in the molar extinction0.1 M by the addition of NaCl. UV vis absorption spectra were
recorded on Varian Cary 100 Bio and Varian Cary 5000 coefficient. For some reason (outside the scope of this work),
spectrophotometers. The stopped flow experiments were conducted the interaction with more caffeine increases the value of the
in an Applied Photophysics SX20 stopped flow spectrometer provided oscillator strength related to the electronic transition (or
with a PDA.1/UV photodiode array detector with a minimum scan transitions) responsible for the absorption band.
time of 0.65 ms and a wavelength range of 200−735 nm. Inspection of the inset in Figure 5B shows that
concentrations of caffeine higher than the respective solubility
■ RESULTS AND DISCUSSION limit would be necessary to obtain the 1:2 adduct as the only
In Figure 5A, the spectral variations observed upon addition of species. However, for 0.08 M caffeine, practically all the
increasing concentrations of caffeine (up to 0.08 M) to a anthocyanin interacts with the copigment through the 1:1
diluted solution of cyanidin 3-glucoside (2.3 × 10−5 M) at pH 1 (36%) and 1:2 (61%) adducts, and we selected this ratio of
−5
are shown. For lower caffeine concentrations, the absorption concentrations, i.e., 0.08 M caffeine versus 2 × 10 M cyanidin
red shifts and slightly decreases and an isosbestic point at 521 3-glucoside, to analyze the effect of copigmentation on the
nm is observed; for higher caffeine concentrations, the thermodynamics and kinetics related to the network of
absorption shifts to higher wavelengths and gives rise to a chemical reactions of the anthocyanin (Table 1).
small absorption increase and the isosbestic point at 521 nm The pH dependence of the absorption spectra of thermally
disappears, with a new one appearing at 534 nm. At pH 1, the equilibrated solutions of cyanidin 3-glucoside 1.7 × 10
−5 M in
flavylium cation is the only species present in solution in the the presence of caffeine 0.08 M is shown in Figure 6A. Here, K’a
case of the anthocyanin; thus, these spectral changes suggest is the global acid−base equilibrium constant that relates the
26
the formation of two adducts involving the flavylium cation of flavylium cation with the other species in the network (eq 5):
cyanidin 3-glucoside and caffeine, probably with flavylium +
cation:caffeine stoichiometries of 1:1 and 1:2. Mathematical AH + H2O ⇌ A + B Ka′ = Ka + Kh + KhK t
treatment of the system21,22 assuming these stoichiometries + Cc + Ct + H3O
+ + KhK tK i (5)
allowed us to obtain the absorption spectra of the two adducts,
as well as the respective association constants, as shown in When these spectra are compared with the absorption spectra
Figure 5B. of cyanidin 3-glucoside in the absence of caffeine (Figure 6B),11
5247 dx.doi.org/10.1021/jf4006643 | J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 5245−5251
Journal of Agricultural and Food Chemistry Article
Table 1. Thermodynamic Constants of 1.7 × 10−5 M [H+] 1 +
Cyanidin 3-Glucoside in the Presence and Absence of 0.08 k2nd(hydration control) = + kh + k−h[H ][H ] + K 1 + K
M Caffeine a t
(7)
caffeine pKa K (M
−1
h ) Kt K
b
i pKa′ The slower process in Figure 6A corresponds to the
0.08 Ma 3.3(6) 7.4 × 10−4 0.09 0.3 2.9 isomerization to give Ct, and its rate depends on the mole
−c 3.8(0) 3.1 × 10−3 0.12 − 2.5 fraction of Cc in the pseudoequilibium involving A, AH+, B, and
a 9Estimated error for all constants except Ki, 15%.
bThe percentage of Cc (eq 8).
Ct is ≈2%, and the reported value is a rough estimate. cSee ref 11. K K
There the reported concentration of anthocyanin was 2 × 10−5 M. k = h t3rd × k + k[H+] + Ka + Kh(1 + K )
i −i
t (8)
Because the mole fraction of Ct is very small in anthocyanins
it is clear that the copigment stabilizes the flavylium cation, (<5%), the latest process is difficult to observe and quantify
because its adduct becomes less acidic (pKa′ higher), as well as
precisely.
In Figure 7B, the absorption spectra of the quinoidal base
the quinoidal base, because a significant amount of this species (taken immediately after the direct pH jump to pH ≫ pK ) is
is presented for less acidic solutions. acompared with that corresponding to cyanidin 3-glucoside in
In Figure 7A, the kinetic process with a direct pH jump from
−5 the absence of caffeine.
11 As in the case of the flavylium cation,
1 to 5.8 for 1.7 × 10 M cyanidin 3-glucoside and 0.08 M the copigmentation with caffeine gives rise to a red shift in the
caffeine is shown. Immediately after the pH jump, the absorption spectra, indicating that the excited state of the
characteristic absorption spectrum of the quinoidal base anthocyanin is more stabilized than the ground state.
appears. This process corresponds to the proton transfer The data reported in the inset of Figure 7A allow us to
reaction, and its rate that occurs on the microsecond time scale estimate the equilibrium constant Ka from eq 9,
27 where the
is too fast to be followed by the common techniques, including initial absorbance is due to the complete conversion of the total
stopped ow6fl (eq 6). concentration of the anthocyanin (previously in the form of
flavylium cation) to quinoidal base and the final absorbance is
k = k + k [H+1st a −a ] (6) caused by the quinoidal base remaining at the equilibrium; from
the inset of Figure 7A, 35% of quinoidal base remains at
The observed decrease in the quinoidal base absorption is equilibrium (1.7 × 10−5 M cyanidin 3-glucoside and 0.08 M
biexponential, the faster process corresponding to the hydration caffeine). From eq 9 and using a K −2.9a′ value of 10 , a Ka value
control (eq 7).9 In other words, because we are in a range of of 10−3.36 is obtained.
pH values above 2.5, the hemiketal B equilibrates faster with cis- A K
chalcone than flavylium cation and hemiketal (faster tautome- f = a
rization) and the term 1/(1 + K ) corresponds to the mole A i Ka′ (9)t
fraction of B in equilibrium wtih Cc. Moreover, as reported by Several pH jumps like that shown in Figure 7A were performed
Brouillard and Dubois,6 the quinoidal base does not give at different final pH values. The faster rate constant of the
directly the hemiketal at moderately acidic and neutral pH biexponential process (hydration) is plotted versus pH in
values; in fact, only the fraction of flavylium cation available Figure 8 (●) and was fit using eq 7 (−−−) (see below).
from the initial (faster) equilibrium with quinoidal base leads to The reverse pH jumps give complementary information
hemiketal. This observation is included in eq 7 by the term about the system. In Figure 9, acid was added to equilibrated
[H+]/([H+] + Ka), corresponding to the mole fraction of the solutions at pH 5.7 to yield a final pH of 1.3, and the spectral
flavylium cation. variations were followed by stopped flow (Figure 9A). In this
Figure 6. (A) pH-dependent absorption spectra of thermally equilibrated solutions of 1.7 × 10−5 M cyanidin 3-glucoside and 0.08 M caffeine. (B)
Same in the absence of caffeine [2 × 10−5 M (see ref 11)].
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Journal of Agricultural and Food Chemistry Article
Figure 7. (A) Spectral variations upon a pH jump from 1.0 to 5.8, with 1.7 × 10−5 M cyanidin 3-glucoside and 0.08 M caffeine. (B) Normalized
spectra of the cyanidin 3-glucoside quinoidal base in the presence of caffeine obtained immediately after the pH jump (−−−) and analogous spectra
of cyanidin 3-glucoside in the absence of caffeine for comparison (see ref 11).
and the hydroxyl concentration was very low for detection of
the second.
The amplitudes of the three processes are reported in Figure
9B and give
= %CcK t %B (12)
and
Ka = %A
Kh %B (13)
From the percentages shown in Figure 9B, Kt = 0.09 and Kh =
6.3 × 10−4 M−1. The kinetic constants of the reverse pH jumps
fit with eq 10 are shown in Figure 8 (○).
Knowing Kt and Ka, we can conduct a global fitting of the
kinetic data reported in Figure 8 with eqs 7 and 10, leading to a
kh of 0.07 s
−1 and a k−h of 95 M
−1 s−1. The ratio between the
Figure 8. pH dependence of the direct (●) and reverse (○) pH jumps hydration and dehydration rate constants gives a Kh of 7.4 ×
of 1.7 × 10−5 M cyanidin 3-glucoside, in the presence of 0.08 M 10−4 M−1 , in good agreement with the value calculated from thecaffeine. Fitting was achieved by eq 7 (−−−) and eq 10 ( ); a point reverse pH jumps (see above). It is worth noting that the
regarding the kinetics of the complexation of cyanidin 3-glucoside at similarity of eq 7 with eq 10 results from the low value of K in
pH 5.7 is included (□). tthis system. Finally, the slower kinetic process in Figure 9B
corresponds to a rate constant k of 0.7 s−1−t , permitting us to
case (low pH value), hydration becomes faster than calculate a kt of 0.06 s
−1 from the respective equilibrium
tautomerization. The quinoidal base present at pH 5.7 was constant.
immediately converted into flavylium cation, a process that To corroborate the interpretation of the copigmentation
took place during the mixing time of the stopped flow. This phenomenon, an equilibrated solution of cyanidin 3-glucoside
reaction was followed by the formation of more flavylium at pH 5.7 was mixed with caffeine at the same pH value (final
cation through a biexponential process: the first corresponding concentrations of 1.7 × 10−5 and 0.08 M, respectively) and the
to the formation of flavylium cation from the hemiketal present spectral variations were monitored (Figure 10). An increase in
in the equilibrium at pH 5.7 (eq 10) and the last to the the level of the caffeine−quinoidal base adduct is clearly
conversion of Cc into flavylium cation via hemiketal (eq 11). In observed. It is worth noting the rate of the kinetic process
this kind of experiment, no reversibility is expected from B to
28 shown in Figure 10, which fits with the hydration−dehydrationgive Cc. kinetic process presented in the inset of Figure 8 (□).
[H+] + In summary, the spectral changes upon addition of caffeinekobs1(SF) = kK + [H+] h
+ k−h[H ] to cyanidin 3-glucoside show clearly the interaction of the
a (10) copigment with the flavylium cation as well as with quinoidal
k base. The mole fraction distribution of the species of theobs2(SF) = k−t (11)
flavylium network in the absence11 and presence of caffeine
In eq 11, neither acidic nor basic catalysis was considered for 0.08 M is represented in Figure 11. The domain of the
the reverse tautomerization reaction,12 because at this pH the flavylium cation is extended by addition of caffeine as a result of
proton concentration was low for the observation of the first the stabilization of this species, while at moderately acidic pH
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Journal of Agricultural and Food Chemistry Article
Figure 9. (A) Reverse pH jump from an equilibrated solution of 1.7 × 10−5 M cyanidin 3-glucoside at pH 5.7 in the presence of 0.08 M caffeine to a
final pH of 1.3, followed by stopped flow. (B) Trace of the kinetics monitored at 535 nm.
Figure 11. Comparison between the mole fraction distribution of
Figure 10. Spectral variations upon addition of caffeine to an cyanidin 3-glucoside in the absence11 () and presence of 0.08 M
equilibrated solution of cyanidin 3-glucoside at pH 5.7. Final
−5 caffeine (−−−). In this figure, the terms AH
+Caf, BCaf, ACaf, and
concentrations of 0.08 M caffeine and 1.7 × 10 M cyanidin 3- CcCaf refer to the molar fractions of AH+, B, A, and Cc, respectively,
glucoside. in the presence of caffeine.
Table 2. Kinetic Constants of 1.7 × 10−5 M Cyanidin 3-
values, the level of the quinoidal base−caffeine adduct increases Glucoside in the Presence and Absence of 0.08 M Caffeine
at the expense of the hemiketal.
With regard to the kinetic constants, the most interesting k−h k−−h kt k−tcaffeine (s 1) (M 1 s−1) (s−1) (s−1) k (s−1)b k (s−1)bi −i
result is the increase in the dehydration rate constant (k−h) for
− 0.08 0.07 95 0.06 0.7 7.4 × 10
−6 2.5 × 10−5
the anthocyanin caffeine system (Table 2). Somehow, the Ma
presence of the copigment facilitates the reaction of the −c 0.11 35 0.07 0.6 − −
hemiketal to give the flavylium cation. Analogous behavior was aEstimated error for all constants except the isomerization constants,
previously observed in the case of the self-aggregation of 15%. bThe percentage of Ct is ≈2%, and the reported value is a rough
anthocyanins (i.e., dehydration is facilitated in more concen- estimate. cSee ref 11. There the reported concentration of anthocyanin
trated and/or aggregated solutions).11 was 2 × 10−5 M.
In conclusion, copigmentation results in the stabilization of
the colored flavylium cation and quinoidal base species, making
the hydration to give the colorless hemiketal more difficult. The with suitable species are needed to stabilize the quinoidal base
interaction of the anthocyanin with caffeine mimics in some and obtain blue colors.
way what happens in Nature. The flavylium cation is only stable
at very acidic pH values, and as a consequence, to achieve the ■ AUTHOR INFORMATION
red color inside the vacuoles of the plants (roughly in the pH Corresponding Author
interval of 3−6), it is necessary to increase the pH domain of *R.G.: phone, +351212948300, ext . 10946; fax ,
the flavylium cation. On the other hand, at higher pH values, +351212948550; e-mail, r.castell@fct.unl.pt. F.P.: phone,
the quinoidal base is a very minor species, and thus, interactions +351212948355; fax, +351212948550; e-mail, fp@fct.unl.pt.
5250 dx.doi.org/10.1021/jf4006643 | J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 5245−5251
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Funding (16) Wigand, M. C.; Dangles, O.; Brouillard, R. Complexation of a
This work was supported by Fundaca̧õ para a Cien̂cia e fluorescent anthocyanin with purines and polyphenols. Phytochemistry
Tecnologia through Projects PEst-C/EQB/LA0006/2011 and 1992, 31, 4317−4324.
PTDC/QUI-QUI/117996/2010. Postdoctoral Grant SFRH/ (17) El Hajji, H.; Dangles, O.; Figueiredo, P.; Brouillard, R. 3′-(β-D-Glycopyranosyloxy)flavylium ions: Synthesis and investigation of their
BPD/44639/2008 (R.G.) is also acknowledged. properties in aqueous solution. Hydrogen bonding as a mean of colour
Notes variation. Helv. Chim. Acta 1997, 80, 398−413.
The authors declare no competing nancial interest. (18) Pina, F. Caffeine interaction with synthetic flavylium salts. Afi
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lium. J. Photochem. Photobiol., A 1998, 115, 51−59.
■ ADDITIONAL NOTE (19) Pereira-Caro, G.; Borges, G.; Nagai, C.; Jackson, M. C.; Yokota,
aThis nomenclature is due to the fact that in several systems it T.; Crozier, A.; Ashihara, H. Profiles of Phenolic Compounds and
Purine Alkaloids during the Development of Seeds of Theobroma cacao
is possible to observe the formation of a second hemiketal, from cv. Trinitario. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 427−434.
the addition of water to position 4, which is termed B4. (20) Maeda-Yamamoto, M.; Saito, T.; Nesumi, A.; Tokuda, Y.; Ema,
However, this reaction is negligible for the system being studied K.; Honma, D.; Ogino, A.; Monobe, M.; Murakami, A.; Murakami, A.;
here. Tachibana, H. Chemical analysis and acetylcholinesterase inhibitory
effect of anthocyanin-rich red leaf tea (cv. Sunrouge). J. Sci. Food Agric.
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5251 dx.doi.org/10.1021/jf4006643 | J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 5245−5251
ARTÍCULO PUBLICADO
AUTORES: P. Limón, R. Malheiro, F.G. Acién, J.M. Fernández, S. Casal., N.
Rodrigues, R.Cruz, R. Bermejo and J. A. Pereira.
TÍTULO: Improvement of stability and carotenoids fraction of virgin olive oils by
addition of microalgae Scenedesmus almeriensis extracts.
REF. REVISTA: Food Chemistry 174; 203-211(2015).
Food Chemistry 175 (2015) 203–211
Contents lists available at ScienceDirect
Food Chemistry
journal homepage: www.elsevier .com/locate / foodchem
Improvement of stability and carotenoids fraction of virgin olive oils
by addition of microalgae Scenedesmus almeriensis extracts
Piedad Limón a, Ricardo Malheiro b,c, Susana Casal c, F. Gabriel Acién-Fernández d,
José Mª Fernández-Sevilla d, Nuno Rodrigues b, Rebeca Cruz c, Ruperto Bermejo a,⇑,
José Alberto Pereira b,⇑
aDepartment of Physical and Analytical Chemistry, Jaén University, Linares High Polytechnic School (EPSL), 23700 Linares, Spain
bMountain Research Centre (CIMO), School of Agriculture, Polytechnic Institute of Braganca, Campus de Santa Apolónia, Braganca, Portugal
cREQUIMTE/Laboratório de Bromatologia e Hidrologia, Faculdade de Farmácia, Universidade do Porto, Rua de Jorge Viterbo Ferreira, 228, 4050-313 Porto, Portugal
dDepartament of Chemical Engineering, Almeria University, E-04071 Almeria, Spain
a r t i c l e i n f o a b s t r a c t
Article history: Humans are not capable of synthesizing carotenoids de novo and thus, their presence in human tissues is
Received 8 May 2014 entirely of dietary origin. Consumption of essential carotenoids is reduced due to the lower intake of
Received in revised form 25 October 2014 fruits and vegetables. Microalgae are a good source of carotenoids that can be exploited. In the present
Accepted 29 October 2014 work, carotenoids rich extracts from Scenedesmus almeriensis were added to extra-virgin olive oils at
Available online 28 November 2014
different concentrations (0.1 and 0.21 mg/mL) in order to enhance the consumption of these bioactives.
Extracts brought changes in olive oils color, turning them orange-reddish. Quality of olive oils was
Keywords: improved, since peroxidation was inhibited. Olive oils fatty acids and tocopherols were not affected.
Carotenoids
Virgin olive oil b-carotene and lutein contents increase considerably, as well as oxidative stability, improving olive oils
Microalgae shelf-life and nutritional value.
Scenedesmus almeriensis Inclusion of S. almeriensis extracts is a good strategy to improve and enhance the consumption of
Nutrition carotenoids, since olive oil consumption is increasing.
2014 Elsevier Ltd. All rights reserved.
1. Introduction With a reduced consumption of fruits and vegetables several
bioactive food components are not ingested in a correct dose, hav-
Nowadays fruits and vegetables consumption worldwide is a ing repercussions at human organism (Duyn & Pivonka, 2000).
pressing concern. According to Pomerleau, Lock, Knai, and McKee Fruits and vegetable consumption reduce the prevalence of cancer
(2004), in 2000 2.7 million deaths occurred worldwide in 2000 (Block, Patterson, & Subar, 1992) and the risk of cardiovascular dis-
and 1.8% of total global disease burden were attributed to the eases (Veer, Jansen, Klerk, & Kok, 2000). Among the most important
low fruit and vegetable consumption. Furthermore, low intake of bioactive components are the carotenoids (Gaziano et al., 1995).
fruits and vegetables is estimated to cause around 14% of gastroin- Carotenoids are important components of several biological pro-
testinal cancer deaths, about 11% of ischaemic heart disease deaths cesses in the human organism, having repercussions in human
and about 9% of stroke deaths worldwide (World Health health (Granado, Olmedilla, & Blanco, 2003). The amounts of
organization, 2014). Around the world the intake of fruits and veg- carotenoids that are found in human tissues are almost exclusively
etables is not sufficient, with a particular attention to adolescents from dietary origin, mainly from fruits and vegetables, or from
and children, specially boys and adult males, being this point high- supplements.
lighted by several international organisms and authorities: Organi- Two of more relevant carotenoids are b-carotene and lutein.
sation for Economic Co-operation and Development (OECD, 2013); b-carotene is a carotenoid that has been used both as a food color-
European Food Information Council (EUFIC, 2012); Centers for ing agent and as a source of vitamin A in animal feed. In addition
Disease Control and Prevention (CDC, 2013). b-carotene has been used to treat disorders such as asthma and
erythropoietic protoporphyria, and to reduce the risk of several
cancers as breast and lung cancer in addition to cardiovascular
⇑ Corresponding authors. Tel.: +34 953 64 8513; fax: +34 953 64 85 06 disease (Omenn et al., 1996). It has been also reported that
(R. Bermejo). Tel.: +351 273 30 3277; fax: +351 273 325405 (J.A. Pereira). the uptake of b-carotene reduce the risk of age-related macular
E-mail addresses: rbermejo@ujaen.es (R. Bermejo), jpereira@ipb.pt (J.A. Pereira).
http://dx.doi.org/10.1016/j.foodchem.2014.10.150
0308-8146/ 2014 Elsevier Ltd. All rights reserved.
204 P. Limón et al. / Food Chemistry 175 (2015) 203–211
degeneration (AMD) (Teikari et al., 1998). b-carotene can be found of 28 mm diameter for 5 min to remove fatty acids soaps. Second
in vegetables as carrots, pumpkins and sweet potatoes that colors step is a saponification performed using 4% w/v KOH with a
them orange, although it can be also produced from Dunaliella sp., biomass concentration of 100 g/L for 5 min. Longer alkaline treat-
a hypersaline microalgae produced in open raceways. ments or the use of higher KOH concentrations reduced the yield
Lutein is a xantophyll compound with antioxidant activity and of the process. Finally, extraction with hexane is performed using
recommended to prevent some types of cancer (Nishino, 1998), a 1:1 ratio hexane to sample volume, a total of three steps being
as well as cardiovascular (Peterson, Dwyer, Jacques, & performed to recover more than 90% of carotenoids contained in
McCullough, 2012) and retinal diseases (Ozawa et al., 2012). The the processed biomass. In each step a volume of ethanol equal to
estimated lutein daily uptake of 1.5 mg day1 by eating fruits 1% of the total volume was added for avoiding emulsion
and vegetables is not enough to reach the recommended daily (Camacho et al., 2007). Hexane was removed from the extract by
uptake of 6 mg day1 (Seddon et al., 1994), then the recommenda- high vacuum distillation.
tion to consume lutein supplements. Lutein is commercially pro-
duced from marigold (Tagetes erecta L.), but the lutein content of 2.3. Olive oils sampling and extract addition
marigold flowers is very low, of 0.03% (dry weight; d.w.), whereas
microalgae as Muriellopsis sp., Chlorella sp. and Scenedesmus sp. can Five commercial extra-virgin olive oils (EVOO’s) representative
contain large amounts of this compound, up to 0.90% d.w. (García- from Jaén region were selected for the present study (from A to E).
González, Moreno, Manzano, Florencio, & Guerrero, 2005; Yen, Sun, Three bottles of 750 mL of each olive oil were obtained (n = 3).
& Ma, 2011). The production of lutein from a new lutein-rich mic- From each bottle, three samples of 50 mL were constituted: control
roalgae strain, Scenedesmus almeriensis, has been already patented. (I – olive oils without extract); olive oil with 0.1 mg of extract per
S. almeriensis can contain up to 1.5% d.w. of lutein together with mL of oil (II); and olive oil with 0.21 mg of extract per mL of oil (III).
other carotenoids as b-carotene and can be produced with high All olive oils were filtrated in the presence of sulfate sodium anhy-
productivity in closed tubular photobioreactors, in continuous drous before use. Once prepared, samples were homogenized and
mode at large scale, thus being a continuous and reliable source kept under 4 C prior to any analysis.
of lutein (Fernández-Sevilla, Acién Fernández, & Molina-Grima,
2010; Sánchez et al., 2008a,b). 2.4. Physical and quality parameters evaluated
Contrasting with the reduced consumption of fruits and vegeta-
bles is the olive oil consumption. This premium vegetable oil is 2.4.1. Color determination
steadily increasing production and consumption worldwide over Color of olive oils with and without extract addition was
the last years (IOC, 2013a,b). Therefore, olive oil could be a good measured with a Konica Minolta model CR-400 colorimeter. Color
convoy to improve and enhance the intake of carotenoids in a daily differences (DE) between control samples considered as standard
basis. In this sense, in the present work, the main goals were to (olive oils without extract) and oils with extract addition were cal-
study the effects of the addition of different concentrations of culated from the determined monochromatic variables L⁄, a⁄, and
S. almeriensis carotenoids rich extracts to extra-virgin olive oils. b⁄ obtained from CIELAB method, as well as yellowness index
The olive oils were evaluated for color and quality attributes, com- (YI) as described by Zamora, Olmo, Navarro, and Hidalgo (2004):
position (fatty acids profile, tocopherols, pigments), and oxidative h i1=2
stability in order to support their efficiency as antioxidants while DE ¼ ðDLÞ2 þ ðDaÞ2 þ ðDbÞ2
characterizing the changes induced in the olive oil legislated
parameters.
