UNIVERSIDAD DE JAÉN ESCUELA POLITÉCNICA SUPERIOR DE LINARES DEPARTAMENTO DE QUÍMICA FÍSICA Y ANALÍTICA TESIS DOCTORAL ACEITES DE OLIVA VÍRGENES EXTRA ENRIQUECIDOS CON NUEVOS ANTIOXIDANTES PROCEDENTES DE MICROALGAS. CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA, COLOMÉTRICA Y ENSAYOS DE ESTABILIDAD PRESENTADA POR: PIEDAD MARÍA LIMÓN VILLAREJO DIRIGIDA POR: DR. D. RUPERTO BERMEJO ROMÁN DR. D. MANUEL MELGOSA LATORRE JAÉN, 13 DE JULIO DE 2017 ISBN 978-84-9159-212-9 UNIVERSIDAD DE JAÉN Departamento de Química Física y Analítica ESCUELA POLITÉCNIA SUPERIOR DE LINARES TESIS DOCTORAL CON MENCIÓN INTERNACIONAL ACEITES DE OLIVA VÍRGENES EXTRA ENRIQUECIDOS CON NUEVOS ANTIOXIDANTES PROCEDENTES DE MICROALGAS. CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA, COLORIMÉTRICA Y ENSAYOS DE ESTABILIDAD. Piedad María Limón Villarejo Linares, 2017 D. RUPERTO BERMEJO ROMÁN D. MANUEL MELGOSA LATORRE CERTIFICAN: Que el trabajo desarrollado en la presente Memoria, con el título “ACEITES DE OLIVA VÍRGENES EXTRA ENRIQUECIDOS CON NUEVOS ANTIOXIDANTES PROCEDENTES DE MICROALGAS. CARACTERIZACIÓN FÍSICO-QUÍMICA, COLORIMÉTRICA Y ENSAYOS DE ESTABILIDAD”, que presenta Dª PIEDAD MARÍA LIMÓN VILLAREJO para optar al Grado de Doctora con Mención Internacional por la Universidad de Jaén, ha sido realizado bajo nuestra dirección en los laboratorios del Departamento de Química Física y Analítica, de la Escuela Politécnica Superior de Linares perteneciente a la Universidad de Jaén. Y para que así conste, firmamos el presente certificado en Linares, a 7 de Abril de 2017. Fdo.: Dr. D. Ruperto Bermejo Román Profesor Titular de Química Física Universidad de Jaén Fdo.: Dr. D. Manuel Melgosa Latorre Catedrático de Óptica Universidad de Granada Tesis Doctoral presentada por Dª Piedad María Limón Villarejo, Ingeniera Química Industrial, para optar al grado de Doctora con Mención Internacional por la Universidad de Jaén. La presente Memoria se enmarca en el Programa Oficial de Doctorado en Ciencias (Real Decreto 1393/2007) y muestra parte de los resultados dentro del Proyecto de Investigación titulado “Obtención de aceites de oliva enriquecidos en luteína de microalgas marinas para prevención de enfermedades degenerativas, caracterización físico-química y colorimétrica”, Proyecto de Investigación UJA2011/13/09 financiado por Caja Rural (Universidad de Jaén). Fdo.: Dª Piedad María Limón Villarejo Ingeniera Química Industrial ÍNDICES TESIS DOCTORAL ACEITES DE OLIVA VÍRGENES EXTRA ENRIQUECIDOS CON NUEVOS ANTIOXIDANTES PROCEDENTES DE MICROALGAS. CARACTERIZACIÓN FÍSICO- QUÍMICA, COLORIMÉTRICA Y ENSAYOS DE ESTABILIDAD. ÍNDICE GENERAL 1.- INTRODUCCIÓN. JUSTIFICACIÓN ........................................................................ 1 2.- ANTECEDENTES ................................................................................................... 5 2.1.- LAS MICROALGAS COMO FUENTE DE PRODUCTOS DE ALTO VALOR ......... 5 2.1.1.- Las microalgas frente a cultivos convencionales .................................... 8 2.1.2.- Aplicaciones ......................................................................................... 12 2.1.3.- Cultivo y producción de Scenedesmus almeriensis .............................. 22 2.2.- CAROTENOIDES-ANTIOXIDANTES ................................................................. 26 2.2.1.- Generalidades ...................................................................................... 26 2.2.2.- Importancia nutricional ......................................................................... 28 2.2.3.- Estabilidad en los alimentos ................................................................. 33 2.2.4.- Degeneración macular asociada a la edad ........................................... 34 2.2.5.- La luteína como agente antioxidante y preventivo ................................ 35 2.2.6.- Fuentes para la obtención de luteína y otros antioxidantes .................. 39 2.3.- EL ACEITE DE OLIVA VIRGEN ......................................................................... 42 2.3.1.- Antioxidantes presentes en el aceite de oliva virgen ............................. 44 2.3.1.1.- Compuestos Fenólicos ........................................................... 45 2.3.1.2.- Tocoferoles ............................................................................ 46 2.3.1.3.- Pigmentos .............................................................................. 47 2.3.2.- Importancia de la dieta mediterránea.................................................... 