¼ 142:86 b
YI
L
2. Materials and methods L⁄ is a measure of luminance or lightness component, which ranges
from 0 to 100 (black to white); a⁄ ranges from negative to positive
2.1. Production conditions of microalgae S. almeriensis (green to red); and b⁄ also ranges from negative to positive (blue to
yellow).
The microalgae S. almeriensis CCAP 276/24 was produced in an
industrial size outdoor tubular photobioreactor (3.000 L), in con- 2.4.2. Quality parameters determination
tinuous mode at 0.30 L/day dilution rate, on Almería (Spain) at Free acidity (FA), peroxide value (PV) and coefficients of specific
spring. Culture medium used was prepared on freshwater using extinction at 232 and 270 nm (K232 and K270) were determined
fertilizers (NaNO3, KH2PO4, micronutrients). To avoid contamina- according to European Union standard methods (Annexes II and
tion the culture mediumwas ozonised and passed by ultrafiltration IX in European Community Regulation EEC/2568/91 from 11th
up to 0.02 lm. The cultures were performed at pH = 8.0 by on- July).
demand injection of CO2, and below 30 C by passing thermostated
water through a heat exchanger located inside the reactor. The bio- 2.5. p-Anisidine value determination
mass was daily harvested by centrifugation, then being lyophilised
and stored at 18 C. Lyophilised biomass was used as raw mate- Unsaturated aldehydes, secondary oxidation products, were
rial (Acién, Fernández-Sevilla, Magán, & Molina-Grima, 2012). estimated by the anisidine value (p-AV), as detailed in ISO 6885
(2006). This measurement is based on the absorbance increase
2.2. Extraction methods per g of oil, measured at 350 nm (Genesys 10UV), of an olive oil
solution in iso-octane, before and after reaction with p-anisidine
Lutein is currently separated and purified from marigold flow- reagent in the dark.
ers by saponification–extraction–recrystallization method
(Morita, Watanabe, & Saiki, 2002). A modification of this method 2.6. Oxidative stability
has been used to recover carotenoids from lyophilized biomass of
S. almeriensis (Cerón et al., 2008). First step is a cell disruption The oxidative stability was estimated by measuring the oxida-
process, with alumina in a 1:1 w/w proportion, using a beads mill tion induction time, on a Rancimat 743 apparatus (Metrohm CH,
(Staatlich Berlin Ku 4) at rotation speed of 120 rpm and with beads Switzerland). Filtered, cleaned, dried air (20 L/h) was bubbled
P. Limón et al. / Food Chemistry 175 (2015) 203–211 205
through the oil (3.00 g) heated at 120 ± 1.6 C, with the volatile 13,000 rpm. These steps were omitted in the S. almeriensis extract
compounds being collected in water, and the increasing water con- analysis, being directly diluted in acetone after internal standard
ductivity continuously measured. The time taken to reach the con- addition. The extract was directly injected into the HPLC column,
ductivity inflection was recorded. a Phenomenex Luna C18 (250 3.5 mm internal diameter) at
23 C and eluted with a 30-min linear gradient from 80% aqueous
2.7. Fatty acids composition methanol (v/v) containing 0.05% triethylamine and 20% ethyl ace-
tate (containing 0.05% triethylamine) at 1 mL/min. The analysis
Fatty acids were evaluated as their methyl esters after cold was performed on the same HPLC equipment described for the
alkaline transesterification with methanolic potassium hydroxide tocols, except for the use of a DAD detector (JASCO MD-2015-Plus,
solution (European Community Regulation EEC/2568/91 from Japan). Lutein and b-carotene were obtained from Sigma. Calibra-
11th July) and extraction with n-heptane. The fatty acid profile tion curves were constructed at 440 nm for lutein and b-carotene
was determined with a Chrompack CP 9001 chromatograph against the internal standard.
equipped with a split–splitless injector, a FID detector, an autosam-
pler Chrompack CP-9050 and a 50 m 0.25 mm i.d. fused silica 2.10. Statistical analysis
capillary column coated with a 0.19 l film of CP-Sil 88 (Varian).
Helium was used as carrier gas at an internal pressure of 110 kPa. 2.10.1. Analysis of variance
The temperatures of the detector and injector were 250 and An analysis of variance (ANOVA) with Type III sums of squares
230 C, respectively. The oven temperature was programmed at was performed using the GLM (General Linear Model procedure) of
120 C during the first 3 min with an increase of 4 C/min until the SPSS software, version 21.0 (IBM Corporation, New York,
220 C. The split ratio was 1:50 and the injected volume was of U.S.A.). The fulfilment of the ANOVA requirements, namely the nor-
1 lL. The results are expressed in relative percentage of each fatty mal distribution of the residuals and the homogeneity of variance,
acid, calculated by internal normalization of the chromatographic were evaluated by means of the Kolmogorov–Smirnov with Lillief-
peak area eluting between myristic and lignoceric methyl esters. ors correction (if n > 50) or the Shapiro–Wilk’s test (if n < 50), and
A control sample (olive oil 47118, Supelco) and a fatty acids methyl the Levene’s tests, respectively. All dependent variables were ana-
esters standard mixture (Supelco 37 FAME Mix) was used for lyzed using a one-way ANOVA with or without Welch correction,
identification and calibration purposes (Sigma, Spain). depending if the requirement of the homogeneity of variances
was fulfilled or not. The main factor studied was the effect of the
2.8. Tocopherols composition addition of different concentrations of S. almeriensis extract in
EVOO’s quality (FA, PV, p-AV, TOTOX, K232, K270, and DK), color
Tocols were evaluated following the international standard ISO parameters (a⁄, b⁄ L⁄, DE and YI), fatty acids profile, tocopherols
9936 (2006), with some modifications as described by Malheiro composition (a-, b-, c-, and total tocopherols), oxidative stability,
et al. (2013a). Tocopherols standards (a, b, c and d) were purchase and pigments composition (lutein and b-carotene). If a statistical
from Calbiochem (La Jolla, San Diego, CA) and Sigma (Spain), while significant effect was found, means were compared using Tukey’s
the internal standard 2-methyl-2-(4,8,12-trimethyltridecyl)chro- honestly significant difference multiple comparison test or Dun-
man-6-ol (tocol) was from Matreya Inc. (Pleasant Gap, PA). An nett T3 test also depending if equal variances could be assumed
accurate amount of filtered olive oil or S. almeriensis extract were or not. All statistical tests were performed at a 5% significance
blended with an appropriate amount of internal standard solution level.
(tocol) in a 1.5 mL volume of n-hexane and homogenized by stir-
ring. Sample preparation was conducted in dark and tubes contain- 2.10.2. Principal component analysis (PCA)
ing the samples were always wrapped in aluminum foil. The Principal components analysis (PCA) was applied for reducing
mixture was centrifuged for 5 min at 13,000 rpm and the superna- the number of variables in the olive oils enriched with different
tant analyzed by HPLC. The liquid chromatograph consisted of a concentration of S. almeriensis extract (4 variable corresponding
Jasco integrated system (Japan) equipped with a Jasco LC – NetII/ to color parameters – L⁄, a⁄, b⁄, and YI; 5 variables corresponding
ADC data unit, a PU-1580 Intelligent Pump, a LG-1580-04 Quater- to the quality parameters – FA, PV, K232, K270 and DK; p-AV, TOTOX
nary Gradient Unit, a DG-1580-54 Four Line Degasser and an FP- index; 4 variables corresponding to tocopherols, including total
920 fluorescence detector (kexc = 290 nm and kem = 330 nm). The vitamin E content (total tocopherols); oxidative stability; lutein
chromatographic separation was achieved on a Supelcosil™ LC-SI and b-carotene contents; with a total of 18 variables) to a smaller
column (3 lm) 75 3.0 mm (Supelco, Bellefonte, PA), operating number of new derived variables (principal component or factors)
at constant room temperature (23 C). A mixture of n-hexane and that adequately summarize the original information, i.e., the addi-
1,4-dioxane (97.5:2.5) was used as eluent, at a flow rate of tion of different concentrations of S. almeriensis to EVOO’s. More-
0.7 mL/min. Data were analyzed with the ChromNAV Control cen- over, it allowed recognizing patterns in the data by plotting them
ter – JASCO Chromatography Data Station (Japan). The compounds in a multidimensional space, using the new derived variables as
were identified by chromatographic comparisons with authentic dimensions (factor scores). PCA was performed by using SPSS soft-
standards, by co-elution and by their UV spectra. Quantification ware, version 21.0 (IBM Corporation, New York, U.S.A.).
was based on the internal standard method, using the fluorescence
signal response. 2.10.3. Linear discriminant Analysis (LDA)
A linear discriminant analysis (LDA) was used as a supervised
2.9. Pigments composition learning technique to classify the EVOO’s with different concentra-
tions of S. almeriensis extract added according to their color and
The extracts were prepared in accordance with Achir, quality parameters, TOTOX, p-AV, tocopherols content, fatty acids
Randrianatoandro, Bohuon, Laffargue, and Avallone (2010). Briefly, profile, pigments content, and oxidative stability (32 variables
olive oil samples (200 mg) were added with an appropriate overall). A stepwise technique, using the Wilk’s lambda method
amount of internal standard b-apo-carotenal (Sigma–Aldrich), with the usual probabilities of F (3.84 to enter and 2.71 to remove),
mixed with 2 mL acetone, vortexed for 10 s, and left overnight at was applied for variable selection. This procedure uses a combina-
20 C for triacylglycerol crystallization. Triacylglycerols were tion of forward selection and backward elimination procedures,
separated by rapid sampling followed by centrifugation at where before selecting a new variable to be included, it is verified
206 P. Limón et al. / Food Chemistry 175 (2015) 203–211
whether all variables previously selected remain significant. With concentration of extract and the luminosity observed, which turn
this approach, it is possible to identify the significant variables olive oils more darker than control olive oils (Fig. 1).
among all variables in study. To verify which canonical discrimi- The results obtained in a⁄, b⁄ and L⁄ showed that S. almeriensis
nant functions were significant, the Wilks’ Lambda test was extract addition to olive oils brought significant changes in their
applied. To avoid overoptimistic data modulation, a leaving-one- color, observations corroborated by DE parameter (color differ-
out cross-validation procedure was carried out to assess the model ences). In Fig. 1 are reported the color differences (Fig. 1A) between
performance. Moreover, the sensibility and specificity of the dis- olive oils without and with S. almeriensis extract and the yellow-
criminant model were computed from the number of individuals ness index (YI) (Fig. 1B). DE values are higher with the amount
correctly predicted as belonging to an assigned group. Sensibility of extract added to olive oils, which means that color differences
was calculated by dividing the number of samples of a specific with extract increase (Fig. 1). YI increases significantly with extract
group correctly classified by the total number of samples belonging addition, however, no differences were observed between the
to that specific group. Specificity was calculated by dividing the addition of 0.1 and 0.21 mg/mL.
number of samples of a specific group classified as belonging to The addition of S. almeriensis extracts is clearly seen, even at
that group by the total number of samples of any group classified naked eye (Fig. 1). The color adopted by the olive oils is related
as belonging to that specific group. The LDA was performed by to extract composition, mainly carotenoids (Cerón et al., 2008),
using the SPSS software, version 21.0 (IBM Corporation, New York, as properly discussed in Section 3.5.
U.S.A.).
3.2. Quality parameters
3. Results and discussion
The quality of the olive oils was assessed to verify if the addition
3.1. Color parameters of S. almeriensis extracts cause quality changes. The global observa-
tions clearly highlight that no quality degradation is undertaken by
The color of the EVOO’s was evaluated to assess the addition of extract addition (Table 1). Regarding FA values in four of the five
S. almeriensis in their appearance, since olive oils visual aspect is an olive oils studied no significant changes were observed, and in
important factor for consumers’ evaluation and preference one olive oil (olive oil B), extract addition reduce the levels of free
(Gómez-Caravaca et al., 2007). In Table 1 are presented the CIELAB fatty acids in the olive oils, but without significant changes
main axes, L⁄, a⁄ and b⁄ values obtained from EVOO’s with different between olive oils with extract. Such results are positive, since
concentrations of S. almeriensis extract. In the five olive oils studied the addition of extracts does not trigger hydrolytic reactions in
its clear the impact of the addition of the extracts. Values of a⁄ the olive oils, maintaining the levels of free fatty acids.
decrease with the concentration of extract added in similar way The possible occurrence of oxidative processes in the EVOO’s
in the five olive oils, with significant differences observed (Table 1). was monitored by several quality parameters (PV, K232, K270, DK,
This means that green coloration, typical of virgin olive oils, pass to and p-AV) reported in Table 1. The peroxidation of the EVOO’s is
a more yellow-orange coloration (Fig. 1). Regarding b⁄ value its reduced by S. almeriensis extracts, since in all olive oils, except olive
observed an increase in this parameter, mainly with the addition oil C, a significant decrease in PV was observed. Therefore the for-
of 0.1 mg of extract per mL of olive oil, since olive oils become mation of primary oxidation products (mainly hydroperoxides)
more yellow with the addition of S. almeriensis extract (Table 1 (Laguerre, Lecomte, & Villeneuve, 2007) is inhibited, acting the
and Fig. 1). The luminosity (L⁄) of olive oils decrease significantly S. almeriensis extracts as antioxidants. Specific extinction coefficients
in all samples, being observed a direct proportion between the at 232 and 270 nm (K232 and K270 respectively) also corroborate
Table 1
Quality parameters (FA – free acidity; PV – peroxide value), p-anisidine value (p-AV), TOTOX index, and color parameters (a⁄. b⁄ and L⁄) of EVOO’s without (I) and with S.
almeriensis extract (II = 0.1 mg/mL; III = 0.21 mg/mL).
Olive oil Colour parameters Quality parameters p-AV TOTOX
a⁄ b⁄ L⁄ FA (%) PV (mEq. O2/kg) K232 K270 DK
A
I 11.77 ± 0.29a 81.95 ± 0.81a 73.95 ± 0.52c 0.3 ± 0.04a 9 ± 1b 0.86 ± 0.15a 0.15 ± 0.02a 0.003 ± 0.002a 17 ± 1a 35 ± 2a
II 2.33 ± 0.42b 86.01 ± 1.32b 70.70 ± 0.85b 0.3 ± 0.05a 6 ± 1a 0.83 ± 0.09a 0.15 ± 0.01a 0.003 ± 0.001a 16 ± 0a 28 ± 3a
III 3.92 ± 0.51c 82.65 ± 0.96a 68.24 ± 0.61a 0.3 ± 0.04a 7 ± 2a 0.94 ± 0.12a 0.19 ± 0.03b 0.001 ± 0.002a 16 ± 1a 30 ± 4a
B
I 12.77 ± 0.27a 81.41 ± 1.46a 75.60 ± 1.01c 0.2 ± 0.00a 9 ± 1b 0.94 ± 0.17a 0.13 ± 0.02a 0.002 ± 0.005a 12 ± 0a 30 ± 2b
II 3.08 ± 0.45b 86.39 ± 2.23c 70.96 ± 1.38b 0.2 ± 0.00a 6 ± 1a 0.86 ± 0.18a 0.12 ± 0.01a 0.005 ± 0.002a 13 ± 1a 24 ± 2a
III 3.35 ± 0.36c 83.89 ± 1.49b 69.01 ± 0.89a 0.2 ± 0.00a 6 ± 0a 1.17 ± 0.55a 0.16 ± 0.01b 0.003 ± 0.004a 13 ± 1 a 25 ± 1a
C
I 13.13 ± 0.76a 73.24 ± 2.39a 78.53 ± 0.85c 0.3 ± 0.00a 9 ± 0a 0.84 ± 0.07a 0.18 ± 0.02a 0.001 ± 0.003a 13 ± 1a 32 ± 0b
II 1.28 ± 1.10b 89.40 ± 1.56b 72.93 ± 1.01b 0.3 ± 0.00a 8 ± 0a 0.88 ± 0.03a,b 0.21 ± 0.02a,b 0.007 ± 0.008a 14 ± 1a 31 ± 0b
III 5.42 ± 1.09c 88.15 ± 0.56c 71.58 ± 0.34a 0.3 ± 0.00a 8 ± 1a 0.92 ± 0.04b 0.24 ± 0.03b 0.003 ± 0.002a 13 ± 1a 30 ± 1a
D
I 11.77 ± 0.37a 82.34 ± 1.08a 74.85 ± 0.82c 0.2 ± 0.00a 9 ± 0b 0.82 ± 0.05a 0.13 ± 0.01a 0.003 ± 0.001a 15 ± 1a 33 ± 1b
II 3.48 ± 0.21 b 85.87 ± 2.02b 70.96 ± 1.01b 0.2 ± 0.00 a 6 ± 1a 0.84 ± 0.04a 0.15 ± 0.02a,b 0.004 ± 0.002a 16 ± 1a 27 ± 2a
III 2.36 ± 0.46c 85.17 ± 1.23c 69.87 ± 0.76a 0.2 ± 0.04a 6 ± 1a 0.81 ± 0.05a 0.16 ± 0.01b 0.002 ± 0.001a 16 ± 1a 28 ± 1a
E
I 14.15 ± 0.04a 71.48 ± 2.12a 81.34 ± 0.61c 0.3 ± 0.00a 8 ± 1b 1.00 ± 0.07a 0.13 ± 0.02a 0.003 ± 0.001a 14 ± 1a 29 ± 1a
II 5.38 ± 0.20b 95.20 ± 0.38c 77.49 ± 0.26b 0.3 ± 0.05a 5 ± 1a 0.93 ± 0.08a 0.13 ± 0.02a 0.009 ± 0.017a 14 ± 1a 24 ± 2b
III 0.85 ± 0.83c 93.58 ± 0.81b 75.13 ± 0.58a 0.3 ± 0.00a 5 ± 1a 1.01 ± 0.03a 0.16 ± 0.01b 0.002 ± 0.002a 14 ± 1a 24 ± 1b
P. Limón et al. / Food Chemistry 175 (2015) 203–211 207
Control 0.1 mg/mL 0.21 mg/mL
A 0.1 mg/mL 0.21 mg/mL
a
400 a A
b
300 a
200 b b
b
a B
100 a a
0
A B C D E
P = 0.001 P = 0.006 P = 0.017 P = 0.002 P = 0.259 C
B Control 0.1 mg/mL 0.21 mg/mL250
200 b b b b b b b b b b
a a a
150 a a D
100
50
0
A B C D E E
P < 0.001 P = 0.018 P = 0.001 P < 0.001 P = 0.001
Fig. 1. Color differences (DE) (A) and yellowness index (YI) (B) between EVOO’s with and without S. almeriensis extract. In each olive oil mean values with different letters
differ significantly (P < 0.05). (For interpretation of the references to color in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.)
that extracts addition does not affect olive oils quality. In K232 and (C18:1), followed by palmitic acid (C16:0) and linoleic acid (C18:2).
DK no significant changes were observed in the olive oils, however In the EVOO’s studied the addition of S. almeriensis extracts didńt
the addition of extracts to olive oil increase significantly K270 val- brought significant changes in the fatty acids profile, except in
ues. K270 is indicative of the formation of secondary products of some specific situations. In two olive oils (B and E) the content of
oxidation, meanwhile, and by evaluating the values obtained in palmitic acid increase significantly, while in olive oil C the same
p-AV, we clearly conclude that the addition of extracts does not was observed regarding linoleic acid. The contents of linolenic acid
inflict secondary oxidation in olive oils, and those results obtained (C18:3) in olive oils B and D increase considerably with statistical
in K270 could be related with the color conferred to olive oils by the meaning (Table 2). Concerning the different fatty acids fractions
extracts. According to Malheiro, Casal, Ramalhosa, and Pereira that compose the studied olive oils, as expected due to the high
(2011) p-AV is an empirical determination used to assess advanced contents in oleic acid, MUFA (monounsaturated fatty acids) were
oxidative rancidity of vegetable oils. The analytical method is the most abundant (>77%), followed by SFA (saturated fatty acids)
based on the reactiveness of the aldehyde carbonyl bond on the between 14.40% and 17.15%, and by PUFA (polyunsaturated fatty
p-anisidine amine groups, leading to the formation of Schiff base acids) with values ranging from 3.59% and 4.70% (Table 2). Trans
that absorbs at 350 nm. It allows the estimation of secondary prod- fatty acids were always equal or inferior to 0.05% (Table 2).
ucts of oxidation of unsaturated fatty acids, principally dienals and
2-alkenals (Labrinea, Thomaidis, & Georgiou, 2001). Therefore, by 3.4. Tocopherols composition
studying the data obtained in quality parameters (Table 1) of the
EVOO’s studied is clear that extracts addition inflicts neither pri- Tocopherols detailed composition of the EVOO’s with different
mary (PV and K232) nor secondary (p-AV) oxidative reactions. In concentrations of S. almeriensis extracts is reported in Table 3. In
fact the addition is positive since a lower formation of hydroperox- the five olive oils analyzed, three tocopherols were detected and
ides is observed and the overall quality of EVOO’s increase, as quantified: a-, b-, and c-tocopherol. a-Tocopherol was present in
observed in TOTOX value (Table 1). TOTOX value is a useful tool higher amounts, as expected for olive oils (Malheiro, Casal,
when assessing the oxidative deterioration of vegetable oils, being Lamas, Bento, & Pereira, 2012), with contents ranging from 119
also reported as the total oxidation value according to ISO 6885 to 429 mg/kg in control olive oils. b-Tocopherol values were
(2006). In the five olive oils analyzed, only in olive oil A no signif- between 4 and 6 mg/kg while c-tocopherol ranged from 40 to
icant decreases in TOTOX value were observed. The remaining 55 mg/kg in all samples studied (Table 3). Total tocopherols
olive oils reported lower oxidative deterioration with extracts amount varied from 159 mg/kg (olive oil C in control samples) to
addition. Lower TOTOX values were reported in comparison to 511 mg/kg (olive oil B with 0.1 mg/mL). The addition of S. almerien-
those obtained in Italian EVOO and OO (olive oil) (Cerretani, sis extracts does not affect considerably total tocopherols amount
Bendini, Rodriguez-Estrada, Vittadini, & Chiavaro, 2009). as well as individual tocopherols, except in some particular cases
Regarding all the values obtained in the quality parameters of (Table 3). These observations are in accordance with the observed
the olive oils with and without S. almeriensis extracts, all oils could absence of tocopherols in the S. almeriensis extract. Since tocophe-
be classified as EVOO’s according to the European Communitarian rols, mainly a-tocopherol, possess important antioxidant and
legislation (Commission Implementing Regulation (EU), No. 299/ vitaminic action, the fact that the addition of S. almeriensis do not
2013). compromise their content is a good aspect, since both important
biological properties are preserved in the olive oils.
3.3. Fatty acids profile
3.5. Pigments composition
Fatty acids profile of EVOO’s without and with different concen-
trations of S. almeriensis extracts are reported in Table 2. The fatty Analysis carried out by HPLC in the S. almeriensis extracts,
acids profile of the five EVOO’s is mainly composed by oleic acid prior to the inclusion in the EVOO’s, supported its richness in
YI ΔE
208 P. Limón et al. / Food Chemistry 175 (2015) 203–211
carotenoids, with b-carotene representing 13.3% of total extract,
followed by 0.25% of lutein and 1% of other unidentified carote-
noids. Spectrophotometric analyses corroborated the previous
results, with an average of 14.4% of total carotenoid-like com-
pounds in the S. almeriensis extracts.
The pigments composition of the five EVOO’s with and without
extracts of S. almeriensis is displayed in Fig. 2. From the results
obtained is observed that S. almeriensis extracts are mainly rich
in carotenoids, b-carotene and lutein, the first one being the major
component. In the five EVOO’s analyzed, lutein content in control
olive oils varied from 4.5 to 6.3 mg/kg (Fig. 2B). The addition of S.
almeriensis extracts increases considerably lutein content in olive
oils (except olive oil B). The increase of lutein with 0.1 mg/mL
was only statistically significant in oils A and C, while the addition
of 0.21 mg/mL was significant in olive oils A, C and D in comparison
with the control. Therefore the addition of 0.1 mg/mL would be the
best option in order to improve lutein content in olive oils. Mean-
while, we observed that the extracts of S. almeriensis are highly rich
in other carotenoid, b-carotene (Fig. 2A). b-carotene content in
control olive oils varied between 1.2 (olive oil C) and 4.1 mg/kg
(olive oil D). When we added 0.1 mg/mL, b- carotene increase
6.5, 6.0, 11.1, 4.4, and 8.3 times in olive oils from A to E, respec-
tively. With an addition of 0.21 mg/mL b-carotene content
increased 9 times in olive oil D and 25.8 times in olive oil C. b-car-
otene content in olive oils with 0.21 mg/mL varied between 30.1
and 37.1 mg/kg (olive oil B and D respectively; Fig. 2A). Compara-
tively to EVOO’s enriched with olive leaves during extraction pro-
cess (Malheiro, Casal, Teixeira, Bento, & Pereira, 2013b), EVOO’s
with S. almeriensis report lower lutein content but much higher
b-carotene, resulting from extract addition, without the significant
increment in chlorophylls and pheophytins as observed with olive
leaves addition during extraction process, regarded as potentially
reducing olive oil photostability.
Such increment in carotenoids caused significant changes in
olive oils color and quality as witnessed in Sections 3.1 and 3.2
of the present manuscript and in Fig. 1 and Table 1.
3.6. Oxidative stability
The oxidative stability of olive oils was assessed in order to ver-
ify if the addition of S. almeriensis extracts could display antioxi-
dant, pro-oxidant or no activity in the EVOO’s. The results
obtained are presented in Fig. 2C and they clearly show that
S. almeriensis extracts act as antioxidants, protecting olive oils from
oxidation. A significant increase in resistance to oxidation was ver-
ified in all olive oils. Meanwhile, by adding 0.21 mg of extract per
mL of olive oil no significant increases in oxidative stability were
observed comparatively to the addition of 0.1 mg/mL (except olive
oil D). From this observation we could infer the addition of
0.21 mg/mL of S. almeriensis extracts to olive oil could be excessive
since no further improvements were observed, and could also
possibly act as prooxidants. The addition of 0.1 mg/mL increased
oxidative stability of olive oils from 11.85% (olive oil C) to 37.80%
(olive oil A), while 0.21 mg/mL raised oxidative stability between
15.76% (olive oil C) and 42.06% (olive oil B). The increase in the
oxidative stability is related to the composition of the extracts of
S. almeriensis, especially rich in b-carotene. b-carotene is a recog-
nized antioxidant compound (Sies & Stahl, 1995), and according
to Aparicio, Roda, Albi, and Gutiérrez (1999), in normal conditions,
carotenoids are responsible for about 6% of olive oils stability. In
this kind of olive oils, with the great amounts of b-carotene in
the olive oils, carotenoids contribution to oxidative stability is
greatly increased. Such observations are important since shelf-life
of olive oils could be considerably increased, being interesting to
study the impact and stabilization of olive oils with S. almeriensis
extracts during storage period and thermal processing.
Table 2
Detailed fatty acids composition (g/100 g of fatty acids) of EVOO’s without (I) and with S. almeriensis extract (II = 0.1 mg/mL; III = 0.21 mg/mL).
Olive oil C16:0 C16:1 C17:1 C18:0 C18:1 C18:2 C20:0 C18:3 C20:1 C22:0 SFA MUFA PUFA Trans
A
I 11.76 ± 0.45a 0.79 ± 0.06a 0.10 ± 0.02a 2.87 ± 0.26a 78.09 ± 0.84a 3.46 ± 0.44a 0.37 ± 0.02a 0.57 ± 0.03a 0.24 ± 0.01a 0.09 ± 0.02a 15.24 ± 0.56a 79.22 ± 0.85a 4.02 ± 0.41a 0.04 ± 0.01a
II 11.35 ± 0.44a 0.77 ± 0.01a 0.10 ± 0.00a 2.60 ± 0.23a 79.32 ± 0.61a 3.18 ± 0.04a 0.35 ± 0.01a 0.58 ± 0.00a 0.22 ± 0.00a 0.11 ± 0.00a 14.52 ± 0.66a 80.42 ± 0.61a 3.76 ± 0.05a 0.02 ± 0.00a
III 11.07 ± 0.37a 0.80 ± 0.01a 0.10 ± 0.00a 2.74 ± 0.06a 79.21 ± 0.36a 3.30 ± 0.01a 0.35 ± 0.01a 0.60 ± 0.00a 0.22 ± 0.00a 0.11 ± 0.01a 14.40 ± 0.45a 80.34 ± 0.36a 3.9 ± 0.01a 0.02 ± 0.01a
B
I 11.43 ± 0.64a 1.33 ± 0.03a 0.11 ± 0.00a 2.41 ± 0.32a 77.67 ± 0.66a 3.58 ± 0.12a 0.36 ± 0.01a 0.77 ± 0.02a 0.25 ± 0.01a 0.12 ± 0.02a 14.45 ± 0.95a 79.35 ± 0.69b 4.35 ± 0.13a 0.04 ± 0.01b
II 12.01 ± 0.27a,b 1.36 ± 0.06a 0.10 ± 0.00a 2.29 ± 0.17a 77.33 ± 0.14a 3.73 ± 0.04a 0.37 ± 0.01a 0.81 ± 0.01b 0.25 ± 0.00a 0.11 ± 0.02a 14.92 ± 0.13a,b 79.04 ± 0.08a,b 4.54 ± 0.04a 0.01 ± 0.00a,b
III 13.00 ± 0.78b 1.34 ± 0.03a 0.11 ± 0.01a 2.71 ± 0.16a 76.22 ± 0.71a 3.73 ± 0.08a 0.36 ± 0.01a 0.80 ± 0.01a,b 0.25 ± 0.00a 0.10 ± 0.00a 16.30 ± 0.65b 77.91 ± 0.69a 4.53 ± 0.08a 0.03 ± 0.01a
C
I 10.85 ± 0.56a 0.88 ± 0.02a 0.10 ± 0.01a 2.99 ± 0.17a 78.77 ± 0.58a 3.56 ± 0.08a 0.34 ± 0.01a 0.63 ± 0.05a 0.22 ± 0.02a 0.11 ± 0.02a 14.42 ± 0.72a 79.96 ± 0.58a 4.19 ± 0.10a 0.05 ± 0.02a
II 11.22 ± 0.34a 0.93 ± 0.09a 0.13 ± 0.04a 2.86 ± 0.18a 78.69 ± 0.25a 3.66 ± 0.05a,b 0.38 ± 0.04a 0.60 ± 0.03a 0.27 ± 0.06a 0.11 ± 0.01a 14.73 ± 0.53a 80.02 ± 0.14a 4.26 ± 0.03a,b 0.04 ± 0.01a
III 11.35 ± 0.11a 0.90 ± 0.04a 0.10 ± 0.00a 2.94 ± 0.05a 78.73 ± 0.09a 3.73 ± 0.03b 0.35 ± 0.01a 0.63 ± 0.01a 0.23 ± 0.00a 0.10 ± 0.00a 14.86 ± 0.05a 79.96 ± 0.12a 4.36 ± 0.04b 0.04 ± 0.01a
D
I 13.36 ± 0.74a 1.17 ± 0.02a 0.11 ± 0.03a 2.28 ± 0.10a 77.09 ± 1.01a 2.94 ± 0.05a 0.33 ± 0.02a 0.65 ± 0.02a 0.24 ± 0.02a 0.10 ± 0.01a 16.19 ± 0.78a 78.61 ± 1.03a 3.59 ± 0.07a 0.05 ± 0.03a
II 13.14 ± 0.52a 1.16 ± 0.01a 0.10 ± 0.00a 2.32 ± 0.10a 77.33 ± 0.24a 3.07 ± 0.11a 0.35 ± 0.03a 0.69 ± 0.01a,b 0.24 ± 0.00a 0.11 ± 0.01a 16.05 ± 0.44a 78.84 ± 0.24a 3.77 ± 0.11a 0.02 ± 0.01a
III 12.18 ± 0.71a 1.17 ± 0.04a 0.10 ± 0.00a 2.27 ± 0.13a 78.29 ± 0.74a 3.31 ± 0.05a 0.34 ± 0.01a 0.74 ± 0.03b 0.24 ± 0.01a 0.10 ± 0.01a 15.02 ± 0.68a 79.82 ± 0.77a 4.05 ± 0.08b 0.04 ± 0.02a
E
I 12.17 ± 0.64a 1.18 ± 0.40a 0.08 ± 0.03a 3.16 ± 0.26a 76.94 ± 0.76a 3.85 ± 0.20a 0.36 ± 0.01a 0.63 ± 0.03a 0.22 ± 0.03a 0.11 ± 0.01a 15.94 ± 0.88a 78.41 ± 0.42a 4.48 ± 0.23a 0.04 ± 0.03a
II 11.92 ± 0.87a,b 0.94 ± 0.01a 0.09 ± 0.00a 2.98 ± 0.03a 77.19 ± 0.74a 4.03 ± 0.06a 0.37 ± 0.01a 0.67 ± 0.01a 0.24 ± 0.01a 0.11 ± 0.00a 15.52 ± 0.86a 78.47 ± 0.72a 4.70 ± 0.07a 0.04 ± 0.02a
III 13.55 ± 0.26b 0.96 ± 0.05a 0.09 ± 0.01a 3.02 ± 0.14a 76.04 ± 0.39a 3.98 ± 0.06a 0.35 ± 0.02a 0.67 ± 0.02a 0.23 ± 0.01a 0.10 ± 0.01a 17.15 ± 0.42a 77.32 ± 0.41a 4.65 ± 0.08a 0.03 ± 0.01a
P. Limón et al. / Food Chemistry 175 (2015) 203–211 209
Table 3 oil. In Fig. 3A is shown the two-dimensional representation of the
Tocopherols composition (mg/kg of olive oil) of EVOO’s without (I) and with S. two principal component factor scores that explain 58.61% of the
almeriensis extract (II = 0.1 mg/mL; III = 0.21 mg/mL).
total variance of the data obtained. It is perceived that the first
Olive Oil a- b- c- Total tocopherols principal component (PC1) separates control EVOO’s (without
Tocopherol Tocopherol Tocopherol extracts) from olive oils with S. almeriensis extracts. Control
A EVOO’s, represented in the entire negative region of PC1
I 257 ± 6.1 a 4.9 ± 0.1 a 50 ± 0.9 b 312 ± 6.8 a (Fig. 3A), were characterized by worst quality indexes (PV, FA,
II 273 ± 1.2 b 4.7 ± 0.2 a 50 ± 0.1 b 328 ± 1.8 b and TOTOX value), while EVOO’s with 0.1 and 0.21 mg/mL, mainly
III 261 ± 4.4 a 4.5 ± 0.1 a 46 ± 0.4 a 311 ± 4.6 a
represented in the positive region of PC1, are associated with
B higher values in color parameters (a⁄, b⁄, L⁄, DE, and YI – Table 1
I 429 ± 9.8 a 5.7 ± 0.2 a 55 ± 2.4 a 489 ± 11.4 a
II 451 ± 20.3 a 5.5 ± 0.3 a 54 ± 1.9 a 511 ± 20.2 a and Fig. 1), higher lutein and b-carotene content (Fig. 2A and B),
III 435 ± 5.2 a 5.4 ± 0.1 a 52 ± 2.5 a 492 ± 6.7 a and higher oxidative stability (Fig. 2C).
C Together with the unsupervised PCA method, a stepwise linear
I 119 ± 21.4 a 4.1 ± 0.1 a 44 ± 3.5 a 159 ± 24.7 a discriminant analysis (LDA) was applied to the obtained data in
II 121 ± 19.9 a 4.1 ± 0.0 a 42 ± 2.8 a 168 ± 22.6 a,b order to create a discriminant model. The model obtained resulted
III 137 ± 20.6 a 4.2 ± 0.1 a 42 ± 3.3 a 183 ± 24.0 b in seven significant discriminant functions that explained 100% of
D the variance, although only the first two were used, since they
I 336 ± 25.8 a 5.2 ± 0.1 b 42 ± 5.1 a 383 ± 30.8 a explain 89.3% of the variance of the experimental data (Function
II 330 ± 26.5 a 5.0 ± 0.2 a,b 40 ± 5.0 a 376 ± 31.5 a
III 334 ± 31.7 a 4.7 ± 0.2 a 39 ± 4.3 a 378 ± 35.6 a 1 52.8% and Function 2 36.5%; Fig. 3B). From the initial 32 vari-
ables, the model was created and based in 7 variables: b⁄, L⁄, YI,
E
I 297 ± 2.6 a 5.0 ± 0.1 a 51 ± 0.6 b 353 ± 3.2 a b-carotene, lutein, a-tocopherol and c-tocopherol. Once more,
II 297 ± 2.0 a 4.9 ± 0.1 a 49 ± 0.6 a,b 351 ± 2.6 a chemometrics proved that extracts addition have an important
III 307 ± 11.7 a 4.8 ± 0.1 a 49 ± 1.4 a 360 ± 13.2 a effect in the EVOO’s color descendent from pigments content in a
way that is possible to correctly classify samples. The model
showed an extremely satisfactory performance since it allowed
classifying correctly all samples according to the olive oil they
3.7. Olive oils discrimination by Scenedesmus almeriensis extract belong and to the correct concentration of S. almeriensis added.
addition The same results were observed for the cross-validation procedure
(sensitivities and specificities of 100%), showing that the classifica-
Scenedesmus almeriensis extracts addition at different concen- tion of the original groups was not overestimated. In Fig. 3B is pos-
trations clearly affected color, quality, composition and oxidative sible to observe that the discriminant functions separate EVOO’s
stability of EVOO’s in a way that it was possible to discriminate accordingly to the concentration of S. almeriensis extracts added,
them according to the concentration of extract added in each olive and among the same concentration is even possible to separate
A Control 0.1 mg/mL 0.21 mg/mL B
a a,b
b a
c E
b
a a
c b D a,b
b
a a
b
c C b b
a a
b B a
c a
a a
b A b
c b
40 30 20 10 0 0 3 6 9
β-carotene (mg/kg) Lutein (mg/kg)
C Control 0.1 mg/mL 0.21 mg/mL30 b
b b c
25 a,b b b
a b a a b20 b a
15 a
10
5
0
A B C D E
P = 0.005 P < 0.001 P = 0.016 P < 0.001 P = 0.002
Fig. 2. b-Carotene (mg/kg; A), lutein (mg/kg; B) and oxidative stability (hours; C) of EVOO’s without (I) and with S. almeriensis extract (II = 0.1 mg/mL; III = 0.21 mg/mL). In
each olive oil mean values with different letters differ significantly (P < 0.05).
Oxidative stability (hours)
210 P. Limón et al. / Food Chemistry 175 (2015) 203–211
A according to Kimmons, Gillespie, Seymour, Serdula, and Blanck
(2009), few American adolescents and adults consume the recom-
Vit. E
β-t α-t mended amounts of fruits and vegetables. Although the figures for
BI
γ-t BII BIII Europe are apparently not so disturbing, in several countries carot-
enoid intake from natural sources is still reduced (Tennant,
EII
DI Davidson, & Day, 2014). Olive oil production and consumption, in
EI EII DII opposition, is steadily increasing worldwide over the last years
K b*232 AII EII
EII DIII DIII YI (IOC, 2013a,b). Lutein and b-carotene are naturally present in olive
AI AIIρ-A EIIIEIII CaroteneLutein oil, but in low doses (Malheiro et al., 2013a). With the incorpora-PV AII DIII a* tion of S. almeriensis extracts their content increase in olive oil,
TOTOX FA AIII OS mainly b-carotene (Fig. 2A). Therefore, the incorporation of S.
ΔK almeriensis extracts in olive oil is a good strategy to encourage
K CIII the consumption of essential carotenoids to the human organism.CI 270
CII From the nutritional point of view the consumption of olive oils
enriched with S. almeriensis extracts would be a valuable asset to
counterbalance the deficient consumption of fruits and vegetables,
reducing, the lower ingestion of vital carotenoids. Furthermore, the
carotenoids from S. almeriensis possess a much higher bioaccesibil-
Control 0.1 mg/mL 0.21 mg/mL
B ity for absorption in human organism than many fruits and vegeta-
bles or supplements (Granado-Lorencio et al., 2009). Still, more
work must be performed before the commercialization of this type
of products, especially focusing into the safety for the consumer.
Despite being b-carotene and lutein GRAS additives, E160a and
E160b, respectively, the identification of other extract components
should be fully discriminated. Also, S. almeriensis extract prepara-
tion, in particular, should be optimized for increased productivity
while accomplishing all food industry GMP of, particularly regard-
ing the use of allowed materials and biocompatible solvents.
4. Conclusions
The addition of S. almeriensis brought significant changes in
olive oils color, quality, composition, and stability. The extracts
addition turns olive oils more yellow-orange due to pigments
extracts concentration, mainly b-carotene. Oxidative stability is
markedly improved by S. almeriensis extracts, improving olive oils
Fig. 3. Principal component analysis (PCA – A) and linear discriminant analysis shelf-life, protecting them from oxidative agents. Olive oils perox-
(LDA – B) of EVOO’s with (I) and without enrichment of S. almeriensis extract
(II = 0.1 mg/mL; III = 0.21 mg/mL) (p-A – p-anisidine value; OS – oxidative stability). idation is reduced as well as the formation of oxidation products,
PCA factors and discriminant functions explain 58.58% and 89.3% of the total enhancing olive oils quality. Fatty acids profile is not affected by
variance, respectively. extracts addition, as well as tocopherols content. Overall, extracts
addition is beneficial to olive oils being possible to discriminate
the different olive oils studied. Such data treatment helped recog- the different olive oils according to the amount of extract added.
nizing the effects of the extracts addition in the EVOO’s, and to From all the results obtained we concluded that the addition of
observe in an integrated and resumed way the entire data. 0.21 mg/mL does not contribute decisively to olive oils quality
and composition comparatively to 0.1 mg/mL, therefore the con-
3.8. Incorporation of S. almeriensis and olive oil consumption centration of 0.1 mg of S. almeriensis extracts per mL of olive oil
would be an optimal concentration, conserving all properties and
From the entire data obtained in the studied EVOO’s is clear that characteristics of original olive oils, while providing important
the main changes inflicted are related to carotenoids concentration doses of bioactive compounds and increased oxidative stability.
of the extracts, namely b-carotene and lutein, as previously The possible introduction of this kind of olive oil would increase
expected. Carotenoids are important components of several biolog- the daily intake of essential carotenoids in the daily diet, enhancing
ical processes in the human organism, having repercussions in possible health properties for consumers and conferring important
human health (Granado et al., 2003). Lutein and b-carotene, pres- nutritional assets. Nevertheless, future works need to be carried
ent in the extracts of S. almeriensis are two good examples. The out to assess the stability of this kind of olive oils during storage
amounts of carotenoids that are found in human tissues are almost and during culinary process as well. In this sense, we are going
exclusively from dietary origin, mainly from fruits and vegetables, to study olive oil stability as a function of three main degradation
or from supplements but its consumption is deficient in many variables: time, temperature and light exposure.
countries. For instance, and according to the State Indicator Report With this work we also concluded that S. almeriensis microalgae
on Fruits and Vegetables 2013 (CDC, 2013), in the U.S. 37.7% and are good sources of bioactive compounds and could be exploited
22.6% of the adult population consume fruits and vegetables, for the extraction of carotenoids for incorporation in food products
respectively, less than one time a day. When results report to ado- or to be included in food supplements.
lescent population, 36.0% and 37.7% consume fruits and vegetables,
respectively, less than one time daily. The fruits median intake in Acknowledgements
U.S. for adults and adolescents is 1.0 and 1.1 times a day respec-
tively, while for vegetables values increase to a consumption of Financial support from Jaén University and Caja Rural of Jaén
1.6 and 1.3 times a day respectively (CDC, 2013). Clearly and (Research Project: UJA2011/13/09) is gratefully acknowledged.
P. Limón et al. / Food Chemistry 175 (2015) 203–211 211
Support from the European Union (FEDER funds through COM- ISO 9936 (2006). Animal and vegetable fats and oils – Determination of tocopherol
PETE) and FCT through project Pest-C/EQB/LA0006/2012 is also and tocotrienol contents by high-performance liquid chromatography.
Kimmons, J., Gillespie, C., Seymour, J., Serdula, M., & Blanck, H. M. (2009). Fruit and
acknowledged. This manuscript is part of Piedad Limón Ph.D. vegetable intake among adolescents and adults in the United States: Percentage
dissertation. meeting individualized recommendations. The Medscape Journal of Medicine, 11,
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value.
CAPÍTULO DE LIBRO
AUTORES: Ruperto Bermejo, Piedad Limón, José M. Fernández y F. Gabriel
Acién.
TÍTULO: Aceites de oliva virgen enriquecidos en nuevos antioxidantes
procedentes de microalgas para la prevención de enfermedades degenerativas.
REF. LIBRO: (Eds. Castillo de Canena Olive Juice S.L.) Gráficas La Paz, Jaén-
Spain (2014)
ISBN: 978-84-617-2115-3.
Aceites de Oliva Virgen enriquecidos en nuevos antioxidantes) Lute‐Oil
ACEITES DE OLIVA VIRGEN ENRIQUECIDOS CON NUEVOS
ANTIOXIDANTES PROCEDENTES DE MICROALGAS PARA
PREVENCIÓN DE ENFERMEDADES DEGENERATIVAS
Ruperto Bermejo1, Piedad M. Limón1, José M. Fernández2 y F. Gabriel Acién2
1Departamento de Química Física y Analítica, Escuela Politécnica Superior de
Linares, Alfonso X El Sabio, 28, Universidad de Jaén, Linares 23700
2Departamento de Ingeniería Química, Universidad de Almería
Ruperto Bermejo Román es Doctor en Ciencias Químicas y actualmente es
Profesor Titular de Universidad en el Área de conocimiento de Química Física
de la Universidad de Jaén. Pertenece al Grupo de Investigación PAIDI
“Estructura y Dinámica de sistemas Químicos, FQM-337”. Así mismo, es
Subdirector de Relaciones Institucionales e Infraestructuras de Investigación
de la Escuela Politécnica Superior de Linares.
F. Gabriel Acién Fernández es Doctor en Ciencias Químicas y actualmente es
Profesor Titular de Universidad en el área de Ingeniería Química de la
Universidad de Almería. Pertenece al Grupo de Investigación PAIDI
“Biotecnología de microalgas marinas, BIO-173”.
José M. Fernández Sevilla es Doctor en Ciencias Químicas y actualmente es
Profesor Titular de Universidad en el área de Ingeniería Química de la
Universidad de Almería. Pertenece al Grupo de Investigación PAIDI
“Bioprocesos y tecnologías del agua, BIO-263”.
Piedad M. Limón Villarejo es Ingeniero Técnico Industrial (Especialidad Química
Industrial) y ha realizado el Máster Oficial en Olivar, Aceite de Oliva y Salud,
ambos títulos obtenidos en la Universidad de Jaén. Actualmente se encuentra
finalizando sus estudios de Tercer Ciclo (Doctorado), adscrita al área de
Química Física, dentro del Grupo de Investigación FQM-337.