49 2.3.3.- Parámetros de calidad de los aceites de oliva ...................................... 50 2.3.4.- El color del aceite de oliva .................................................................... 53 2.4.- FUNDAMENTOS DE CIENCIA DEL COLOR ..................................................... 55 2.4.1.- Especificación del color ........................................................................ 55 2.4.2.- Espacios de color ................................................................................. 61 2.4.3.- Medida de la diferencia de color ........................................................... 67 2.4.4.- Emociones y preferencias suscitadas por el color ................................ 70 2.5.- FACTORES QUE INFLUYEN EN EL COLOR Y AFECTAN A LA PRESENCIA DE ANTIOXIDANTES EN EL ACEITE DE OLIVA ....................................................... 74 2.5.1.- Factores agronómicos .......................................................................... 75 2.5.1.1.- Factores agronómicos intrínsecos .......................................... 76 2.5.1.2.- Factores agronómicos extrínsecos ......................................... 78 3.- OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS ACEITES DE OLIVA VÍRGENES EXTRA ENRIQUECIDOS CON ANTIOXIDANTES..................................................... 84 3.1.- INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 84 3.2.- MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................... 84 3.2.1.-Microalga Scenedesmus almeriensis .................................................... 84 3.2.2.-Aceites de oliva vírgenes extra .............................................................. 85 3.2.3.-Extracción y purificación del extracto de antioxidantes .......................... 87 3.2.4.-Obtención de aceites enriquecidos con antioxidantes ........................... 89 3.2.5.-Caracterización del color de los AOVE´s ............................................... 92 3.3.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................... 92 3.3.1.- Extracción y purificación de antioxidantes ............................................ 92 3.3.2.- Obtención y caracterización colorimétrica de AOVE´s enriquecidos con antioxidantes ................................................................................................... 94 3.4.- CONCLUSIONES ............................................................................................. 103 4.- MEJORA DE LA ESTABILIDAD Y DE LA FRACCIÓN DE CAROTENOIDES EN ACEITES DE OLIVA VÍRGENES EXTRA MEDIANTE LA ADICIÓN DE EXTRACTOS PROCEDENTES DE LA MICROALGA SCENDESMUS ALMERIENSIS ................. 104 4.1.- INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 104 4.2.- MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................. 106 4.2.1.- Producción de la microalga Scenedesmus almeriensis ..................... 106 4.2.2.- Métodos de extracción ....................................................................... 106 4.2.3.- Preparación de las muestras de aceite de oliva ................................. 107 4.2.4.- Parámetros físicos y de calidad evaluados ......................................... 107 4.2.4.1.- Determinación de color ........................................................ 107 4.2.4.2.- Determinación de parámetros de calidad ............................. 108 4.2.5.- Determinación de los valores de p-anisidina....................................... 108 4.2.6.- Estabilidad oxidativa ........................................................................... 108 4.2.7.- Composición en ácidos grasos ........................................................... 108 4.2.8.- Composición en tocoferoles ............................................................... 109 4.2.9.- Composición de los pigmentos ........................................................... 110 4.2.10.- Análisis estadístico ........................................................................... 110 4.2.10.1.- Análisis de la varianza ........................................................ 110 4.2.10.2.- Análisis de los componentes principales (PCA) .................. 111 4.2.10.3.- Análisis discriminante lineal (LDA) ..................................... 111 4.3.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................... 112 4.3.1.- Parámetros de color ........................................................................... 112 4.3.2.