1
COMUNICACIONES EN CONGRESOS
Autores: R. Gavara, A. M. Diniz, Y. Leydet, J. C. Lima, P. M. Limón, A. J.
Parola, V. Petrov, A. Quintas y F. Pina.
Título: Studies of self-aggregation and co-pigmentation involving anthocyanidin
3-glucosides.
Tipo de participación: Comunicación (Póster)
Congreso: Conference: European Winter School on Physical Organic
Chemistry (e-WISPOC)
Lugar celebración: Bressanone (Italy) Fecha: 2013
Studies of self-aggregation and co-pigmentation
involving anthocyanidin 3-glucosides
R. Gavaraa, A. M. Diniza, Y. Leydeta, J. C. Limaa, P. M. Limónb, A. J. Parolaa, V. Petrova,
A. Quintasc, F. Pinaa
aREQUIMTE, Departamento de Química, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa, 2829-516
Monte de Caparica, Portugal.
bDepartment of Physical and Analytical Chemistry, Jaén University, EPS of Linares, Alfonso X El Sabio, nº 28, 23700 Linares,
Jaén, Spain.
cInstituto Superior de Ciencias da Saude Egas Moniz, Centro de Investigação Interdisciplinar Egas Moniz, P-2829511 Monte
de Caparica, Caparica, Portugal
e-mail: r.castell@fct.unl.pt
Introduction
Anthocyanins are the natural compounds responsible for most of the red to blue colors of flowers and fruits.1 However, they present a pH
dependent network of chemical reactions in water that provokes, at low concentrations, the loss of color at moderately acidic pH values
(see Scheme 1 for Oenin).2 The pH of vacuoles, where anthocyanins are located in plants, changes roughly from 3 to 6,3 and therefore,
Nature should find some mechanisms for the stabilization of color. Two important mechanisms are auto-association and co-pigmentation
with other compounds. Here we present a summary about our studies on the self-aggregation of the six most common anthocyanidin 3-
glucosides.4,5 Additionally, results about the co-pigmentation involving Kuromanin and caffeine as a co-pigment are as well presented.6
Scheme 1. Network of chemical reactions represented for Oenin
Global acid-base equilibrium
+ CB + H O+ AH + H2O 3 K’a
[CB] = [A] + [B] + [Cc] + [Ct]
K’a = Ka + Kh + KhKt + KhKtKi
Self-aggregation studies
Diluted solutions: UV-vis spectroscopy Concentration effect
Myrtillin
The thermodynamic and kinetic constants of the network of chemical
Myrtillin, 2x10-5 M Myrtillin, 2x10-5 M reactions were determined for every anthocyanin at several
equilibrated pH jump 1 to 5.6
concentrations, in the range 6.0x10-6 – 8x10-4 M.4 Diluted and
moderately concentrated solutions were studied by UV–vis
spectroscopy, and carrying out the so-called direct and reverse pH
jumps experiments. Analysis of the equilibrated solutions (Figure A)
and the kinetic information obtained from the pH jumps (Figure B for
direct pH jump) allows to characterize the thermodynamics and kinetics
of the system. Concentrated solutions were studied by 1H-NMR, in this
case, information about the mole fraction distribution of every species at
the equilibrium can be directly obtained from the analysis of the spectra
(Figures C and D).
A B E
Representation of the values K’a, Ka and Kh obtained from
1H-NMR and UV-vis shows the dependence of these
Concentrated solutions: 1H-NMR constants on the anthocyanin concentration (see Figure E for Myrtillin).4 Both, flavylium cation and quinoidal
base self-aggregates. In the case of flavylium cation, aggregation difficults hydration while for quinoidal
Myrtillin, 8x10-4 M
D -5 equilibrated Myrtillin, 8x10-4 M base the acidity is increased with aggregation. Data reported for 2x10 M are a good approximation for
the intrinsic behavior of the anthocyanins, i.e. in the absence of aggregation (Table 1).
C Table 1.Thermodynamic and kinetic data for the concentration 2x10-5 M (no aggregation).
pK’a pKa Kh k k k kAnthocyanin a h -h t -tK
( 0.1) ( 0.1) (M-1)a t± ± (s-1)a (M-1 s-1 )a (s-1)a (s-1)a
Myrtillin 2.6 3.8 2.8 x 10-3 0.06 0.09 32 0.03b 0.5b
Oenin 2.3 3.8 3.4 x 10-3 0.12 0.12 35 0.06c 0.5c
Petunidin 3-OGl 2.4 3.7 3.3 x 10-3 0.13 0.10 30 0.08c 0.6c
Kuromanin 2.5 3.8 3.1 x 10-3 0.12 0.11 35 0.07c 0.6c
Peonidin 3-OGl 2.4 3.6 4.9 x 10-3 0.26 0.19 39 0.14b 0.5b
Callistephin 2.7 3.9 1.8 x 10-3 0.13 0.12 67 0.11c 0.8c
a Estimated error ~20%. b At pH = 1.0. c At pH = 1.1.
Aggregation of the flavylium cation was studied at pH = 1 by means of 1H-NMR, UV-vis and circular
dichroism. In the last case (see Figure F for Petunidin 3-OGl), a signal in the visible region appears upon Co-pigmentation studies
aggregation due to appearance of supramolecular chirality. For all the cases, the flavylium cation self-
associates in a left-handed manner.5 The variations observed for all the three techniques can be fitted with a
Kuromanin 2x10-5 M ( )
monomer-dimer model. The dimerization constants are shown in Table 2 and their magnitude seems to be
related to the number of -OH and -OCH3 substituents present in the molecule.
4,5 Kuromanin 2x10-5 M – Caffeine 0.08 M ( )
G
Table 2. Dimerization constants for the flavylium cation.
K AH+
Anthocyanin D -OH -OCH
(M-1) 3
Kuromanin
Myrtillin 1240 2 - Caffeine
Oenin 976 - 2 Co-pigmentation effect was studied for the system
Kuromanin:caffeine.6 The co-pigment interacts
Petunidin 3-OGl 900 1 1
both with the flavylium cation (AH+) and the
Kuromanin 700 1 - quinoidal base (A) stabilizing these species. As
a result, the domain of the flavylium cation is
Peonidin 3-OGl 661 - 1
extended to more basic pH values, while at
F Callistephin 401 - - moderately acidic medium the mole fraction of the
quinoidal base increases at expenses of the
hemiketal B (Figure G).
Bibliography Acknowledgements
[1] Markakis P. (Ed.), Anthocyanins as Food Colors, Academic Press, New York, 1982. [2] Pina, F., Melo, M. J., Laia, C. A.T., Parola, A. J., Lima, J. C. Chem. Soc. Rev. 2012, 41, 869–908. [3] Steward,
This work was funded by FCT through the projects PEst-C/EQB/LA0006/2011 and
R. N., Norris, K. H., Asen, S. Phytochemistry 1975, 14, 937-942. [4] Leydet, L., Gavara, R., Petrov, V., Diniz, A. M., Parola, A. J., Lima J. C., Pina, F. Phytochemistry 2012, 83, 125-135. [5] Gavara, R.,
PTDC/QUI-QUI/117996/2010 and post-doc grant SFRH/BPD/44639/2008 (RG.).
Petrov, V., Quintas, A., Pina, F. Phytochemistry 2013, accepted. [6] Limón, P. M., Gavara, R., Pina, F., submitted.
COMUNICACIONES EN CONGRESOS
Autores: R. Bermejo, P. Limón, F. Gabriel Acién, J.M. Fernández- Sevilla y M.
Melgosa.
Título: Aceites de oliva virgen enriquecidos con nuevos antioxidantes
procedentes de microalgas para prevención de enfermedades degenerativas.
Tipo de participación: Comunicación (Oral)
Congreso: XVI Scientific-Technical Symposium of olive oil (Expoliva 2013).
Lugar celebración: Jaén Fecha: 2013
El Aceite de Oliva. Actas Simposio Expoliva 2013
Jaén (España) 8-11 mayo
I.S.B.N. 978-84-938900-1-8
Aceites de oliva virgen enriquecidos con nuevos antioxidantes procedentes
de microalgas para prevención de enfermedades degenerativas.
Ruperto Bermejo Román1, Piedad Limón Villarejo1, F. Gabriel Acién Fernández2,
José M. Fernández Sevilla2, Manuel Melgosa Latorre3
1 Dpto. Química Física y Analítica, E.P.S. Linares, Universidad de Jaén.
2 Dpto. Ingeniería Química, Universidad de Almería.
3 Dpto. Óptica, Universidad de Granada.
http://www4.ujaen.es/~rbermejo
rbermejo@ujaen.es
ABSTRACT uno o varios componentes, que ejercen o promueven
Currently there is a growing interest in the development of un efecto beneficioso para la salud humana.
functional foods, which are those able to provide beneficial El interés por el carotenoide luteína se ha
effects on health, in addition to their nutritional or energetic incrementado recientemente en base a estudios que
values. Usually these products are traditional foods sugieren el efecto protector que resulta de una
enriched with one or several components promoting a
beneficial effect on human health. ingesta adecuada de este pigmento en la prevención
y evolución de enfermedades degenerativas oculares
In this sense, the interest in carotenoid lutein has recently humanas. Sin embargo, la dosis de luteína
increased on the basis of different studies suggesting the recomendada para grupos de riesgo, difícilmente
protective effect resulting from an adequate intake of this puede ser cubierta por modificaciones dietarias, por
pigment in the prevention and evolution of human-
degenerative eye diseases. However, the quantity of lutein lo que es conveniente administrar suplementos que
recommended for risk groups, is very difficult to be incluyan en sus formulaciones extractos enriquecidos
administered by dietary modifications, so it is convenient to en luteína.
manage supplements containing lutein-enriched extracts in
their formulations. La luteína y su interés
The aim of this work is the laboratory production and Los carotenoides son una gran familia de pigmentos
colorimetric characterization of virgin-olive oils enriched in fotosintéticos que se pueden dividir en carotenos y
lutein. A new methodology has been developed to obtain xantofilas, dentro de la cual se encuentra la luteína.
lutein extracts from the microalga Scenedesmus La luteína posee un alto interés comercial, en
almeriensis, which has a high level of this antioxidant sectores como la industria de nutracéuticos,
compound, to perform a physicochemical and colorimetric alimentación y cosmética, como colorante y
characterization of different virgin-olive oils enriched with potenciador de la pigmentación. Actualmente, existen
these extracts, as a suitable conduction medium to provide una serie de enfermedades oftálmicas tales como las
lutein to human organism. We have added increasing
amounts of lutein to different virgin-olive oils, studying how relacionadas con degeneración macular senil y
their color parameters change. cataratas y otros problemas que involucran
diferentes mecanismos (respuestas inmunes,
The results obtained show that virgin-olive oils enriched inflamaciones y apoptosis), que tienen que ver con el
with lutein to a concentration of 0'21 mg lutein/ml oil, show déficit de luteína en el organismo y la
acceptable physicochemical and colorimetric properties, correspondiente pérdida de protección antioxidante
allowing also to administer the daily-recommended lutein
intake (6 mg), taking into account the estimated average [1]. La luteína se encuentra en cantidades
consumption of virgin-olive oil per habitant and day in our significativas en la retina humana en la zona
country (30 ml). In this way, we try to obtain virgin-olive oils denominada “mácula lútea”. Aunque se desconoce el
with additional health properties, as an alternative way in mecanismo de la acción protectora de la luteína, éste
the fight against human degenerative diseases. se atribuye a su capacidad de filtrar parte de la luz
Keywords: Food color, lutein, virgin-olive oil, azul o de neutralizar los radicales libres que esta
Scenedesmus almeriensis. radiación u otros factores puedan originar [2]. En
este contexto, estudios epidemiológicos y clínicos de
administración de luteína como suplemento han
INTRODUCCIÓN mostrado que la ingesta de esta sustancia tiene un
papel relevante en la protección contra la aparición
Actualmente existe un interés creciente en el y/o progresión de enfermedades de elevada
desarrollo de alimentos funcionales, que son incidencia en países desarrollados como son cáncer
aquellos capaces de proporcionar efectos [3], enfermedad cardiovascular, cataratas y
beneficiosos para la salud, adicionalmente a su valor degeneración macular senil [4]. En estos momentos,
nutritivo o energético. Estos productos, son una de las vías más interesantes de cara a
usualmente alimentos tradicionales enriquecidos en desarrollar una estrategia preventiva para la
© FUNDACIÓN DEL OLIVAR, 2013. 1
Aceites de oliva virgen enriquecidos con nuevos antioxidantes
procedentes de microalgas para prevención de enfermedades
degenerativas. R. Bermejo Román, P. Limón Villarejo, F.G. Acién
Fernández, J.M. Fernández Sevilla, M. Melgosa Latorre.
degeneración macular, es una adecuada ingestión carotenoides son los pigmentos más abundantes en
de luteína en la dieta. aceites de oliva virgen. Los carotenoides se
Fuentes de luteína. Las microalgas como alternativa. encuentran presentes en un intervalo comprendido entre los 5-100 mg kg-1, y dependiendo de la
Dado su papel esencial en el metabolismo vegetal y naturaleza del aceite se ha encontrado luteína en
concretamente en la estructura y función del aparato concentraciones que varían en el intervalo 2-8 mg
fotosintético, la luteína se encuentra ampliamente kg-1 [8]. Los anteriores valores, indican que la luteína
distribuida en plantas superiores, contándose frutas y se encuentra en cantidades muy pequeñas y por
verduras entre sus fuentes para consumo humano, y tanto el aceite de oliva, en su composición original,
siendo especialmente ricas las de hoja verde. Sin no puede aportar las cantidades recomendadas para
embargo, ninguna de estas fuentes es directamente la prevención de enfermedades degenerativas. Sin
aplicable para complementar la ingesta habitual de la embargo, es importante resaltar que por sus
población hasta las dosis recomendadas para la características y por contener pequeñas cantidades
prevención de enfermedades degenerativas (6,0 de luteína, puede ser un adecuado medio para la
mg/día). Para esto, habitualmente se recurre al uso incorporación de este pigmento. En este sentido,
de extractos enriquecidos en luteína que, en su existen trabajos en los que se pone de manifiesto
mayoría, proceden de flores de caléndula y sirven que matrices alimenticias ricas en grasas, como lo es
para suplementar dietas de los grupos de riesgo. el aceite de oliva, pueden facilitar y/o beneficiar el
A pesar de la amplia distribución de la luteína en proceso de bioasimilación de este tipo de
plantas superiores y algunos productos que se usan carotenoides [9].
para la alimentación animal (harina de alfalfa, gluten MATERIALES Y MÉTODOS
de maíz y flores de caléndula), la reducida
concentración de luteína en estas materias primas Se han obtenido extractos de luteína procedente de
hace que se estén buscando otras fuentes en las que la microalga Scenedesmus almeriensis, mediante el
el pigmento se encuentre en mayores desarrollo de metodologías descritas previamente
concentraciones. Así, se están realizando esfuerzos [7,10]. Tras la eliminación de disolventes, la luteína
considerables para hacer posible la producción ha sido redisuelta en aceite de oliva virgen,
comercial de este carotenoide a partir de microalgas obteniendo un extracto concentrado de luteína (5
[5,6]. La biomasa de microalgas es una fuente mg/ml) listo para ser utilizado en los experimentos de
ventajosa de luteína debido a su elevado contenido enriquecimiento de diferentes aceites de oliva virgen
en este pigmento con respecto a las fuentes extra (Figura 1).
tradicionales anteriormente mencionadas y a que Las medidas de color se han realizado utilizando un
aparece como molécula libre en lugar de la mezcla espectrocolorímetro Konica Minolta CM-5 conectado
de ésteres que habitualmente se encuentra en los a un ordenador dotado del software SpectraMagic
extractos comerciales. NX PRO USB. El equipo proporciona medidas en el
Es importante resaltar en este punto, la existencia de espacio de color CIELAB. Suponemos iluminante
la microalga Scenedesmus almeriensis, una nueva D65 y observador patrón colorimétrico CIE 1931 en
especie descubierta por el Departamento de nuestras medidas coloriméticas. Tras la
Ingeniería Química de la Universidad de Almería en correspondiente calibración del instrumento se
Agosto de 2003, que contiene una elevada cantidad procedió a medir los parámetros de color para las
de luteína (hasta 7000 ppm), constituyendo ésta el muestras. Así, se colocaron 14 ml de aceite en una
carotenoide mayoritario [7]. cubeta transparente de cuarzo con unas dimensiones de 4.2 x 3.2 x 1.0 cm. Tras la medida
El aceite de oliva inicial para caracterizar el aceite sin adición de
Es bien conocido que el aceite de oliva posee, luteína, se inició el enriquecimiento, mediante
debido a su composición química, importantes sucesivas adiciones de 100 µl de extracto
propiedades que lo hacen un alimento muy saludable concentrado de luteína y se midieron los valores de
y recomendado, presentando además un alto factor los parámetros colorimétricos de cada muestra
de digestibilidad, parámetro muy importante en generada (L*, a*, b*), así como los correspondientes
alimentación. Son muchos los trabajos científicos a las variaciones de los mismos por comparación con
que avalan la importancia de su incorporación en una el aceite original (ΔL*, Δa*, Δb* y ΔE*ab). Los
dieta equilibrada, mostrando efectos muy resultados de diferencias de color usando fórmulas
beneficiosos para la salud. de diferencia de color avanzadas como CIEDE2000 [11], son similares a los obtenidos con CIELAB. La
Dentro de la gran variedad de compuestos existentes Figura 2 muestra, a título de ejemplo, algunos de los
en el aceite de oliva, se pueden nombrar, entre otros: diferentes aceites ensayados antes de las adiciones
compuestos hidrocarbonados, esteroles, compuestos de luteína.
diterpénicos y triterpénicos, alcoholes alifáticos,
tocoferoles, pigmentos, etc. Las clorofilas y los
© FUNDACIÓN DEL OLIVAR, 2013. 2
Aceites de oliva virgen enriquecidos con nuevos antioxidantes
procedentes de microalgas para prevención de enfermedades
degenerativas. R. Bermejo Román, P. Limón Villarejo, F.G. Acién
Fernández, J.M. Fernández Sevilla, M. Melgosa Latorre.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN unidades CIELAB). Esta diferencia entre el
Antes de usar el extracto de luteína obtenido, comportamiento colorimétrico de los cuatro aceites
procedente del correspondiente tratamiento de la estudiados puede estar relacionada con el hecho de
biomasa de la microalga Scenedesmus almeriensis, que el color inicial del aceite “Santuario de Mágina”
se ha procedido a caracterizar colorimétricamente los es bastante diferente al de los otros tres aceites
diferentes aceites de oliva virgen adquiridos, que (véase Tabla 1). En efecto, al ser su coordenada b*
tienen diferentes denominaciones de origen (Tabla tan elevada (b*=122’3), la primera adición de luteína
1). Los datos de color de la Tabla 1 (por ejemplo, difícilmente consigue aumentar aún más dicha
altos valores de L*) no se corresponden bien con los coordenada, por lo que la diferencia de color total
colores observados en la Figura 2, ya que los datos que produce dicha adición es bastante menor que la
de la Tabla 1 corresponden a medidas de color por que se observa en los otros tres aceites. Por otra
transmisión en muestras con un espesor menor que parte, la Figura 3 muestra que, salvo para el aceite
el de las muestras de la Figura 2. En la Tabla 1 de oliva “Santuario de Mágina”, en las primeras
puede también observarse que los aceites adiciones de luteína el color cambia más que en las
“Melgarejo” y “Carbonell” tienen coordenadas de últimas; es decir, hay una cierta tendencia asintótica
color muy parecidas, pero aún así nos interesa o de estabilización del color a partir de cierta
estudiar el cambio de color que las adiciones de cantidad de luteína adicionada.
luteína producen en cada uno de ellos, ya que su La Tabla 4 muestra, a modo de resumen, los
composición química puede ser muy diferente. parámetros colorimétricos de todos los aceites
Se han realizado adiciones sucesivas de un volumen utilizados y de los mismos adicionados con luteína
constante de extracto de luteína para ir aumentando hasta una concentración igual a 0’21 mg/ml. En ella
la concentración de forma progresiva. Tras cada una aparecen ordenados en orden creciente de
de las adiciones de 100 µl de extracto de luteína, se parámetro ΔEab*. Puede observarse que los aceites
homogeniza la muestra de aceite enriquecido y se que cambian menos de color tras la adición de
mide el color con el espectrocolorímetro, luteína respecto del color original sin la adición de la
obteniéndose los parámetros correspondientes a las misma, son los cuatro primeros de la Tabla 4, en
muestras generadas y las diferencias de color con el donde los valores del parámetro que índica la
aceite original al que no se había añadido luteína. A variación de color total se mantiene por debajo de 30
título de ejemplo se muestran en las Tablas 2 y 3 unidades CIELAB.
datos correspondientes a los aceites Santuario de A la vista de los datos puede deducirse que una
Mágina y Melgarejo. adición de luteína de 600 µl de extracto, genera
Los resultados obtenidos muestran que a medida aceites con una concentración de luteína igual a 0’21
que añadimos luteína, el color del aceite va mg/ml, concentración que haría que la ingesta media
cambiando desde las tonalidades iniciales amarillo- estimada por el COI (Comité Oleícola Internacional) y
verdosas de los diferentes aceites de oliva virgen la FEN (Federación Española de Nutrición) para la
extra, en la dirección que marca el extracto población de España, que es de 30 ml por persona y
fuertemente anaranjado de luteína. La adición de día, fuera suficiente para incorporar los 6 mg de
luteína produce un fuerte aumento en los valores de luteína que se estima que son necesarios para la
la coordenada a* y una disminución moderada de L*, prevención de enfermedades degenerativas tales
como cabría esperar, y se observa que también la como las comentadas anteriormente. El color que se
coordenada b* sufre modificaciones importantes en obtiene con la adición de luteína obviamente difiere
algunos de los aceites (ej. “Melgarejo”, Tabla 3). El del aceite original, siendo lógicamente más
valor de ΔEab* crece de forma continua conforme se
anaranjado debido a las características propias del
adiciona extracto y es interesante resaltar que de los extracto de luteína, debiendo abordarse como otra
aceites ensayados, los que generan menor variación línea de investigación paralela y complementaria, los
del parámetro ΔE * son FuenRoble y Santuario de estudios de variabilidad en la aceptabilidad y ab
Mágina. preferencia de este tipo de aceites por parte de los potenciales consumidores (Figura 4).
En la Figura 3 se observa, a modo de ejemplo, el
efecto de la adición de luteína en cantidades CONCLUSIONES
crecientes sobre cuatro de los aceites utilizados. Se Se ha desarrollado una metodología para obtener
puede observar que dicho efecto de adición de extractos ricos en luteína procedentes de una estirpe
luteína en los cuatro aceites es similar, si bien de microalga (Scenedesmus almeriensis) rica en
destaca un poco más la trayectoria correspondiente este compuesto antioxidante y se ha realizado un
al aceite “Santuario de Mágina” ya que el cambio de estudio de caracterización fisicoquímica y
color con la primera adición de luteína es de 9’6 colorimétrica de los aceites de oliva enriquecidos en
unidades CIELAB, bastante menor que el que se la misma, como medio idóneo de incorporación al
obtiene para los otros tres aceites (por encima de 20 organismo. Se ha procedido a adicionar luteína a
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Aceites de oliva virgen enriquecidos con nuevos antioxidantes
procedentes de microalgas para prevención de enfermedades
degenerativas. R. Bermejo Román, P. Limón Villarejo, F.G. Acién
Fernández, J.M. Fernández Sevilla, M. Melgosa Latorre.
diferentes aceites de oliva virgen, estudiando como REFERENCIAS
varían los parámetros colorimétricos a medida que
va aumentando la concentración de luteína. Así, se [1] Kijilstra, A., Tian, Y., Kelly, E., Berendschot, T. (2012) Lutein: more than just a filter for blue light, Progress in
ha utilizado un extracto de luteína de concentración Retinal and Eye Research 31, 303-315.
igual a 5 mg/ml, y se han realizado sucesivas
adiciones de 100 µl hasta llegar a concentraciones [2] Brenna, O.V. & Berardo, N., (2004). Application of
en los aceites de 0’33 mg/ml (360 mg luteína/kg Near-Infrared Reflectance Spectroscopy (NIRS) to the
aceite), es decir se han alcanzado concentraciones Evaluation of carotenoids content in maize. Journal of Agricultural and food chemistry, 52: 5577-5582.
de luteína entre 45 y 180 veces superiores a las que
presentan los aceites de oliva no enriquecidos en [3] Demming-Adams, B. & W.W.Adams III (2002).
luteína (2-8 mg luteína/kg aceite). Antioxidants in Photosynthesis and Human Nutrition.
Science, 298, 2149-2153.
Los resultados obtenidos muestran que
enriqueciendo los aceites hasta una concentración [4] Granado, F., Olmedilla B. & Blanco, I. (2003). Nutritional and clinical relevance of lutein in human
de 0’21 mg luteína/ml, se obtienen aceites con health. British Journal of Nutrition, 90:487-502.
propiedades fisicoquímicas y colorimétricas muy
aceptables, que además permiten incorporar al [5] Del Campo, J.A., H.Rodríguez, J.Moreno, M.A.Vargas,
organismo la ingesta diaria de luteína recomendada J.Rivas & M.G.Guerrero (2001). Lutein production by
(6 mg), teniendo en cuenta el consumo medio Muriellopsis sp. in an outdoor tubular photobioreactor. J.Biotechnol., 85, 289-295.
estimado de aceite de oliva por habitante y día para
nuestro país (30 ml). De esta forma, se pretende [6] García-González M., Moreno, J., Manzano, C.,
dotar al aceite de oliva de un valor añadido superior Florencio, F. J., Garcia Guerrero, M., (2005)
al que ya de por sí tiene y ofrecer una alternativa Production of Dunaliella salina biomass rich in 9-cis-
diferente a las actuales, en la lucha contra algunas carotene and lutein in a closed tubular
enfermedades degenerativas humanas. photobioreactor. Journal of Biotechnology 115:81–90.
[7] Fernández, J.M., Acién, F.G., Molina, E., (2010)
De esta forma, se han podido solubilizar cantidades Biotechnological production of lutein and its
adecuadas de luteína en los diferentes aceites de applications, Applied Microbiology and Biotechnology,
oliva virgen ensayados y se han estudiado 86-1, 27-40.
colorimétricamente los mismos, prestando especial
atención a los cambios de color producidos por la [8] Cichelli, A. & Pertesana, G.P., (2004). High-performance liquid chromatography analysis of
adición del antioxidante. Estos resultados son chlorophylls, pheophytins and carotenoids in virgin
esperanzadores en cuanto a la posible utilización de olive oils: chemometric approach to variety
aceite de oliva como medio de incorporación de classification. Journal of Chromatography A, 1046:
luteína en nuestro organismo, si bien deben ser 141-146.
completados con estudios de propiedades [9] Nidhi, B. y Baskaran, V,(2011) Influence of vegetable
fisicoquímicas de los aceites enriquecidos y de oils on micellization of lutein in a simulated digestion
estabilidad de los mismos, respecto de parámetros model, J. Am. Oil Chem. Soc. 88, 367-372.
tales como la temperatura y el tiempo, así como
también de preferencias y emociones de color de los [10] Cerón García, M.C., Campos Pérez, I., Macías
aceites aditivados frente a los originales, por parte de Sánchez, M.D., Bermejo Román, R., Fernández Sevilla, J.M and Molina Grima, E. (2010) Stability of
personas de España u otros países. carotenoids in Scenedesmus almeriensis biomass and
AGRADECIMIENTOS extracts under storage conditions. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 58, 6944-6950.
A la Universidad de Jaén, por la financiación
recibida a través del Proyecto del Plan Propio UJA [11] CIE 142-2001 “Improvemento t industrial colour-difference evaluation”. Comisión Internacional de
2011/13/09 que ha permitido el desarrollo de los Iluminación, Viena, 2001.
estudios presentados. A la Caja Rural de Jaén por el
correspondiente patrocinio.
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Aceites de oliva virgen enriquecidos con nuevos antioxidantes
procedentes de microalgas para prevención de enfermedades
degenerativas. R. Bermejo Román, P. Limón Villarejo, F.G. Acién
Fernández, J.M. Fernández Sevilla, M. Melgosa Latorre.
A B
Figura 1. (A) Microalga Scenedesmus almeriensis y (B) extracto de luteína (5 mg/ml).
A B C D
Figura 2. Aceites de oliva virgen extra empleados en las experiencias de enriquecimiento en luteína. A) Melgarejo, B)
Santuario de Mágina, C) Carbonell y D) Hojiblanca.
© FUNDACIÓN DEL OLIVAR, 2013. 5
Aceites de oliva virgen enriquecidos con nuevos antioxidantes
procedentes de microalgas para prevención de enfermedades
degenerativas. R. Bermejo Román, P. Limón Villarejo, F.G. Acién
Fernández, J.M. Fernández Sevilla, M. Melgosa Latorre.
45
40
35
30
25
20
Melgarejo
Santuario de Mágina
15
Carbonell
Hojiblanca
10
5
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35
[luteina] (mg luteina/ml aceite)
Figura 3. Diferencias de color (unidades CIELAB) para los aceites de oliva virgen extra en función del enriquecimiento en
luteína en los mismos.
A B
Figura 4. Variación del color en aceite de oliva virgen extra Santuario de Mágina (A) y el mismo aceite enriquecido con luteína
hasta una concentración igual a 0’21 mg/ml (muestra 6 de la Tabla 2).
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DeltaEab*
Aceites de oliva virgen enriquecidos con nuevos antioxidantes
procedentes de microalgas para prevención de enfermedades
degenerativas. R. Bermejo Román, P. Limón Villarejo, F.G. Acién
Fernández, J.M. Fernández Sevilla, M. Melgosa Latorre.
Tabla 1. Parámetros colorimétricos de aceites de oliva virgen extra utilizados en las experiencias de enriquecimiento en luteína
procedente del alga Scenedesmus almeriensis.
Aceite de Oliva Procedencia L* a* b*
FuenRoble Orcera (Jaén) 78’8 6’9 123’1
Santuario de Mágina Huelma (Jaén) 81’9 5’1 122’3
Oro Bailén Bailén (Jaén) 83’7 1’8 119’2
Oro Génave Génave (Jaén) 86’4 2’6 120’5
Hojiblanca Antequera (Málaga) 87’8 1’7 111’8
La Cántara Cambil (Jaén) 87’49 0’3 107’9
Melgarejo Pegalajar (Jaén) 88’8 1’3 109’0
Carbonell Nacional 88’0 0’7 105’3
Garay Lucena (Córdoba) 88’2 0’7 102’6
Baena Baena (Córdoba) 88’8 0’5 102’1
Abades Loja (Granada) 89’1 -0’03 102’7
Tabla 2. Parámetros colorimétricos en la adición de luteína sobre aceite de oliva virgen extra “Santuario de Mágina”. Extracto
de luteína adicionado [luteína]= 5 mg/ml. Volumen inicial de aceite en cubeta =14 ml.
Muestra Luteína L* a* b* ΔEab* [luteína] mg
Adicionada mg/ml luteína/kg
(ml) aceite
0 - 81’9 5’10 122’3 - -
1 0.1 79’7 11’5 129’2 9’6 0’04 43.6
2 0.2 77’8 16’2 128’6 13’4 0’07 76.3
3 0.3 76’4 19’6 127’2 16’3 0’10 109
4 0.4 74’9 23’3 125’8 19’8 0’14 153
5 0.5 73’9 25’5 124’3 22’1 0’17 185
6 0.6 72’8 27’3 123’1 24’0 0’21 229
7 0.7 71’9 29’0 121’8 25’9 0’24 261
8 0.8 71’1 30’2 120’8 27’4 0’27 294
9 0.9 70’2 31’7 119’5 29’2 0’30 327
10 1.0 69’4 32’9 118’2 30’8 0’33 360
Tabla 3. Parámetros colorimétricos en la adición de luteína en aceite de oliva virgen extra “Melgarejo”. Origen: Pegalajar
(Jaén). Extracto de luteína adicionado [luteína]= 5 mg/ml. Volumen inicial de aceite en cubeta =14 ml.
Muestra Luteína L* a* b* ΔEab* [luteína] mg
Adicionada mg/ml luteína/kg
(ml) aceite
0 - 88’8 1’30 109’0 - -
1 0.1 84’8 11’4 133’3 26’5 0’04 43.6
2 0.2 82’8 16’9 135’3 31’1 0’07 76.3
3 0.3 81’3 20’6 134’4 32’7 0’10 109
4 0.4 79’6 24’3 132’9 34’3 0’14 153
5 0.5 78’5 26’8 131’7 35’6 0’17 185
6 0.6 77’4 29’2 130’4 36’8 0’21 229
7 0.7 76’5 30’8 129’1 37’6 0’24 261
8 0.8 75’6 32’6 127’9 38’7 0’27 294
9 0.9 74’8 33’9 126’9 39’6 0’30 327
10 1.0 74’1 35’2 125’7 40’4 0’33 360
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Aceites de oliva virgen enriquecidos con nuevos antioxidantes
procedentes de microalgas para prevención de enfermedades
degenerativas. R. Bermejo Román, P. Limón Villarejo, F.G. Acién
Fernández, J.M. Fernández Sevilla, M. Melgosa Latorre.
Tabla 4. Parámetros colorimétricos de aceites de oliva vírgenes y diferencias de color CIELAB entre los aceites originales y los
aditivados con luteína.
Aceite de Oliva Procedencia L* a* b* ΔEab* [luteína]
mg/ml
FuenRoble Orcera (Jaén) 78’81 6’91 123’13 - -
71’10 25’81 120’28 20’60 0’21
Santuario de Mágina Huelma (Jaén) 81’9 5’10 122’3 - -
72’8 27’3 123’1 24’00 0’21
Oro Bailén Bailén (Jaén) 83’68 1’79 119’15 - -
73’62 26’57 124’32 27’24 0’21
Oro Génave Génave (Jaén) 86’42 2’63 120’52 - -
76’70 27’31 129’05 27’86 0’21
Hojiblanca Antequera (Málaga) 87’8 1’69 111’8 - -
76’6 29’6 129’2 34’7 0’21
La Cántara Cambil (Jaén) 87’39 0’33 107’96 - -
76’41 28’5 128’8 36’68 0’21
Melgarejo Pegalajar (Jaén) 88’8 1’30 109’0 - -
77’4 29’2 130’4 36’8 0’21
Carbonell Nacional 88’0 0’72 105’3 - -
76’7 29’6 129’3 39’0 0’21
Garay Lucena (Córdoba) 88’18 0’67 102’6 - -
77’40 27’9 130’17 40’22 0’21
Baena Baena (Córdoba) 88’75 0’46 102’14 - -
76’82 29’18 129’51 41’43 0’21
Abades Loja (Granada) 89’08 -0’03 102’66 - -
78’07 27’96 131’20 41’46 0’21
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COMUNICACIONES EN CONGRESOS
Autores: R. Bermejo, P. Limón, F. Gabriel Acién, J.M. Fernández- Sevilla y M.
Melgosa.
Título: Measuring color in virgin olive oils enriched with lutein from microalgae.
Tipo de participación: Comunicación (Oral)
Congreso: X Congreso Nacional del Color.
Lugar celebración: Valencia Fecha: 2013
MEDIDAS DE COLOR EN ACEITES DE OLIVA VIRGEN ENRIQUECIDOS CON
LUTEÍNA PROCEDENTE DE MICROALGAS.
MEASURING COLOR IN VIRGIN OLIVE OILS ENRICHED WITH LUTEIN FROM
MICROALGAE.
Bermejo Román, Ruperto (1); Limón Villarejo, Piedad (1); Acién Fernández, F. Gabriel (2);
Fernández Sevilla, José M. (2); Melgosa Latorre, Manuel (3)
(1) Departamento de Química Física y Analítica, Escuela Politécnica Superior de Linares, Universidad
de Jaén. Linares.
(2) Departamento de Ingeniería Química, Universidad de Almería, Almería.
(3) Departamento de Óptica, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Granada.
Página web http://www4.ujaen.es/~rbermejo; e-mail: rbermejo@ujaen.es
Resumen:
Actualmente existe un interés creciente en el desarrollo de alimentos funcionales, que son aquellos
capaces de proporcionar efectos beneficiosos para la salud, adicionalmente a su valor nutritivo o
energético. Estos productos, son usualmente alimentos tradicionales enriquecidos en uno o varios
componentes, que ejercen o promueven un efecto beneficioso para la salud humana.
El interés por el carotenoide luteína se ha incrementado recientemente en base a estudios que
sugieren el efecto protector que resulta de una ingesta adecuada de este pigmento en la prevención y
evolución de enfermedades degenerativas oculares humanas. Sin embargo, la dosis de luteína
recomendada para grupos de riesgo, difícilmente puede ser cubierta por modificaciones dietarias, por
lo que es conveniente administrar suplementos que incluyan en sus formulaciones extractos
enriquecidos en luteína.
El presente estudio tiene por objetivo la obtención y caracterización colorimétrica de aceites de oliva
enriquecidos en luteína a nivel de laboratorio. Así, se ha desarrollado una metodología para obtener
extractos ricos en luteína procedentes de una estirpe de microalga (Scenedesmus almeriensis) rica
en este compuesto antioxidante y se ha realizado un estudio de caracterización fisicoquímica y
colorimétrica de los aceites de oliva enriquecidos en la misma, como medio idóneo de incorporación
al organismo. Se ha procedido a adicionar luteína a diferentes aceites de oliva virgen, estudiando
como varían los parámetros colorimétricos a medida que va aumentando la concentración de luteína.
Se ha utilizado un extracto de luteína de concentración igual a 5 mg/ml, y se han realizado sucesivas
adiciones de 100 µl hasta llegar a concentraciones en los aceites de 0’33 mg/ml (360 mg luteína/kg
aceite), es decir se han alcanzado concentraciones de luteína entre 45 y 180 veces superiores a las
que presentan los aceites de oliva no enriquecidos en luteína (2-8 mg luteína/kg aceite).
Los resultados obtenidos muestran que enriqueciendo los aceites hasta una concentración de 0’21
mg luteína/ml, se obtienen aceites con propiedades fisicoquímicas y colorimétricas muy aceptables,
que además permiten incorporar al organismo la ingesta diaria de luteína recomendada (6 mg),
teniendo en cuenta el consumo medio estimado de aceite de oliva por habitante y día para nuestro
país (30 ml). De esta forma, se pretende dotar al aceite de oliva de un valor añadido superior al que
ya de por sí tiene y ofrecer una alternativa diferente a las actuales, en la lucha contra algunas
enfermedades degenerativas humanas.
Abstract:
Currently there is a growing interest in the development of functional foods, which are those able to
provide beneficial effects on health, in addition to their nutritional or energetic values. Usually these
products are traditional foods enriched with one or several components promoting a beneficial effect
on human health.
In this sense, the interest in carotenoid lutein has recently increased on the basis of different studies
suggesting the protective effect resulting from an adequate intake of this pigment in the prevention
and evolution of human-degenerative eye diseases. However, the quantity of lutein recommended for
risk groups, is very difficult to be administered by dietary modifications, so it is convenient to manage
supplements containing lutein-enriched extracts in their formulations.
The aim of this work is the laboratory production and colorimetric characterization of virgin-olive oils
enriched in lutein. A new methodology has been developed to obtain lutein extracts from the microalga
Scenedesmus almeriensis, which has a high level of this antioxidant compound, to perform a
physicochemical and colorimetric characterization of different virgin-olive oils enriched with these
extracts, as a suitable conduction medium to provide lutein to human organism. We have added
increasing amounts of lutein to different virgin-olive oils, studying how their color parameters change.
It has been used a lutein extract (5 mg/ml) and successive 100 µl additions to obtain virgin olive oils
with concentrations in the range 0’04 to 0’33 mg lutein/ml oil (40 to 360 mg lutein/kg oil). Thus, lutein
concentrations between 45 and 180 times higher than those found in virgin-olive oils not enriched with
lutein (2-8 mg lutein/kg oil) were produced.
The results obtained show that virgin-olive oils enriched with lutein to a concentration of 0'21 mg
lutein/ml oil, show acceptable physicochemical and colorimetric properties, allowing also to administer
the daily-recommended lutein intake (6 mg), taking into account the estimated average consumption
of virgin-olive oil per habitant and day in our country (30 ml). In this way, we try to obtain virgin-olive
oils with additional health properties, as an alternative way in the fight against human degenerative
diseases.
Palabras clave:
Color de alimentos, luteína, aceite de oliva virgen, Scenedesmus almeriensis.
Keywords:
Food color, lutein, virgin-olive oil, Scenedesmus almeriensis.
INTRODUCCIÓN
La luteína y su interés
Los carotenoides son una gran familia de pigmentos fotosintéticos que se pueden dividir en
carotenos y xantofilas, dentro de la cual se encuentra la luteína. La luteína posee un alto interés
comercial, en sectores como la industria de nutracéuticos, alimentación y cosmética, como colorante
y potenciador de la pigmentación. Actualmente, existen una serie de enfermedades oftálmicas tales
como las relacionadas con degeneración macular senil y cataratas y otros problemas que involucran
diferentes mecanismos (respuestas inmunes, inflamaciones y apoptosis), que tienen que ver con el
déficit de luteína en el organismo y la correspondiente pérdida de protección antioxidante [1]. La
luteína se encuentra en cantidades significativas en la retina humana en la zona denominada “mácula
lútea”. Aunque se desconoce el mecanismo de la acción protectora de la luteína, éste se atribuye a su
capacidad de filtrar parte de la luz azul o de neutralizar los radicales libres que esta radiación u otros
factores puedan originar [2]. En este contexto, estudios epidemiológicos y clínicos de administración
de luteína como suplemento han mostrado que la ingesta de esta sustancia tiene un papel relevante
en la protección contra la aparición y/o progresión de enfermedades de elevada incidencia en países
desarrollados como son cáncer [3], enfermedad cardiovascular, cataratas y degeneración macular
senil [4]. En estos momentos, una de las vías más interesantes de cara a desarrollar una estrategia
preventiva para la degeneración macular, es una adecuada ingestión de luteína en la dieta.
Fuentes de luteína. Las microalgas como alternativa.
Dado su papel esencial en el metabolismo vegetal y concretamente en la estructura y función
del aparato fotosintético, la luteína se encuentra ampliamente distribuida en plantas superiores,
contándose frutas y verduras entre sus fuentes para consumo humano, y siendo especialmente ricas
las de hoja verde. Sin embargo, ninguna de estas fuentes es directamente aplicable para
complementar la ingesta habitual de la población hasta las dosis recomendadas para la prevención
de enfermedades degenerativas (6,0 mg/día). Para esto, habitualmente se recurre al uso de extractos
enriquecidos en luteína que, en su mayoría, proceden de flores de caléndula y sirven para
suplementar dietas de los grupos de riesgo.
A pesar de la amplia distribución de la luteína en plantas superiores y algunos productos que
se usan para la alimentación animal (harina de alfalfa, gluten de maíz y flores de caléndula), la
reducida concentración de luteína en estas materias primas hace que se estén buscando otras
fuentes en las que el pigmento se encuentre en mayores concentraciones. Así, se están realizando
esfuerzos considerables para hacer posible la producción comercial de este carotenoide a partir de
microalgas [5,6]. La biomasa de microalgas es una fuente ventajosa de luteína debido a su elevado
contenido en este pigmento con respecto a las fuentes tradicionales anteriormente mencionadas y a
que, aparece como molécula libre en lugar de la mezcla de ésteres que habitualmente se encuentra
en los extractos comerciales.
Es importante resaltar en este punto, la existencia de la microalga Scenedesmus almeriensis,
una nueva especie descubierta por el Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de
Almería en Agosto de 2003, que contiene una elevada cantidad de luteína (hasta 7000 ppm),
constituyendo ésta el carotenoide mayoritario [7].
El aceite de oliva
Es bien conocido que el aceite de oliva posee, debido a su composición química, importantes
propiedades que lo hacen un alimento muy saludable y recomendado, presentando además un alto
factor de digestibilidad, parámetro muy importante en alimentación. Son muchos los trabajos
científicos que avalan la importancia de su incorporación en una dieta equilibrada, mostrando efectos
muy beneficiosos para la salud.
Dentro de la gran variedad de compuestos existentes en el aceite de oliva, se pueden
nombrar, entre otros: compuestos hidrocarbonados, esteroles, compuestos diterpénicos y
triterpénicos, alcoholes alifáticos, tocoferoles, pigmentos, etc. Las clorofilas y los carotenoides son los
pigmentos más abundantes en aceites de oliva virgen. Los carotenoides se encuentran presentes en
un intervalo comprendido entre los 5-100 mg kg-1, y dependiendo de la naturaleza del aceite se ha
encontrado luteína en concentraciones que varían en el intervalo 2-8 mg kg-1 [8]. Los anteriores
valores, indican que la luteína se encuentra en cantidades muy pequeñas y por tanto el aceite de
oliva, en su composición original, no puede aportar las cantidades recomendadas para la prevención
de enfermedades degenerativas. Sin embargo, es importante resaltar que por sus características y
por contener pequeñas cantidades de luteína, puede ser un adecuado medio para la incorporación de
este pigmento. En este sentido, existen trabajos en los que se pone de manifiesto que matrices
alimenticias ricas en grasas, como lo es el aceite de oliva, pueden facilitar y/o beneficiar el proceso de
bioasimilación de este tipo de carotenoides [9].
MATERIALES Y MÉTODOS
Se han obtenido extractos de luteína procedente de la microalga Scenedesmus almeriensis,
mediante el desarrollo de metodologías descritas previamente [7,10]. Tras la eliminación de
disolventes, la luteína ha sido redisuelta en aceite de oliva virgen, obteniendo un extracto concentrado
de luteína (5 mg/ml) listo para ser utilizado en los experimentos de enriquecimiento de diferentes
aceites de oliva virgen extra (Figura 1).
A B
Figura 1. (A) Microalga Scenedesmus almeriensis y (B) extracto de luteina (5 mg/ml).
Las medidas de color se han realizado utilizando un espectrocolorímetro Konica Minolta CM-5
conectado a un ordenador dotado del software SpectraMagic NX PRO USB. El equipo proporciona
medidas en el espacio de color CIELAB. Suponemos iluminante D65 y observador patrón
colorimétrico CIE 1931 en nuestras medidas coloriméticas. Tras la correspondiente calibración del
instrumento se procedió a medir los parámetros de color para las muestras. Así, se colocaron 14 ml
de aceite en una cubeta transparente de cuarzo con unas dimensiones de 4.2 x 3.2 x 1.0 cm. Tras la
medida inicial para caracterizar el aceite sin adición de luteína, se inició el enriquecimiento, mediante
sucesivas adiciones de 100 µl de extracto concentrado de luteína y se midieron los valores de los
parámetros colorimétricos de cada muestra generada (L*, a*, b*), así como los correspondientes a las
variaciones de los mismos por comparación con el aceite original (∆L*, ∆a*, ∆b* y ∆E*ab). Los
resultados de diferencias de color usando fórmulas de diferencia de color avanzadas como
CIEDE2000 [11], son similares a los obtenidos con CIELAB. La Figura 2 muestra los diferentes
aceites ensayados antes de las adiciones de luteína.
A B C D
Figura 2. Aceites de oliva virgen extra empleados en las experiencias de enriquecimiento en luteína.
A) Melgarejo, B) Santuario de Mágina, C) Carbonell y D) Hojiblanca.