- Parámetros de calidad ........................................................................ 113 4.3.3.- Perfil de ácidos grasos ....................................................................... 114 4.3.4.- Composición en tocoferoles ............................................................... 115 4.3.5.- Composición de pigmentos ................................................................ 115 4.3.6.- Estabilidad oxidativa ........................................................................... 116 4.3.7.- Discriminación de los aceites de oliva por la adición de extracto de Scenedesmus almeriensis ............................................................................ 117 4.3.8.- Incorporación de S. almeriensis y consumo de aceite de oliva ........... 118 4.4.- CONCLUSIONES ............................................................................................. 120 5.- ESTUDIOS DE ESTABILIDAD DE ACEITES DE OLIVA VÍRGENES EXTRA ENRIQUECIDOS CON ANTIOXIDANTES ............................................................... 127 5.1.- INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 127 5.2.- MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................. 128 5.3.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................... 131 5.3.1.- Estabilidad en función de la radiación incidente: foto-estabilidad ........ 131 5.3.2.- Estabilidad en función de la temperatura: termo-estabilidad ............... 136 5.3.3.- Estabilidad en función del tiempo: consumo preferente ...................... 139 5.3.4.- Estudios específicos de estabilidad .................................................... 140 5.3.4.1.- Foto-estabilidad en función del índice de maduración del fruto ........................................................................................................... 141 5.3.4.2.- Foto-estabilidad en función de la variedad del fruto ............. 143 5.3.4.3.- Termo-estabilidad en función del índice de maduración del fruto ........................................................................................................... 145 5.3.4.4.- Termo-estabilidad en función de la variedad del fruto .......... 147 5.4.- CONCLUSIONES ............................................................................................. 149 6.- EMOCIONES Y PREFERENCIAS DE COLOR EN ACEITES DE OLIVA VÍRGENES EXTRA ENRIQUECIDOS CON ANTIOXIDANTES. ESTUDIOS DE APRECIACIÓN VISUAL DE POBLACIONES ACOSTUMBRADAS O NO AL CONSUMO DE ACEITE DE OLIVA ......................................................................... 150 6.1.- INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 150 6.2.- MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................. 151 6.3.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................... 154 6.3.1.- Muestras usadas en el experimento de emociones de color ............... 154 6.3.2.- Variabilidad inter-observador e intra-observador ................................ 163 6.3.2.1.- Escalas emocionales ........................................................... 164 6.3.2.2.- Correlación entre diferentes emociones ............................... 166 6.3.2.3.- Dependencia entre valores z y cantidad de antioxidantes .... 168 6.4.- CONCLUSIONES ............................................................................................. 180 7.- CONCLUSIONES GENERALES ......................................................................... 181 8.- BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................... 184 9.- ANEXOS ............................................................................................................. 212 Anexo I ..................................................................................................................... 212 9.1.- ESTUDIOS DE ESTABILIDAD DE TODOS LOS ACEITES ENSAYADOS ....... 212 9.1.1.- Estabilidad en función de la radiación electromagnética: foto-estabilidad . ...................................................................................................................... 212 9.1.2.- Estabilidad en función de la temperatura: termo-estabilidad ............... 224 9.1.3.- Estabilidad en función del tiempo: consumo preferente ...................... 238 9.2.- ESTUDIOS ESPECÍFICOS DE ESTABILIDAD DE TODOS LOS ACEITES ENSAYADOS ........................................................................................................... 245 9.2.1.- Foto-estabilidad en función del índice de maduración del fruto.......... 