RESULTADOS
Con el extracto de luteína obtenido, procedente del correspondiente tratamiento de la
biomasa de la microalga Scenedesmus almeriensis, se ha procedido a caracterizar los diferentes
aceites de oliva virgen adquiridos con diferentes denominaciones de origen (Tabla 1). Los datos de
color de la Tabla 1 (por ejemplo, altos valores de L*) no se corresponden bien con los colores
observados en la Figura 2, ya que los datos de la Tabla 1 corresponden a medidas de color por
transmisión en muestras con un espesor menor que el de las muestras de la Figura 2. En la Tabla 1
puede también observarse que los aceites “Melgarejo” y “Carbonell” tienen coordenadas de color muy
parecidas, pero aún así nos interesa estudiar el cambio de color que las adiciones de luteína
producen en cada uno de ellos, ya que su composición química puede ser muy diferente, como puede
por ejemplo inferirse de su diferente acidez.
Tabla 1. Parámetros colorimétricos y características de los aceites de oliva virgen extra usados en las
experiencias de enriquecimiento en luteína procedente de la microalga Scenedesmus almeriensis
Aceite de Oliva Procedencia Variedad Acidez L* a* b*
aceituna %
A: Melgarejo Pegalajar Picual 0’19 88’8 1’3 109’0
(Jaén)
B: Santuario de Huelma Picual 0’4 81’9 5’10 122’3
Mágina (Jaén)
C:Carbonell Nacional Picual, 0’6 88’0 0’72 105’3
arbequina
D: Hojiblanca Antequera Hojiblanca 0’5 87’8 1’69 111’8
(Málaga)
Tras cada una de las adiciones de 100 µl de extracto de luteína, se homogeniza la muestra
de aceite enriquecido y se mide el color con el espectrocolorímetro, obteniéndose los parámetros
correspondientes a las muestras generadas y las diferencias de color con el aceite original al que no
se había añadido luteína. A título de ejemplo se muestran en las Tablas 2 y 3 datos correspondientes
a los aceites Santuario de Mágina y Hojiblanca.
Tabla 2. Parámetros colorimétricos en la adición de luteína sobre aceite de oliva virgen extra “Santuario de
Mágina”. Extracto de luteína adicionado [luteína]= 5 mg/ml. Volumen inicial de aceite en cubeta =14 ml.
Muestra Luteína L* a* b* ∆Eab* [luteína] mg luteína/kg
Adicionada mg/ml aceite
(ml)
0 - 81’9 5’10 122’3 - -
1 0.1 79’7 11’5 129’2 9’6 0’04 43.6
2 0.2 77’8 16’2 128’6 13’4 0’07 76.3
3 0.3 76’4 19’6 127’2 16’3 0’10 109
4 0.4 74’9 23’3 125’8 19’8 0’14 153
5 0.5 73’9 25’5 124’3 22’1 0’17 185
6 0.6 72’8 27’3 123’1 24’0 0’21 229
7 0.7 71’9 29’0 121’8 25’9 0’24 261
8 0.8 71’1 30’2 120’8 27’4 0’27 294
9 0.9 70’2 31’7 119’5 29’2 0’30 327
10 1.0 69’4 32’9 118’2 30’8 0’33 360
Los resultados obtenidos muestran que a medida que añadimos luteína, el color del aceite va
cambiando desde las tonalidades iniciales amarillo-verdosas de los diferentes aceites de oliva virgen
extra, en la dirección que marca el extracto fuertemente anaranjado de luteína. La adición de luteína
produce un fuerte incremento en los valores de la coordenada a*, como cabría esperar, y se observa
que también la coordenada b* sufre modificaciones importantes en algunos de los aceites (e.g.
“Hojiblanca” de la Tabla 3). El valor de ∆Eab* crece de forma continua conforme se adiciona extracto y
es interesante resaltar que de los cuatro aceites ensayados, el que genera menor variación del
parámetro ∆Eab* es el correspondiente a Santuario de Mágina (Tabla 2).
Tabla 3. Parámetros colorimétricos en la adición de luteína sobre aceite de oliva virgen extra “Hojiblanca”.
Extracto de luteína adicionado [luteína]= 5 mg/ml. Volumen inicial de aceite en cubeta =14 ml.
Muestra Luteína L* a* b* ∆Eab* [luteína] mg lutíena/kg
Adicionada mg/ml aceite
(ml)
0 - 87’8 1’69 111’8 - -
1 0.1 84’8 10’2 132’5 22’6 0’04 43.6
2 0.2 82’5 16’5 134’9 27’9 0’07 76.3
3 0.3 80’6 21’2 133’6 30’2 0’10 109
4 0.4 78’9 24’8 132’2 32’1 0’14 153
5 0.5 77’6 27’5 130’6 33’6 0’17 185
6 0.6 76’6 29’6 129’2 34’7 0’21 229
7 0.7 75’8 31’1 128’2 35’7 0’24 261
8 0.8 74’7 32’9 126’6 37’0 0’27 294
9 0.9 73’7 34’3 125’2 37’9 0’30 327
10 1.0 72’9 35’6 124’0 39’0 0’33 360
En la Figura 3 se observa que el efecto de la adición de luteína en los cuatro aceites es
similar, si bien destaca un poco más la trayectoria correspondiente al aceite “Santuario de Mágina” ya
que el cambio de color con la primera adición de luteína es de 9’6 unidades CIELAB, bastante menor
que el que se obtiene para los otros tres aceites (por encima de 20 unidades CIELAB). Esta diferencia
entre el comportamiento colorimétrico de los cuatro aceites estudiados puede estar relacionada con el
hecho de que el color inicial del aceite “Santuario de Mágina” es bastante diferente al de los otros tres
aceites (véase Tabla 1). En efecto, al ser su coordenada b* tan elevada (b*=122’3), la primera adición
de luteína difícilmente consigue aumentar aún más dicha coordenada, por lo que la diferencia de
color total que produce dicha adición es bastante menor que la que se observa en los demás aceites.
Por otra parte, la Figura 3 muestra que, salvo para el aceite de oliva “Santuario de Mágina”, en las
primeras adiciones de luteína el color cambia más que en las últimas; es decir, hay una cierta
tendencia asintótica o de estabilización del color a partir de cierta cantidad de luteína adicionada.
Figura 3. Variación de los parámetros colorimétricos en aceites de oliva virgen extra en función del
enriquecimiento en luteína en los mismos.
45
40
35
30
25
20
Melgarejo
Santuario de Mágina
15
Carbonell
Hojiblanca
10
5
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35
[luteina] (mg luteina/ml aceite)
DeltaEab*
A la vista de los datos puede deducirse que una adición de luteína de 600 µl de extracto,
genera aceites con una concentración de luteína igual a 0’21 mg/ml, concentración que haría que la
ingesta media estimada por el COI (Comité Oleícola Internacional) y la FEN (Federación Española de
Nutrición) para la población de España, que es de 30 ml por persona y día, fuera suficiente para
incorporar los 6 mg de luteína que se estima que son necesarios para la prevención de enfermedades
degenerativas tales como las comentadas anteriormente. El color que se obtiene con la adición de
luteína obviamente difiere del aceite original, siendo lógicamente más anaranjado debido a las
características propias del extracto de luteína, debiendo abordarse como otra línea de investigación
paralela y complementaria, los estudios de aceptabilidad y preferencia de este tipo de aceites por
parte de los potenciales consumidores (Figura 4).
A B
Figura 4. Variación del color en aceite de oliva virgen extra Santuario de Mágina (A) y el mismo aceite
enriquecido con luteína hasta una concentración igual a 0’21 mg/ml (muestra 6 de la Tabla 2).
CONCLUSIONES
Nuestro grupo de investigación ha desarrollado una metodología para la extracción de luteína
procedente de la microalga Scenedesmus almeriensis y ha estudiado su incorporación al aceite de
oliva como medio de incorporación idóneo para ingerir las cantidades necesarias y prevenir la
aparición de ciertas enfermedades.
Se han podido solubilizar cantidades adecuadas de luteína en los diferentes aceites de oliva
virgen ensayados y se han estudiado colorimétricamente los mismos, prestando especial atención a
los cambios de color producidos por la adición del antioxidante. Estos resultados son esperanzadores
en cuanto a la posible utilización de aceite de oliva como medio de incorporación de luteína en
nuestro organismo, si bien deben ser completados con estudios de propiedades fisicoquímicas de los
aceites enriquecidos y de estabilidad de los mismos, respecto de parámetros tales como la
temperatura y el tiempo, así como también de preferencias y emociones de color de los aceites
aditivados frente a los originales, por parte de personas de España u otros países.
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad de Jaén, por la financiación recibida a través del Proyecto del Plan Propio
UJA 2011/13/09 que ha permitido el desarrollo de los estudios presentados. A la Caja Rural de Jaén
por el correspondiente patrocinio.
REFERENCIAS
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[11] CIE 142-2001 “Improvemento t industrial colour-difference evaluation”. Comisión Internacional
de Iluminación, Viena, 2001.
COMUNICACIONES EN CONGRESOS
Autores: R. Bermejo, P. Limón, F. Gabriel Acién, J.M. Fernández- Sevilla y M.
Melgosa.
Título: Using B-phycoerythrin from microalgae as a natural colorant to
reproduce the color in commercial strawberry yogurts.
Tipo de participación: Comunicación (Póster)
Congreso: 12th International AIC Congress 2013 (Congreso Internacional de
la Asociación Internacional del Color, AIC 2013).
Lugar celebración: Newcastle (England) Fecha: 2013
Using B-phycoerythrin from microalgae as a natural
colorant to reproduce the color in commercial
strawberry yogurts
Ruperto BERMEJO1, Piedad LIMÓN1, F. Gabriel ACIÉN-GERNÁNDEZ2, J. María
FERNÁNDEZ-SEVILLA2, Manuel MELGOSA3
1 Department of Physical and Analytical Chemistry, E.P. S. of Linares, Jaén University
2 Department of Chemical Engineering, Almería University, Almería
3 Department of Optics, Granada University, Granada
ABSTRACT
Colorants are additives widely used in industrial sectors such as food, drinks and
cosmetics. Actually, a high percentage of colorants used are synthetic and many of them
can produce toxic reactions in susceptible organisms. Thus, there is a growing interest in
searching new molecules with good coloring capacity to expand the catalogue of natural
colorants available in the market. In this sense, phycobiliproteins are proteins that form
light-harvesting antenna complexes (phycobilisomes) and act as photosynthetic accessory
pigments in cyanobacteria and red algae. Phycobiliproteins consist of three main groups:
phycoerythrins (PEs), phycocyanins (PCs) and allophycocyanins (APCs). Particularly, B-
phycoerythrin (B-PE) has been shown to be particularly useful due to its high fluorescence
efficiency and its intense and unique pink color. This protein has excellent spectroscopic
properties, stability, high absorption coefficient and high quantum yield. For this reason, B-
phycoerythrin has potential as natural colorant for use in food, cosmetics and
pharmaceuticals, particularly as substitute of current synthetic dyes. Although natural
colorants are widely found in nature, the major obstacle for their introduction as additives
is the high investment required in their purification processes. We have developed a new
methodology named “expanded bed adsorption chromatography” (EBAC) to obtain large
quantities of phycobiliproteins simplifying the downstream-processing flow sheets for the
recovery of phycobiliproteins, with concomitant savings in equipment and operating costs.
In order to study the usefulness of B-PE as a natural colorant, a B-PE extract from the
microalga Porphyridium cruentum was obtained by EBAC, and has been used to generate
different pink colors in yogurts. We have added increasing amounts of B-PE to a fixed
white yogurt measuring the corresponding CIELAB color parameters, and obtaining that,
while a* coordinate increases, both b* and L* decrease, as it could be expected from the
intense pink color of the B-PE extract. More specifically, additions of increasing quantities
of B-PE extract produced an almost asymptotic trend in the values of a*, b* and L*
coordinates, particularly in a* values. We have analyzed whether the color of four different
commercial strawberry yogurts, which incorporated in their composition a pink synthetic
dye, can be also achieved using our B-PE natural colorant added to the white yogurt. We
found that for just one of the four commercial yogurts, the addition of a small amount of B-
PE extract (0.05 ml) to the white yogurt led to a minimum value of 2.9 CIELAB units,
which means an acceptable reproduction of the color of this pink commercial yogurt using
our natural colorant. However, for the other three commercial yogurts, we needed to add
0.125, 1.150 and 0.200 ml of B-PE extract to the white yogurt, respectively, in order to
obtain a color-difference below 5.0 CIELAB units. Current results are encouraging about
the usefulness of B-phycoerythrin as a natural colorant in some industrial applications.
1. INTRODUCTION
Existen numerosos estudios que indican que los colorantes sintéticos son
potencialmente tóxicos e incluso cancerígenos, generando reacciones alérgicas en
individuos susceptibles (Arad and Yaron, 1992). Por esto, existe una demanda creciente
por parte de los consumidores, de reemplazar los colorantes sintéticos por compuestos de
origen natural, a la que los sectores industriales implicados deben dar respuesta. Es
importante resaltar en este contexto, que estos problemas no aparecen cuando se utilizan
compuestos naturales obtenidos a partir de organismos vivos, denominados biocolorantes.
Sin embargo, el catálogo recientemente aprobado por la Unión Europea (EFSA, 2012),
contiene un número de colorantes naturales relativamente pequeño en comparación con los
de tipo sintético, siendo predominante la utilización de estos últimos en los sectores
industriales vinculados.
Por otro lado, las biliproteínas son macromoléculas biológicas altamente
fluorescentes e hidrosolubles, estando encargadas de la captación de luz en organismos
fotosintéticos tales como las microalgas. Estas proteínas se utilizan en diversas
aplicaciones biotecnológicas (Glazer, 1999). Además, poseen elevados coeficientes de
extinción, colores muy intensos y atractivos, haciendo que estas biomoléculas posean un
elevado potencial de utilización como colorantes naturales. Las biliproteínas más
abundantes en la naturaleza son las ficoeritrinas (rosas, rojas y anaranjadas) y las
ficocianinas (azules y moradas). Por tanto, la gama y la intensidad de colores disponibles,
así como la abundancia relativa de estas proteínas en los organismos de procedencia, hacen
de estas macromoléculas, excelentes candidatos para su empleo como colorantes,
constituyendo una alternativa real para el incremento y diversificación de la oferta de
colorantes naturales existentes en el mercado. Nuestro grupo de investigación ha
desarrollado una novedosa metodología para la obtención de grandes cantidades de
biliproteínas mediante adsorción en lecho expandido, por lo que dispone de cantidad
suficiente para abordar ensayos de utilización como colorantes en diferentes matrices como
alimentos y bebidas (Bermejo et al., 2007; Bermejo and Ramos, 2012; Ramos et al., 2010).
En este trabajo se ha utilizado una disolución enriquecida en B-ficoeritrina, como
nuevo extracto colorante procedente de la microalga Porphyridium cruentum, para ensayar
sus propiedades en matrices alimenticias como las constituidas por yogures, habiéndose
realizado la caracterización colorimétrica de éstas.
2. METHOD
Las medidas de color se han realizado utilizando un espectrocolorímetro Konica Minolta
CM-5 conectado a un ordenador dotado del software SpectraMagic NX PRO USB. El
equipo proporciona medidas en el espacio de color L*a*b* y en el L*C*h*. Tras la
correspondiente calibración del instrumento se procedió a medir los parámetros de color
para las muestras. Así, se colocaron 15 g de muestra en una cubeta transparente de cuarzo
con unas dimensiones de 4.2 x 3.2 x 1.0 cm. De esta forma, se obtuvieron los parámetros
L*, a*, b*, C* y h* correspondientes a la muestra, además de la diferencia de color de
dicha muestra con respecto al estándar empleado (ΔL*, Δa*, Δb*, ΔC*, Δh* y ΔE*ab).
Figura 1. Colorante natural utilizado: ficoeritrina (rosa, procedente de Porphyridium).
Se han utilizado distintos tipos de yogures de fresa con el objetivo de intentar
reproducir el color de éstos. Así, se ha estudiado la coloración de cada muestra a través de
la adición de cantidades crecientes del extracto de B-ficoeritrina obtenido a partir de
biomasa de la microalga roja Porphyridium cruentum (Figura 1). Como estándar, se ha
utilizado el yogur de cada marca natural (blanco) es decir, un producto con los mismos
componentes que los comerciales coloreados pero sin la presencia de colorantes. En cuanto
a la preparación de las muestras se pesaron 15g de matriz y, se les fue adicionando
volúmenes crecientes del extracto de colorante natural. En todos los casos fue necesaria la
correcta homogeneización de las muestras tras las adiciones del extracto. Así, la adición
final fue aquella que produjo diferencias de color con la muestra comercial ensayada
ΔE*ab 5.
3. RESULTS AND DISCUSSION
El colorante utilizado han sido el extracto de B-ficoeritrina obtenido previamente por
nuestro grupo, a partir de la microalga correspondientes (Bermejo et al., 2007) y cuyos
parámetros colorimétricos se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Denominación, coordenadas cromáticas y propiedades físico-químicas de los
biocolorantes utilizados en los ensayos de apreciación de color.
Biocolorante Microalga Color Concentración L* a* b*
(extracto de natural Proteína
proteico Procedencia [mg/ml]
enriquecido)
Ficoeritrina Porphyridium Rosa 0.23 37.42 72.57 -8.25
cruentum
Se han determinado las curvas de saturación de color del extracto añadido sobre cada
matriz comercial ensayada, y se ha determinado el volumen de extracto necesario para
aproximarse al color de los diferentes productos comerciales utilizados. Como el color no
está compuesto por una única coordenada cromática, sino por el conjunto de parámetros
(L*a*b*), para cuantificar la desviación del color obtenido respecto al de los productos
comerciales, se ha utilizado además el parámetro E*ab. De esta forma, se ha analizado
tras cada adición de extracto colorante, el espectro de transmitancia dejando de añadir,
cuando dicho espectro solapa aproximadamente con el correspondiente al del producto
comercial de referencia. Es decir, se toma como volumen final de extracto necesario para
lograr reproducir el producto comercial, aquel que genera una muestra con parámetros
cromáticos similares a los de la muestra de referencia.
35
30
Danone
25 Auchan
Clesa
a*
20
Macedonia Clesa
15
b*
10
L*
5
0
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Volumen extracto añadido (ml)
40
30
20 Macedonia Clesa
10
Clesa
Auchan
0 Danone
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Volumen extracto añadido (ml)
A B
Figura 2. Variación de la coordenadas cromáticas a*, b* y L* (A) y de E*ab (B)
con el volumen de biocolorante” ficoeritrina”, añadido sobre yogur natural. Como
referencia, aparecen los valores de a* para diferentes yogures comerciales de fresa.
ab Parámetros de color
Como ejemplo, la Figura 2 muestra la variación de los parámetros cromáticos a* y
E*ab en las experiencias de aplicación del biocolorante “ficoeritrina” sobre la matriz de
referencia (yogur natural) para tratar de reproducir diferentes yogures comerciales de fresa.
Los resultados muestran como los productos comerciales difieren mucho entre sí, con
valores de a* entre 18 y 26. En el caso del producto con menor valor de a* (yogur
macedonia Clesa), son solo necesarios 0.05 mL de extracto para alcanzar el valor de a* de
referencia, mientras que en los otros se requieren entre 0.175-0.200 mL para alcanzar dicho
valor. Además, los resultados muestran como la desviación de color (E*ab) disminuye
cuanto mayor es el volumen de extracto añadido. Los parámetros de color y la simple
apreciación visual de las muestras mostró una elevada similitud con los productos
comerciales (Figura 3). Este hecho pone de manifiesto las buenas cualidades, como
colorante natural, del extracto utilizado y los valores suficientemente bajos de volúmenes
de extracto colorante para alcanzar un color similar a cada muestra comercial (Tabla 2).
Tabla 2. Volúmenes de extracto de ficoeritrina, necesarios adicionar a yogur natural, para
intentar reproducir distintas marcas comerciales.
Volumen extracto
Volumen extracto para
Yogur Parámetro a* necesario para
ΔE*ab ≤ 5 (μl)
reproducir a* (μl)
Fresa Danone 25’86 200 175
Fresa Clesa 24’26 175 125
Fresa Auchan 25’05 175 200
Macedonia Clesa 18’07 50 50
Figura 3. Muestras comerciales y generadas con los nuevos colorantes ensayados
sometidas a panel visual en cabina de comparación de color. Comparación con yogures de
fresa comerciales.
4. CONCLUSIONS
La solubilidad de las biliproteinas en los medios ensayados es buena, modificándose el
color de las diversas matrices con pequeños volúmenes de extractos proteicos. Así, los
factores de tinción, calculados como cantidad de extracto biocolorante necesario (por
unidad de volumen o masa de matriz) para reproducir el producto comercial ensayado, son
bastante bajos, lo que indica el importante poder colorante de estas macromoléculas.
La cantidad de extracto biocolorante a añadir depende en primer lugar del color del
producto comercial que se quiere alcanzar, ya que como se ha demostrado, yogures de
similares características presentan colores muy diferentes. Por otro lado, depende de la
naturaleza y concentración del extracto, pero sobre todo, es función de la propia matriz.
Los resultados obtenidos demuestran que para un mismo extracto, el valor de color
alcanzado varía enormemente en función de la matriz utilizada. Estos resultados ponen de
manifiesto la posibilidad de utilizar extractos de biliproteinas de origen microalgal, como
colorantes naturales en alimentación.
ACKNOWLEDGEMENTS
A la Junta de Andalucía, por la financiación recibida a través del Proyecto de
Excelencia P06-TEP-01362 que ha permitido el desarrollo de los estudios presentados. Al
Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Almería, por su colaboración en
el desarrollo de los cultivos de microalgas de las que se han obtenido los colorantes
naturales.
REFERENCES
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and purification of C-phycocyanin from the cyanobacteria Anabaena marina using
EBA chromatography”, J. Chem. Technol. Biotechnol, 85, 783-792 (2010).
R. Bermejo and A. Ramos: “Pilot scale recovery of C-phycocyanin from Spirulina
platensis using expanded bed adsorption chromatography”, Chromatographia, 75, 195-
204 (2012).
Address: Prof. Ruperto Bermejo, Department of Physical and Analytical Chemistry, E.P. S.
of Linares, Jaén University, C/ Alfonso X El Sabio, nº28, 23700 Linares, Jaén (Spain)
E-mails: rbermejo@ujaen.es; pidilv@gmail.com; acien@ual.es; jfernand@ual.es;
mmelgosa@ugr.es
COMUNICACIONES EN CONGRESOS
Autores: R. Bermejo, P. Limón, A. Navarro, A. Ortiz, M.P. Fernández, F.
Gabriel Acién, J.M. Fernández y M. Melgosa.
Título: Stability assessement of virgin olive oils enriched with new antioxidants
using spectrophotometric color monitorization.
Tipo de participación: Comunicación (Póster)
Congreso: XXIV Reunión Nacional de Espectroscopía. VII Congreso Ibérico de
Espectrocopía
Lugar celebración: Logroño-LaRioja (Spain) Fecha: 2014
COMUNICACIONES EN CONGRESOS
Autores: R. Bermejo, P. Limón, R. Malheiro, J.A. Pereira, M. Melgosa y F.
Gabriel Acién.
Título: Mejora de la estabilidad y de la fracción antioxidante de aceites de oliva
virgen extra mediante la adición de extractos de carotenoides procedentes de
microalgas.
Tipo de participación: Comunicación (Póster). ISBN: 978-84-938900-5-6.
Congreso: XVII Scientific-Technical Symposium of olive oil (Expoliva 2015).
Lugar celebración: Jaén Fecha: 2015
El Aceite de Oliva. Actas Simposio Expoliva 2015
Jaén (España) 6-8- mayo
ISBN. 978-84-938900-5-6
Mejora de la estabilidad y de la fracción antioxidante de aceites de oliva
virgen extra mediante la adición de extractos de carotenoides procedentes
de microalgas
Ruperto Bermejo Román1, Piedad Limón Villarejo1, Ricardo Malheiro2, Jose Alberto Pereira2,
Manuel Melgosa Latorre3, F. Gabriel Acién Fernández4
1 Dpto. Química Física y Analítica, Escuela Politécnica Superior de Linares, Universidad de Jaén, 23700 Linares,
Spain. e-mail: rbermejo@ujaen.es
2 Mountain Research Centre (CIMO), Polytechnic Institute of Braganca, Braganca, Portugal.
3 Dpto. Óptica, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Granada, Spain.
4 Dpto. Ingeniería Química, Universidad de Almería, Almería, Spain.
RESUMEN los carotenoides procedentes de Scenedesmus
almeriensis y en lo que se refiere a estabilidad, en todos
Actualmente una proporción importante de la población los casos ensayados, los aceites enriquecidos han
mundial sufre enfermedades crónicas atribuidas a valores mostrado mayor estabilidad, lo que muestra el efecto
insuficientes de compuestos antioxidantes en los tejidos. positivo del enriquecimiento en antioxidantes. Respecto del
Así, estudios epidemiológicos han mostrado que la análisis químico, los resultados obtenidos muestran que la
presencia de carotenoides a niveles séricos, está calidad de los aceites se ve mejorada, en el sentido de que
relacionada con bajos valores de riesgo en desarrollar los procesos de oxidación resultan en buena parte
enfermedades tales como: diversos tipos de cáncer, inhibidos. Además, la composición en ácidos grasos y en
afecciones cardiovasculares, cataratas, degeneración tocoferoles no se ve afectada. Por todo ello, puede decirse
macular, etc. Estos efectos beneficiosos para la salud, que los aceites mejoran notablemente su estabilidad
están principalmente relacionados con la capacidad
además de su valor nutricional y antioxidante, por lo que antioxidante que tienen estos carotenoides [1,2]. podrían constituir un alimento funcional muy adecuado
Sólo las plantas, las algas, algunos hongos y bacterias para la incorporación de este tipo de antioxidantes en el
sintetizan de forma natural los carotenoides, y por tanto, el organismo humano.
ser humano necesita incorporarlos a través de la dieta
mediante el consumo adecuado de alimentos,
fundamentalmente frutas y verduras. Desafortunadamente, INTRODUCCIÓN
la ingesta de carotenoides esenciales es reducida debido
al bajo consumo de los alimentos que los contienen [3]. Los carotenoides y su interés
En este contexto, existe un interés creciente en el Los carotenoides son una gran familia de pigmentos
desarrollo de alimentos funcionales, que son aquellos fotosintéticos que se pueden dividir dos grupos:
capaces de proporcionar efectos beneficiosos para la carotenos y xantofilas. Los carotenos no presentan
salud, adicionalmente a su valor nutritivo o energético. sustituciones en la cadena hidrocarbonada, mientras
Estos productos, son usualmente alimentos tradicionales y
una alternativa factible para paliar el déficit de que las xantofilas son derivados oxigenados, que
antioxidantes en el organismo, puede ser el desarrollo de contienen uno o más grupos funcionales (hidroxilo,
alimentos funcionales que contengan en su formulación carbonilo, alcoxi, carboxilo, etc.). Los carotenoides
extractos enriquecidos en carotenoides. presentan importantes propiedades como colorantes,
antioxidantes, como favorecedores del bronceado y
En el presente trabajo se han obtenido y caracterizado
aceites de oliva enriquecidos en carotenoides (beta- en el tratamiento y prevención de numerosas
caroteno y luteína), por adición de extractos ricos en estos enfermedades [4].
compuestos obtenidos a partir de una microalga rica en Mención especial merecen dentro de estos
ellos (Scenedesmus almeriensis). En estos aceites se han compuestos, el beta-caroteno que pertenece al grupo
desarrollado estudios de estabilidad, habiendo sido
determinado el comportamiento de los mismos frente a de los carotenos y la luteína que pertenece al grupo
variables como el tiempo, la temperatura y la exposición a de las xantofilas, por las relevantes aplicaciones que
la luz. Además, se han analizado parámetros químicos: comercialmente se han desarrollado. Estos dos
referentes a la calidad de los aceites (acidez libre, carotenoides poseen un gran potencial de aplicación
compuestos de oxidación primaria y secundaria, índice de y se vienen utilizando en diferentes sectores como la
peróxidos, K232, K270, p-anisidina,..) y referentes a la propia industria de nutracéuticos, en alimentación y
composición (perfil de ácidos grasos, tocoferoles, cosmética y como colorantes y potenciadores de la
pigmentos, …). pigmentación. Además, tienen utilidad en el
Los aceites de oliva virgen así obtenidos, han visto tratamiento de afecciones de tipo asmático, en la
incrementada su fracción antioxidante por incorporación de reducción del riesgo de ciertos tipos de cánceres y
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Mejora de la estabilidad y de la fracción antioxidante de aceites de
oliva virgen extra mediante la adición de extractos de carotenoides
procedentes de microalgas – R. Bermejo-Román, P. Limón-Villarejo,
R. Malheiro, J.A. Pereira, M. Melgosa-Latorre, F.G. Acién-Fernández
también en la prevención de enfermedades carotenoides son los pigmentos más abundantes en
cardiovasculares, dermatológicas y oftalmológicas aceites de oliva virgen. Los carotenoides se
[5,6]. encuentran presentes en un intervalo comprendido
-1
Una novedosa fuente de antioxidantes. Las entre los 5-100 mg kg , y dependiendo de la
microalgas como alternativa naturaleza del aceite se ha encontrado luteína en concentraciones que varían en el intervalo 2-8 mg kg-
Los carotenoides se encuentran distribuidos en 1. Los anteriores valores, indican que carotenoides
plantas superiores, contándose frutas y verduras como la luteína se encuentra en cantidades muy
entre sus fuentes para consumo humano. Sin pequeñas y por tanto el aceite de oliva, en su
embargo, es difícil utilizando estas fuentes alcanzar composición original, no puede aportar las
la ingesta recomendada para la prevención de cantidades recomendadas para la prevención de
enfermedades degenerativas (6,0 mg/día) por lo que enfermedades. Sin embargo, es importante resaltar
se recurre al uso de extractos, como por ejemplo los que por sus características y por contener pequeñas
enriquecidos en luteína que, en su mayoría cantidades de luteína y también de beta-caroteno,
actualmente, proceden de flores de caléndula y puede ser un adecuado medio para ser enriquecido
sirven para suplementar la dieta de los grupos de en estos antioxidantes. En este sentido, existen
riesgo. trabajos en los que se pone de manifiesto que
A pesar de la amplia distribución de estos matrices alimenticias ricas en grasas, como lo es el
carotenoides en plantas superiores y algunos aceite de oliva, pueden facilitar y/o beneficiar el
productos que se usan en alimentación (calabazas, proceso de bioasimilación de este tipo de
zanahorias, yema de huevo, pimientos rojos, harina carotenoides [9].
de alfalfa, gluten de maíz, flores de caléndula, étc.),
la reducida concentración de estos compuestos en
estas materias primas hace que se estén buscando MATERIALES Y MÉTODOS
otras fuentes en las que estos compuestos se Se han obtenido extractos de antioxidantes
encuentren en mayores concentraciones. Así, se procedentes de la microalga Scenedesmus
están realizando esfuerzos considerables para hacer almeriensis, mediante el desarrollo de metodologías
posible la producción comercial de estos y otros descritas previamente [8,10], para enriquecer aceites
carotenoides a partir de microalgas [7]. La biomasa de oliva virgen extra obtenidos comercialmente y
de microalgas es una fuente ventajosa de procedentes de las provincias de Jaén, Granada,
carotenoides debido a su elevado contenido en estos Córdoba y Málaga (Tabla 1).
pigmentos con respecto a las fuentes tradicionales
anteriormente mencionadas. En este sentido, la Caracterización fisicoquímica de aceites
microalga Scenedesmus almeriensis, posee La determinación espectrofotométrica del color se ha
elevadas cantidades de estos carotenoides (beta- utilizado para caracterizar y monitorizar las muestras
caroteno, luteína y violaxantina). Además, esta de aceites usando un espectrocolorímetro Konica
especie puede producirse en reactores tubulares con Minolta CM-5. El equipo proporciona medidas en el
elevada productividad en la media-gran escala, espacio de color CIELAB, utilizando iluminante D65 y
constituyendo una fuente de producción segura y observador patrón colorimétrico CIE 1931. Se
reproducible [8]. colocaron 14 ml de aceite en una cubeta
Una matriz alimenticia excepcional en la que transparente de cuarzo con unas dimensiones de 4.2
incorporar los antioxidantes. El aceite de oliva x 3.2 x 1.0 cm y se midieron los valores de los parámetros colorimétricos de cada muestra (L*, a*,
El aceite de oliva posee, debido a su composición b*), así como los correspondientes a las variaciones
química, importantes propiedades que lo hacen un de los mismos por comparación con el aceite control
alimento muy saludable y recomendado, (ΔL*, Δa*, Δb* y ΔE*ab).
presentando además un alto factor de digestibilidad,
parámetro muy importante en alimentación. Son Para las medidas de fotoestabilidad se han sometido
muchos los trabajos científicos que avalan la las muestras a exposición a luz ultravioleta en cabina
importancia de su incorporación en una dieta de control y comparación de color CAC 60 Verivide.
equilibrada, mostrando efectos muy beneficiosos Las medidas se tomaron a intervalos temporales
para la salud. distribuidos a lo largo de dos meses y se realizaron a temperatura ambiente. Para las medidas de
Dentro de la gran variedad de compuestos existentes termoestabilidad, las muestras se sumergieron en un
en el aceite de oliva, se pueden nombrar, entre otros: termostato de precisión Julabo, dotado de líquido
compuestos hidrocarbonados, esteroles, compuestos Thermal H5S para poder trabajar a temperatura igual
diterpénicos y triterpénicos, alcoholes alifáticos, a 120 ºC. Las medidas se tomaron a intervalos de
tocoferoles, pigmentos, etc. Las clorofilas y los tiempo regulares durante 74 horas.
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Mejora de la estabilidad y de la fracción antioxidante de aceites de
oliva virgen extra mediante la adición de extractos de carotenoides
procedentes de microalgas – R. Bermejo-Román, P. Limón-Villarejo,
R. Malheiro, J.A. Pereira, M. Melgosa-Latorre, F.G. Acién-Fernández
Caracterización química de los aceites registró el tiempo en alcanzar la inflexión en la
enriquecidos con luteína medida de conductividad.
Los parámetros químicos de calidad han sido
determinados de acuerdo con los métodos estándar
aprobados por la Unión Europea (Anexos II y IX) RESULTADOS Y DISCUSIÓN
(EEC/2568/91). Los cambios de tipo químico que se producen en los
Preparación de las muestras de aceites y adición del aceites de oliva suelen deberse a variables tales
extracto de carotenoides. como la exposición a la luz, la temperatura y transcurso del tiempo desde la obtención de los
Los aceites analizados se han adquirido mismos. Estas alteraciones con respecto a las
comercialmente como representativos de diferentes propiedades iniciales de los aceites, se pueden
comarcas de Andalucía, habiendo sido almacenados monitorizar siguiendo el cambio del color en los
hasta su utilización en el frigorífico. Todos los aceites mismos, ya que existe una estrecha relación entre
han sido filtrados, previamente a la realización de los los cambios químicos y la variación del color de la
diferentes experimentos, en presencia de sulfato matriz (degradación de la misma). Así, se ha
sódico anhidro. estudiado la degradación de distintos aceites frente a
Determinación de parámetros de calidad: Acidez la exposición a luz ultravioleta (foto-estabilidad),
libre. Índice de peróxidos. Coeficientes K y K . frente al calentamiento (termo-estabilidad) y frente al 232 270 transcurso del tiempo (estabilidad temporal).
La acidez libre ha sido determinada por valoración de
la muestra de aceite disuelta en etanol:éter (1:1, v/v), Estabilidad en función de la radicación incidente:
utilizando para ello disolución etanólica de hidróxido foto-estabilidad
de potasio y se ha expresado como tanto por ciento Los estudios de foto-estabilidad se han realizado
de ácido oleico. El valor de índice de peróxidos, utilizando cinco aceites de oliva diferentes: cuatro de
expresado en miliequivalentes de oxígeno activo por variedad picual, B, C, D y L; y un quinto aceite de
kilogramo de aceite (mequiv/kg), ha sido determinado variedad arbequina (aceite M). Se han ensayado dos
dejando reaccionar una mezcla de aceite y concentraciones de luteína diferentes: 0.1 y 0.21
cloroformo/ácido acético 3:2 (v/v), con una disolución mg/ml. Así, se ha representado en ordenadas el
de ioduro de potasio saturada y en oscuridad; el valor que indica la variación de color (dE*ab) frente al
ioduro libre fue valorado entonces con una disolución tiempo transcurrido desde el inicio a la exposición a
de tiosulfato sódico. Para la determinación de los luz ultravioleta. Como ejemplo, la Figura 1 muestra
coeficientes K232 y K270, se ha medido la absorbancia la foto-estabilidad del aceite “B” enriquecido en
a esas dos longitudes de onda, de una disolución al luteína hasta 0.1 mg/ml. Se puede apreciar
1 % (m/v) en isooctano, utilizando una cubeta de claramente como el aceite “B” enriquecido en
cuarzo de 1 cm de paso, en un espectrofotómetro antioxidantes sufre menor degradación por
Lambda 20 (Perkin Elmer). exposición a la radiación ultravioleta.
Determinación del valor p-anisidina y de la Estabilidad en función de la temperatura: termo-
estabilidad oxidativa. estabilidad
Los aldehídos insaturados y los compuestos de La temperatura es otra variable que produce
oxidación secundarios, han sido determinados degradación en los aceites y por ello se ha procedido
mediante el valor de anisidina, como se detalla en la a estudiar su influencia en la estabilidad de los
norma ISO 6885 (2006). Esta determinación se basa mismos. Así, se ha utilizado una temperatura de 120
en el incremento de absorbancia por gramo de ºC y los aceites han sido analizados a diferentes
aceite, medda a 350 nm (Genesys 10UV), de una tiempos sometidos a ese valor de temperatura. Si
disolución de aceite de oliva en iso-octano, antes y nos fijamos como ejemplo en el aceite L, la Figura 2
después de hacerlo reaccionar con el reactivo p- muestra el efecto del enriquecimiento en luteína a
anisidina en condiciones de oscuridad. 0.1 mg/ml y como el aceite enriquecido es más
La estabilidad oxidativa ha sido estimada mediante estable frente a la degradación térmica que el control
medida del tiempo de inducción a la oxidación sin enriquecer.
utilizando un equipo Rancimat 743 (Metrohm CH, Estabilidad en función del tiempo: consumo
Switzerland). Para ello, una corriente de aire seco, preferente
filtrado y limpio (20 l/h) fue burbujeado a través de
los aceites (3.00 g) calentando a 120 ºC, colectando Otra propiedad deseable en los aceites, es el
los compuestos volátiles en agua y midiendo de mantenimiento de sus propiedades fisicoquímicas el
forma continua el incremento de la conductividad. Se mayor tiempo posible. Es conocido, que para los aceites obtenidos en una determinada campaña, se
recomienda que se consuman en el año posterior, ya
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Mejora de la estabilidad y de la fracción antioxidante de aceites de
oliva virgen extra mediante la adición de extractos de carotenoides
procedentes de microalgas – R. Bermejo-Román, P. Limón-Villarejo,
R. Malheiro, J.A. Pereira, M. Melgosa-Latorre, F.G. Acién-Fernández
que si se supera este periodo de tiempo, las Análogamente, los parámetros K232 y K270, no sufren
propiedades esenciales de los aceites podrían verse apenas variaciones con el enriquecimiento y sus
alteradas. En este sentido, se ha estudiado la valores son aproximadamente constantes e
estabilidad de cinco aceites diferentes, sin enriquecer independientes de la concentración alcanzada en
y enriquecidos en luteína (0.1 mg/ml), analizando la antioxidante. En K232 y ΔK no se aprecian cambios
influencia del paso del tiempo. Para ello, se han significativos. Sin embargo, la adición de extracto a
realizado los ensayos a temperatura ambiente y en los aceites produce incrementos en los valores de
condiciones de almacenamiento de oscuridad y K270 lo que podría indicar formación de productos
ambiente seco. Los resultados obtenidos tras los 18 secundarios de oxidación. No obstante, observando
primeros meses de determinaciones, muestran que los valores obtenidos para p-AV, se puede concluir
los valores obtenidos para los aceites enriquecidos claramente que el enriquecimiento en luteína de los
en luteína generan siempre menos unidades de aceites no produce oxidación secundaria en ellos y
variación de color (dEab*), lo cual vuelve a mostrar el los valores de K270 pueden deberse al color conferido
efecto protector frente a la degradación, en este caso a los aceites por la adición del extracto.
temporal, de las muestras enriquecidas en
antioxidantes. Respecto a la estabilidad oxidativa, los resultados obtenidos (Figura 3) muestran que el extracto
Determinación de parámetros químicos añadido a los aceites, actúa claramente como
Se han realizado las determinaciones en los aceites antioxidante incrementando la resistencia a la
enriquecidos en luteína y comparado los parámetros oxidación de los aceites. Es de resaltar el elevado
obtenidos con los aceites control para analizar las incremento en la estabilidad producido en el caso del
diferencias. La Tabla 2 muestra a título de ejemplo, aceite “A”, donde se alcanza un incremento del 37.80
algunos de los parámetros químicos analizados y %.
correspondientes a cinco tipos de aceites diferentes.
Se han enriquecido los aceites a dos valores
diferentes de concentración de luteína (0.1 mg/ml y CONCLUSIONES
0.21 mg/ml) para poder comprobar si los parámetros En todos los casos ensayados, los aceites
químicos de calidad se ven afectados debido a la enriquecidos en carotenoides son más estables y
diferente concentración de antioxidante alcanzada en aguantan mejor la degradación producida por
las muestras. variables tales como temperatura, tiempo y
Como se desprende globalmente de los resultados exposición a la radiación ultravioleta. La estabilidad
mostrados en la Tabla 2, los parámetros de calidad oxidativa de los aceites enriquecidos también ha
de los diferentes aceites ensayados no se ven mejorado sustancialmente y las reacciones de
afectados por el enriquecimiento en antioxidantes. oxidación se han reducido notablemente. Además, el
Así, los valores de acidez apenas se alteran perfil de ácidos grasos y el contenido en tocoferoles
por la adición de extracto antioxidante no se ve afectado por el enriquecimiento.
independientemente de la concentración alcanzada Estos resultados, hacen que la posible introducción
en el mismo. En cuatro de los cinco aceites de estos aceites enriquecidos en carotenoides
ensayados, no se aprecian cambios significativos y procedentes de microalgas marinas, podría
únicamente en el aceite “C”, la adición de extracto incrementar la ingesta diaria de estos compuestos
antioxidante reduce los niveles de ácidos grasos esenciales a través de la dieta, mejorando además
libres en los aceites, pero sin cambios entre los las propiedades saludables y nutricionales de los
aceites enriquecidos a diferentes valores de aceites.
concentración en luteína (0.1 y 0.21 mg/ml
respectivamente). Estos resultados son positivos, Por tanto, los aceites enriquecidos en antioxidantes
indicando que la adición de antioxidantes no produce no presentan alteraciones importantes en los
reacciones hidrolíticas en los aceites, manteniendo parámetros químicos que tienen que ver con sus
los niveles de ácidos grasos libres. atributos esenciales y la presencia de los carotenoides añadidos va a producir más beneficios,
Respecto al índice de peróxidos, en todos los aceites que se suman a los ya existentes, sin que el resto de
se produce una ligera disminución del mismo en las propiedades se vean perjudicadas. Esto hace que los
muestras enriquecidas, siendo esta disminución aceites que se están obteniendo presenten mejores
independiente de la concentración alcanzada. Estos propiedades, aún si cabe, que los ya existentes,
valores indican que la peroxidación de los aceites dotando de un importante valor añadido a los
disminuye con la adición de extracto antioxidante en mismos y dejando la puerta abierta al desarrollo
todos los aceites, siendo los descensos importantes comercial e industrial de esta línea de nuevos
a excepción del aceite “F”. Así, puede decirse que la aceites.
formación de productos de oxidación primaria
(principalmente hidroperóxidos) resulta inhibida.
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Mejora de la estabilidad y de la fracción antioxidante de aceites de
oliva virgen extra mediante la adición de extractos de carotenoides
procedentes de microalgas – R. Bermejo-Román, P. Limón-Villarejo,
R. Malheiro, J.A. Pereira, M. Melgosa-Latorre, F.G. Acién-Fernández
AGRADECIMIENTOS 4. Demming-Adams, B. & W.W.Adams III (2002). Antioxidants in
Photosynthesis and Human Nutrition. Science, 298, 2149-
A la Universidad de Jaén, por la financiación 2153.
recibida a través del Proyecto del Plan Propio UJA 5. Kijilstra, A., Tian, Y., Kelly, E., Berendschot, T. (2012) Lutein:
2011/13/09 que ha permitido el desarrollo de los more than just a filter for blue light, Progress in Retinal and
estudios presentados. A la Caja Rural de Jaén por el Eye Research 31, 303-315.
correspondiente patrocinio. A la empresa “Castillo de 6. Omenn, G.S., Goodman, G.E., Thornquist, M.D., Balmes, J., Cullen, M.R., Glass, A. (1996).Effects of a combination of
Canena” por su colaboración en el desarrollo del beta carotene and vitamin A on lung cancer and
proyecto. cardiovascular disease. The new England Journal of
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7. García-González M., Moreno, J., Manzano, C., Florencio, F.
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Tabla 1. Parámetros colorimétricos de aceites de oliva virgen extra utilizados en las experiencias de enriquecimiento en
carotenoides procedentes del alga Scenedesmus almeriensis.
Aceite Procedencia Variedad de aceituna L* a* b*
A Jaén Picual 78.8 6.9 123.1
B Jaén Picual 81.9 5.1 122.3
C Jaén Picual 83.7 1.8 119.2
D Jaén Picual 86.4 2.6 120.5
E Málaga Hojiblanca 87.8 1.7 111.8
F Jaén Picual 87.5 0.3 107.9
G Jaén Picual 88.9 1.3 109.0
H Nacional Picual 88.0 0.7 105.3
I Córdoba Arbequina 88.2 0.7 102.6
J Córdoba Picual 88.8 0.5 102.1
K Granada Picual 89.1 -0.0 102.7
L Jaén Picual 80.3 -3.0 121.0
M Jaén Arbequina 81.7 -1.1 118.3
N Jaén Frantoyo 86.5 3.3 116.3
P Jaén Royal 80.1 4.9 121.5
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Mejora de la estabilidad y de la fracción antioxidante de aceites de
oliva virgen extra mediante la adición de extractos de carotenoides
procedentes de microalgas – R. Bermejo-Román, P. Limón-Villarejo,
R. Malheiro, J.A. Pereira, M. Melgosa-Latorre, F.G. Acién-Fernández
Tabla 2. Parámetros de calidad de aceites
Aceite de
Oliva FA (%)
PV
(mEq. O /kg) K232 K270 ΔK ρ-AV 2
A
I 0.19±0.00 9±0 0.82±0.05 0.13±0.01 -0.003±0.001 15±1
II 0.19±0.00 6±1 0.84±0.04 0.15±0.02 -0.004±0.002 16±1
III 0.20±0.00 6±1 0.81±0.05 0.16±0.01 -0.002±0.001 16±1
B
I 0.30±0.04 9±1 0.86±0.15 0.15±0.02 -0.003±0.002 17±1
II 0.31±0.05 6±1 0.83±0.09 0.15±0.01 -0.003±0.001 16±0
III 0.30±0.04 7±2 0.94±0.12 0.19±0.03 -0.001±0.002 16±1
C
I 0.28±0.00 9±1 0.94±0.17 0.13±0.02 -0.002±0.005 12±0
II 0.19±0.00 6±1 0.86±0.18 0.12±0.01 -0.005±0.002 13±1
III 0.19±0.00 6±0 1.17±0.55 0.16±0.01 -0.003±0.004 13±1
D
I 0.28±0.00 8±1 1.00±0.07 0.13±0.02 -0.003±0.001 14±1
II 0.24±0.05 5±1 0.93±0.08 0.13±0.02 -0.009±0.017 14±1
III 0.28±0.00 5±1 1.01±0.03 0.16±0.01 -0.002±0.002 14±1
F
I 0.28±0.00 9±0 0.84±0.07 0.18±0.02 -0.001±0.003 13±1
II 0.28±0.00 8±0 0.88±0.03 0.21±0.02 -0.007±0.008 14±1
III 0.28±0.00 8±1 0.92±0.04 0.24±0.03 -0.003±0.002 13±1
(FA – acidez libre; PV – índice de peróxidos, valor de ρ-anisidina (ρ-AV), sin enriquecer (I) y enriquecidos (II = 0.1 mg/mL; III =
0.21 mg/mL).