245 9.2.2.- Foto-estabilidad en función de la variedad del fruto ............................ 249 9.2.3.- Termo-estabilidad en función del índice de maduración del fruto ....... 255 9.2.4.- Termo-estabilidad en función de la variedad del fruto ......................... 259 Anexo II .................................................................................................................... 264 9.3.- EXPERIMENTO DE EMOCIONES SUSCITADAS POR EL COLOR ................ 264 9.3.1.- Resultados con población acostumbrada al consumo de aceite de oliva .. ...................................................................................................................... 266 9.3.2.- Resultados con población no acostumbrada al consumo de aceite de oliva ......................................................................................................................... 286 10.- SUMMARY ........................................................................................................ 294 11.- PUBLICACIONES Y COMUNICACIONES ........................................................ 336 Índice de Ecuaciones ÍNDICE DE ECUACIONES Página Ecuación 2.1 Expresión para calcular los valores triestímulo X ................................................ 63 Ecuación 2.2 Expresión para calcular los valores triestímulo Y ................................................ 63 Ecuación 2.3 Expresión para calcular los valores triestímulo Z ................................................ 63 Ecuación 2.4 Expresión para calcular coordenadas de motricidad en x ................................... 63 Ecuación 2.5 Expresión para calcular coordenadas de motricidad en y ................................... 63 Ecuación 2.6 Expresión para calcular el valor del croma ∗ .................................................... 66 Ecuación 2.7 Expresión para calcular el valor del ángulo del tono ..................................... 66 Ecuación 2.8 Expresión para calcular la diferencia de color en CIELAB .................................. 68 Ecuación 2.9 Otra expresión para calcular la diferencia de color en CIELAB ........................... 68 Ecuación 2.10 Expresión para calcular la diferencia de tono H*ab .......................................... 68 Ecuación 2.11 Expresión correspondiente a la emoción “fuerte-débil” ..................................... 72 Ecuación 3.1 Cálculo de los µl de extracto que hay que añadir a los AOVE´s para conseguir una concentración de 0,05 mg luteína/ml aceite en los estudios de foto-estabilidad ........................ 91 Ecuación 3.2 Cálculo de los µl de extracto que hay que añadir a los AOVE´s para conseguir una concentración de 0,1 mg luteína/ml aceite en los estudios de foto-estabilidad .......................... 91 Ecuación 4.1 Expresión para calcular la diferencia de color en CIELAB ................................ 107 Ecuación 4.2 Expresión para calcular el índice de amarilleamiento YI ................................... 107 Ecuación 5.1 Cálculo de los µl de extracto que hay que añadir a los AOVE´s para conseguir una concentración de 0,05 mg luteína/ml aceite en los estudios de termo-estabilidad ................... 130 Ecuación 5.2 Cálculo de los µl de extracto que hay que añadir a los AOVE´s para conseguir una concentración de 0,1 mg luteína/ml aceite en los estudios de termo-estabilidad ..................... 130 Índice de Figuras ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 2.1 Estructura del retinol ................................................................................................. 29 Figura 2.2 Estructura del β-caroteno .......................................................................................... 30 Figura 2.3 Estructura química de la luteína ................................................................................ 36 Figura 2.4 Espectro electromagnético ........................................................................................ 56 Figura 2.5 Rueda del color ......................................................................................................... 58 Figura 2.6 Diferentes representaciones de los atributos del color en el sólido de color. ........... 60 Figura 2.7 Representación de las 40 cartas o tonos (Hue) del atlas Munsell ............................ 60 Figura 2.8 Diagrama de cromaticidad CIE x, y basado en el espacio de color XYZ ................. 