Figura 1. Foto-estabilidad de aceite de oliva virgen “B” bajo condiciones de iluminación ultravioleta.
120
100
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Días
○ aceite control ● aceite enriquecido en luteína a 0.1 mg/ml.
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dE*ab(D65)
Mejora de la estabilidad y de la fracción antioxidante de aceites de
oliva virgen extra mediante la adición de extractos de carotenoides
procedentes de microalgas – R. Bermejo-Román, P. Limón-Villarejo,
R. Malheiro, J.A. Pereira, M. Melgosa-Latorre, F.G. Acién-Fernández
Figura 2. Variación de los parámetros colorimétricos en aceites de oliva virgen extra “L” enriquecido a 0.1 mg/ml en luteína.
80
CONTROL
LUTEINA
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Horas
Figura 3. Efecto de la adición de extracto de carotenoides en la estabilidad oxidativa de diferentes aceites de oliva virgen.
Control 0.1 mg/mL 0.21 mg/mL
30 b
b b c
25 a,b b b
a b a b
20 b a a
15 a
10
5
0
A B C D E
P = 0.005 P < 0.001 P = 0.016 P < 0.001 P = 0.002
7
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Oxidative stability (hours)
dE*ab(D65)
COMUNICACIONES EN CONGRESOS
Autores: L. Gómez-Robledo, P. Limón, R. Bermejo y M. Melgosa.
Título: Colour emotions for antioxidant-enriched virgin olive oils
Tipo de participación: Comunicación (Oral)
Congreso: AIC2015 TOKYO Color and Image Congress (Midterm Meeting of
the International Colour Association).
Lugar celebración: Tokyo (Japón) Fecha: 2015
AIC2015 TOKYO
Color and Image
Midterm Meeting of the International Colour Association (AIC)
19-22 May 2015, Ochanomizu sola city Conference Center, Tokyo, Japan
Proceedings
Editors: Hirohisa Yaguchi
Katsunori Okajima
Taiichiro Ishida
Kikuko Araki
Motonori Doi
Yoshitsugu Manabe
Proceedings
© 2015 Color Science Association of Japan (CSAJ)
DISCLAIMER
Matters of copyright for all images and text associated with the papers
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prohibited without the written permission of CSAJ - Color Science Association
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Published May, 2015
by the Steering Committee of AIC2015 TOKYO
The Color Science Association of Japan
3-17-42, Shimo-ochiai, Shinjuku-ku, Tokyo 161-0033, Japan
Graphical design by Kikuko Araki
Printed by Tsujino Planning Office, Inc.
4
AIC2015 TOKYO - Color and Image
PS2-33
CoClooluourr E Emmoottiioonnss f ofro Ar nAtinoxtiiodaxnidt-aEnntr-icEhnedr iVchiregdin VOilrivgei nO iOls live
Luis GÓMEZ-ROBLEDO,1 Piedad LIMON,2O Ruilper to BERMEJO
2 and Manuel MELGOSA 1
1 Department of Optics, University of Granada (Spain)
2 Department of Physical and Analytical Chemistry, High Politechnical School of Linares, Jaeń Uni-
Luis GOMEZ-ROBLEDO1, Piedad LveIrMsiOtyN (S2p, aRinu)perto BERMEJO2, Manuel MELGOSA
1 Department of Optics, University of Granada (Spain)
2 Department of Physical and AnalyticAaBl SCThRemACisTtry, High Politechnical School of Linares,
Nowadays there is an increasing dJeaménan Ud noifv neerwsi tfyu n(Sctpioaninal) foods obtained from natural sources.
A new antioxidant-rich extract from microalgae has shown a high potential as natural colorant in extra
virgin olive oils keeping the natural properties of these products and adding positive properties (e.g.
prevention of age-related macular degeneratioAn)B wShTicRhA mCayT l ead to a future functional food. This work
look
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chh ihsa wveo brkee lno cook
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du tro eam soetti oonf extra vd extract froms ampipcrloie
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awt itihn cprreoafessinsigo ncaol noclievnet-roaitli-otansst eorsf ftrhoem cIonlsotirtauntot
changed the colour of the sample towards a reddish hue. The microalgae antioxidant-
enrRicehseudlt sc ooflo srpaenctt rcohraadnigoemde tthriec cmoelaosuurr eomf ethntes oslhiovwe eodi ltsh amt aininclryea isnin hgu ceo, nicne nsutrcahti oan sw oafy tthhea ct,o loon-
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coloreulra-etemdo ttioon ceoxlpoeurirm penret fsehowing that there is a high correlation between some pairs of emotions whoAsret imfiecaianli nagn ids Tmaosrtey r-eInlastie
rde ntoc ec o(loFuresh-Rancid, Healthy-Unhealthy, pid). Bitterr -preference (Fresh-Rancid, Healthy-
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Natural-Artificial and Tasty-Insipid). BitterS-Swweeeett,, SSppiiccyy--NNoonn ssppicicyy,a,n adn Tda sTtye-xItnusripeidd- Sarme onoottj caorrere nlaot-t
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Thetroe fgoeren,e vrairtgei na odliivseli koiel se wmitoht ihoing.h TChIEerLeAfoBr eh, uve-iragnignl eos l(iiv.e. gorielse nwisiht hh uheisg)h s eCemIE tLoA bBe theu em-aonstg aleps-
pro(pgriraeten ciasnhd hiduaetse)s stoe ebme etnor ibceh etdh eb ym thoesst ea epxptrroacptrsi afrtoem o nmeisc rtoa blgea e.nriched by these extracts from
microalgae.
1. INTRODUCTION
The amounts of carotenoids that are found in human tissues are almost exclusively
from dietary origin, mainly from fruits and vegetables, or from supplements. It has been
reported that the uptake of ß -carotene reduces the risk of age-related macular degeneration
(Teikari, J.M.: 1998). In addition, it has been shown that olive oil with extract from
microalgae known as Scenedesmus almeriensis brought changes in olive oils, quality,
composition, colour and stability giving. Therefore, olive oil with an addition of
microalgae extract could be a good convoy to improve and enhance the intake of
carotenoids in a daily basis (Limon, P: 2015). Although this change in colour may not
change its taste or smell, the subjective perception of these factors can change (Zellner,
DA: 2003) and colour emotion techniques help to quantify the expectation of a product
when it is perceived by human eye (Wei, S: 2014).
1068
AIC2015 TOKYO - Color and Image
Colour Emotions for Antioxidant-Enriched Virgin Olive This work has two main objectives. Firstly, we want to analyse how does the colour
of virgin olive oil changes when we add lutein and ß-carotene enriched extract from the
Oils Scenedesmus almeriensis microalga. Secondly, we want to check how does the human
perceived this change in colour by using colour semantic methods (Ou, L: 2004).
Luis GOMEZ-ROBLEDO1, Piedad LIMON2, Ruperto BERMEJO2, Manuel MELGOSA
1 Department of Optics, University of Granada (Spain)
2 Department of Physical and Analytical Chemistry, High Politechnical School of Linares, 2. METHOD
Jaén University (Spain) Six samples of different extra-virgin olive oils have been selected, five of them obtained in
the same harvest season: Fuenroble, Santuario Mágina, Oro de Bailén, Castillo de Canena
ABSTRACT and Melgarejo 1; and another one from the previous harvest season Melgarejo 2. For each
This work looks for relationships between 9 specific colour emotions applied to a set of one of these samples we have prepaired three different samples by adding different
extra virgin olive oils which have been coloured by using a lutein and ß-carotene enriched concentration of extract of microalgae: 0.00 mg/ml (A), 0.10 mg/ml (B) and 0.21 mg/ml. A
extract from microalgae. 6 extra virgin olive oils have been coloured with 2 different total of 18 samples have been used, 6 oils × 3 concentrations. Each one of the samples was
concentrations of this colorant obtaining a total of 18 different samples. 20 non-expert poured into bottles with dimensions of 1.5 cm X 1.5cm X 6.0 cm and a capacity of about
Spanish observers were asked to describe the colour appearance of the samples using 9 20 ml. These bottles have rectangular prism shape and their flat faces allow having an
different pairs of adjectives (Aromatic-Odourless, Bitter-Sweet, Fresh-Rancid, Healthy- homogenous colour of the oils, this fact makes easier their colour measurement and their
Unhealthy, Like-Dislike, Natural-Artificial, Spicy-Non spicy, Tasty-Insipid and Textured- colour perception. All the samples were kept in a controlled environment during all the
Smooth). Results of spectroradiometric measurements performed under the same experiment.
conditions than visual observations showed that increasing concentrations of the colorant Colour measurement of the samples has been made placing the samples in a
changed the colour of the sample towards a reddish hue. The microalgae antioxidant- Verivide Portable cabinet (Verivide, Leicester, United Kingdom) using a D65 light source
enriched colorant changed the colour of the olive oils mainly in hue, in such a way that, on simulator, the walls of the cabinets were covered by white non fluorescent paper in order to
the average, more than 70% of the total CIELAB colour-difference between pure and lutein avoid shades in the samples and have a lighter background behind the samples. The colour
and ß-carotene enriched virgin olive oils was a hue difference. Torgerson's law of was measured using a Konica Minolta CS2000A spectroradiometer (Konika Minolta,
categorical judgment was applied to the results in our colour-emotion experiment showing Nieuwegein, Netherlands) in the same position that the observers performing the visual
that there is a high correlation between some pairs of emotions whose meanings are more experiment (figure 1). Tristimulus values were computed assuming CIE64 standard
related to colour preference (Fresh-Rancid, Healthy-Unhealthy, Like-Dislike, Natural- observer. Three replicas of the measurements were made.
Artificial and Tasty-Insipid). Bitter-Sweet, Spicy-Non spicy, and Textured-Smootj are not
correlated with any other emotion. Finally, combining results from colour measurements
and colour-preferences we found that if the samples are too reddish their appearance tends
to generate a dislike emotion. Therefore, virgin olive oils with high CIELAB hue-angles
(greenish hues) seem to be the most appropriate ones to be enriched by these extracts from
microalgae.
1. INTRODUCTION
The amounts of carotenoids that are found in human tissues are almost exclusively
from dietary origin, mainly from fruits and vegetables, or from supplements. It has been
reported that the uptake of ß -carotene reduces the risk of age-related macular degeneration
(Teikari, J.M.: 1998). In addition, it has been shown that olive oil with extract from
microalgae known as Scenedesmus almeriensis brought changes in olive oils, quality,
composition, colour and stability giving. Therefore, olive oil with an addition of
microalgae extract could be a good convoy to improve and enhance the intake of Figure 1: Geometry of the colour measurement of the samples
carotenoids in a daily basis (Limon, P: 2015). Although this change in colour may not 20 Spanish observers were asked to describe each one of the samples following 9
change its taste or smell, the subjective perception of these factors can change (Zellner, pairs of opposite descriptors: Aromatic-Odourless, Bitter-Sweet, Fresh-Rancid, Healthy-
DA: 2003) and colour emotion techniques help to quantify the expectation of a product Unhealthy, Like-Dislike, Natural-Artificial, Spicy-Non spicy, Tasty-Insipid and Textured-
when it is perceived by human eye (Wei, S: 2014). Smooth. These 9 descriptors were obtained from 15 interviews to olive oil tasters, trying to
describe olive oil appearance in an appropriate way.
1069
AIC2015 TOKYO - Color and Image
For each pair they had to choose one of the descriptors and after that they had to
decide if that descriptor describe the oil as “a little”, “moderately” or “very”. For example,
an oil can be described as: moderately aromatic, a little bitter, very rancid, moderately
unhealthy, very dislike, very artificial, a little tasty and very textured. Each one of the
samples was shown to each observer 3 times, in the same conditions as it was measured by
the spectroradiometer, following a random order. A total of 1080 judgements were made
(20observers ×18 samples×3 replicas).
Torgerson’s law of Cathegorical Judgement was applied to the mean of the answers
of the observers. This law allow us to create psycophysical scales where each z score means
the intensity in which a stimulus is percieved inside that emotional scale.
3. RESULTS AND DISCUSSION
110
Fuenroble
75
(a) (b) Santuario Magina Oro Bailen
100
70 Castillo Canena 1 Castillo Canena 2
Melgarejo
90 65
60
80
55
70 Fuenroble
Santuario Magina 50
Oro Bailen
Castillo Canena 1
60 Castillo Canena 2
Melgarejo 45
-20 -10 0 10 20 0.00 0.10 0.21
a* Concentration (mg/ml)
Figure 2: Colour coordinates of the samples changing the concentration of microalgae
extract. (a) Plane a*b* (black arrow indicates direction of color change when extract
concentration is increased). (b) Lightness dependence with concentration.
Figure 2 shows results corresponding to colour measurements. In figure 2 we can see that
adding lutein and ß-carotene produced a decrease of lightness L* and b* coordinates and an
increase of a* coordinate. In Table 1 we have summarized colour change of the oils from
pure extra-virgin olive oil to oils with the 2 concentrations of microalgae extract. Second
and third columns in Table 1 indicate a high colour change, clearly perceptible by human
observers with normal coclor vision. Last column indicates that the colour change is mainly
due to a hue change. Combining data from Figure 2 and Table 1 we can conclude that
enriching the oils with lutein and ß-carotene extract makes the oils become more reddish
and darker. All the oils except Melgarejo (the greenest oil) undergo a color change from
yellow to yellowish-orange hues.
Table 1: Mean colour change from pure extra-virgin olive oils in CIELAB and CIEDE2000
units. Three last columns show percentage of change in Lightness, Chroma and Hue in
CIELAB units.
Change ΔE00 ΔEab %ΔL* %ΔC*ab %ΔH*ab
From 0.00 mg/ml to 0.10 mg/ml 10.5 18.8 12.4 10.7 76.9
From 0.00 mg/ml to 0.21 mg/ml 16.4 29.2 13.2 15.3 71.6
1070
AIC2015 TOKYO - Color and Image
b*
L*
For each pair they had to choose one of the descriptors and after that they had to
decide if that descriptor describe the oil as “a little”, “moderately” or “very”. For example, Results from visual experiment are summarized in Table 2. In this table we have
an oil can be described as: moderately aromatic, a little bitter, very rancid, moderately correlation coefficents between z scores of different emotions. We can see that there are a
unhealthy, very dislike, very artificial, a little tasty and very textured. Each one of the high correlation between Fresh-Rancid, Healthy-Unhealthy, Like-Dislike, Natural-
samples was shown to each observer 3 times, in the same conditions as it was measured by Artificial and Tasty-Insipid. That means that when an oil is perceived as Fresh it is
the spectroradiometer, following a random order. A total of 1080 judgements were made perceived also as Healthy, Natural and it likes. This result agrees with the meaning of these
(20observers ×18 samples×3 replicas). descriptors, all of them are related with preferences and can be interpreted as like-dislike.
Torgerson’s law of Cathegorical Judgement was applied to the mean of the answers The remaining emotions are descriptors that are related with taste and smell but for
of the observers. This law allow us to create psycophysical scales where each z score means observers who are not olive oils experts they do not give a value of preference to the oil.
the intensity in which a stimulus is percieved inside that emotional scale. Table 2: Correlation coefficient (r2) of z scores obtained from colour emotion
experiment. Yellow cells show correlation coefficients greater than 0.8.
3. RESULTS AND DISCUSSION Aromatic
Odourless
Bitter Bitter
110 0.02
(b) Fuenroble75 Sweet Sweet (a) Santuario Magina Oro Bailen
100 Castillo Canena 1 Fresh 0.68 0.06 Fresh 70 Castillo Canena 2
Melgarejo Rancid Rancid
90 65 Healthy 0.73 0.05 0.98 Healthy
60 Unhealthy Unhealthy
80 Like
55 0.71 0.04 0.96 0.98 Like
70 Fuenroble Dislike Dislike
Santuario Magina 50
Oro Bailen Natural
Castillo Canena 1 Artificial 0.73 0.03 0.98 0.99 0.98
Natural
60 Castillo Canena 2 45 Artificial Melgarejo
Spicy Spicy
-20 -10 0 10 20 0.00 0.10 0.21 0.00 0.66 0.19 0.19 0.16 0.16
a* Concentration (mg/ml) Non Spicy Non spicy
Tasty 0.87 0.00 0.83 0.87 0.86 0.86 0.05 Tasty
Figure 2: Colour coordinates of the samples changing the concentration of microalgae Insipid Insipid Textured
extract. (a) Plane a*b* (black arrow indicates direction of color change when extract Smooth 0.05 0.43 0.43 0.40 0.39 0.39 0.78 0.19
concentration is increased). (b) Lightness dependence with concentration.
Figure 2 shows results corresponding to colour measurements. In figure 2 we can see that Emotional responses corresponding to the pair of emotions Like-Dislike are plotted in
adding lutein and ß-carotene produced a decrease of lightness L* and b* coordinates and an Figure 3, in left axis we can check the z-score and in right axis we can see the linguistical
increase of a* coordinate. In Table 1 we have summarized colour change of the oils from meaning of the z-scores . The oils are percieved as less liked when the concentration of
pure extra-virgin olive oil to oils with the 2 concentrations of microalgae extract. Second microalgae additive increases for most of the samples, and this trend is very similar for the
and third columns in Table 1 indicate a high colour change, clearly perceptible by human emotions well correlated with Like-Dislike. If we add an additive that makes the oil more
observers with normal coclor vision. Last column indicates that the colour change is mainly reddish, the olive oil is percieved as less natural and it does not like. There is only one
due to a hue change. Combining data from Figure 2 and Table 1 we can conclude that exception, the oil Melgarejo follows an opposite trend to the other samples: when the
enriching the oils with lutein and ß-carotene extract makes the oils become more reddish concentration of lutein and ß-carotene increases, the emotion “like” increases. The
and darker. All the oils except Melgarejo (the greenest oil) undergo a color change from explanation to this behaviour can be explained with colour measurements (figure 2). This
yellow to yellowish-orange hues. sample is the only one in which its colour goes from a greenish colour to a yellower and the
Table 1: Mean colour change from pure extra-virgin olive oils in CIELAB and CIEDE2000 rest of the samples go towards a reddish colour.
units. Three last columns show percentage of change in Lightness, Chroma and Hue in
CIELAB units.
Change ΔE ΔE %ΔL* 00 ab %ΔC* *ab %ΔH ab
From 0.00 mg/ml to 0.10 mg/ml 10.5 18.8 12.4 10.7 76.9
From 0.00 mg/ml to 0.21 mg/ml 16.4 29.2 13.2 15.3 71.6
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b*
L*
2.5 A lot
2.0
Mo
1.5 derately
1.0
A
0.5 litlle
0.0
A l
-0.5 itlle
-1.0 M
Fuenroble ode
Santuario Magina ra-1.5 te Oro Bailen ly
Castillo Canena 1
-2.0 Castillo Canena 2 A lo
Melgarejo t
-2.5
0.00 0.10 0.21
Concentration (mg/ml)
Figure 3: Emotional responses for each sample in scale Like-Dislike. Right axis and
horizontal lines shows the linguistic term associated to each z score.
4. CONCLUSIONS
Colour measurements show that adding lutein and ß-carotene enriched extract from
microalga Scenedesmus almeriensis to extra virgin olive oils produces a change in colour
of the oils. That makes them decrease slightly in their chroma and lightness, and produces a
high decrease from greenish or yellow to reddish. The obtained colour differences are far
from a just-noticeable colour difference, the change in colour being clearly perceptible by
human eye.
From the studied descriptors by a colour-emotion experiment some of them are
highly correlated. The meaning of these emotions can be related to the terms Like-Dislike.
From the 6 studied oils there is only one that is liked more when we add extract from
microalgae, because it changes from green to yellow.
ACKNOWLEDGEMENTS
Research Project FIS2013-40661-P, Ministry of Economy and Competeteviness (Spain),
with European Regional Development Fund (ERDF).
REFERENCES
Limón, P., Malheiro R., Casal S., Acién-Fernández, F.G., Fernández-Sevilla, J.M.,
Rodrigues, N., Cruz, R. Bermejo R., and J.A. Pereira. 2015. Improvement of stability
and carotenoids fraction of virgin olive oils by addition of microalgae scenedesmus
almeriensis extracts. Food Chemistry 175 (0) (5/15): 203-11.
Ou, L.C., Luo M.R., Woodcock A., and A. Wright. 2004. A study of colour emotion and
colour preference. part I: Colour emotions for single colours. Color Research &
Application 29 (3): 232-40.
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z score
Like Dislike
Teikari, J. M., Rautalahti, M., Haukka, J., Jarvinen, P., Hartman, A. M., Virtamo, J.,
2.5 A Albanes, D., and O. Heinonen. 1998. Incidence of cataract operations in finnish male lot
2.0 smokers unaffected by alpha tocopherol or beta carotene supplements. Journal of
Mo
1.5 derate Epidemiology and Community Health 52 (7) (Jul): 468-72. ly
1.0
A
0.5 lit Wei, S.T., Ou, L. C., Luo, M. R., and J. B. Hutchings. 2014. Package design: Colour lle
0.0 harmony and consumer expectations. International Journal of Design 8 (1): 109-26.
A l
-0.5 itlle
Zellner, D. A., and P. Durlach. 2003. Effect of color on expected and experienced
-1.0 M
Fuenroble odera refreshment, intensity, and liking of beverages. American Journal of Psychology 116
-1.5 Santuario Magina te Oro Bailen ly
Castillo Canena 1
-2.0 Castillo Canena 2 A
(4): 633-47.
lo
Melgarejo t
-2.5
0.00 0.10 0.21
Concentration (mg/ml)
Address: Luis Gómez-Robledo, Department Optics, Faculty of Sciences, University of Granada, Severo Ochoa s/n, 18170 Granada, SPAIN
Figure 3: Emotional responses for each sample in scale Like-Dislike. Right axis and E-mails: luisgrobledo@ugr.es, pidilv@gmail.com, rbermejo@ujaen.es, mmelgosa@ugr.es
horizontal lines shows the linguistic term associated to each z score.
4. CONCLUSIONS
Colour measurements show that adding lutein and ß-carotene enriched extract from
microalga Scenedesmus almeriensis to extra virgin olive oils produces a change in colour
of the oils. That makes them decrease slightly in their chroma and lightness, and produces a
high decrease from greenish or yellow to reddish. The obtained colour differences are far
from a just-noticeable colour difference, the change in colour being clearly perceptible by
human eye.
From the studied descriptors by a colour-emotion experiment some of them are
highly correlated. The meaning of these emotions can be related to the terms Like-Dislike.
From the 6 studied oils there is only one that is liked more when we add extract from
microalgae, because it changes from green to yellow.
ACKNOWLEDGEMENTS
Research Project FIS2013-40661-P, Ministry of Economy and Competeteviness (Spain),
with European Regional Development Fund (ERDF).
REFERENCES
Limón, P., Malheiro R., Casal S., Acién-Fernández, F.G., Fernández-Sevilla, J.M.,
Rodrigues, N., Cruz, R. Bermejo R., and J.A. Pereira. 2015. Improvement of stability
and carotenoids fraction of virgin olive oils by addition of microalgae scenedesmus
almeriensis extracts. Food Chemistry 175 (0) (5/15): 203-11.
Ou, L.C., Luo M.R., Woodcock A., and A. Wright. 2004. A study of colour emotion and
colour preference. part I: Colour emotions for single colours. Color Research &
Application 29 (3): 232-40.
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z score
Like Dislike