64 Figura 2.9 Espacio de color CIELAB y Plano CIELAB ............................................................... 65 Figura 2.10 Vista del espacio de color L*a*b* ............................................................................ 66 Figura 2.11 Parámetros del espacio de color L* C* h ............................................................... 67 Figura 2.12 Diferencias de color en el espacio L*a*b* ............................................................... 69 Figura 2.13 Términos para describir diferencias de color en claridad y croma CIELAB............ 69 Figura 3.1 Coordenadas CIELAB de los 15 AOVE’s ................................................................. 86 Figura 3.2 Cromatogramas del AOVE “C”. ................................................................................. 90 Figura 3.3 Representación del % de luteína recuperada frente al nº de extracciones .............. 93 Figura 3.4 Cambios de color en el plano a*b* para los 4 aceites considerando diferentes adiciones de extracto ................................................................................................................................... 96 Figura 3.5 Evolución del color de los 4 aceites con diferentes adiciones de extracto, en el plano CIELAB con coordenadas ángulo de tono y claridad.................................................................. 97 Índice de Figuras Figura 3.6 Evolución del color de los 4 aceites con diferentes adiciones de extracto, en el plano CIELAB con coordenadas ángulo de tono y croma .................................................................... 98 Figura 3.7 Diferencias de color CIELAB en 4 AOVE´s en función del enriquecimiento con extracto de antioxidantes de los mismos ................................................................................................ 100 Figura 4.1 Diferencias de color (ΔE*ab) y el índice de amarilleamiento (YI) de los AOVE´s .... 121 Figura 4.2 Contenido en β-caroteno, luteína y estabilidad oxidativa de los AOVE´s............... 122 Figura 4.3 Análisis del PCA y LDA de los AOVE´s .................................................................. 123 Figura 5.1 Distribución espectral de potencia de la fuente de luz ultravioleta de la cabina Verivide CAC 60 ...................................................................................................................................... 129 Figura 5.2 Diferencias de color CIELAB producidas en AOVE´s sin enriquecer, como consecuencia de exposición continua a luz ultravioleta ........................................................... 132 Figura 5.3 Diferencias de color CIELAB producidas en AOVE´s enriquecidos con extracto de antioxidantes de concentración 0,05 mg luteína/ml .................................................................. 133 Figura 5.4 Diferencias de color CIELAB producidas en AOVE´s enriquecidos con extracto de antioxidantes de concentración 0,1 mg luteína/ml .................................................................... 133 Figura 5.5 Foto-estabilidad del AOVE “B” (Santuario de Mágina) bajo condiciones de iluminación controlada con lámpara ultravioleta .......................................................................................... 134 Figura 5.6 Foto-estabilidad del AOVE “C” (Oro Bailén) bajo condiciones de iluminación controlada con lámpara ultravioleta ............................................................................................................ 135 Figura 5.7 Diferencias de color CIELAB de los AOVE´s sin enriquecer en función del tiempo de calentamiento a 120 ºC ............................................................................................................. 136 Figura 5.8 Diferencias de color CIELAB de los 5 AOVE´s enriquecidos con extracto de antioxidantes (0,05mg luteína/ml), en función del tiempo de calentamiento a 120 ºC ............. 137 Figura 5.9 Diferencias de color CIELAB de los 5 AOVE´s enriquecidos con extracto de antioxidantes (0,1mg luteína/ml), en función del tiempo de calentamiento a 120 ºC ............... 137 Figura 5.10 Diferencias de color CIELAB en el AOVE “L” ....................................................... 138 Índice de Figuras Figura 5.11 Estabilidad temporal de 5 AOVE´s bajo condiciones de almacenamiento seco, en oscuridad y a temperatura ambiente (20 ºC) (Datos sin enriquecer) ........................................ 139 Figura 5.12 Estabilidad temporal de 5 AOVE´s bajo condiciones de almacenamiento seco, en oscuridad a temperatura ambiente (20 ºC) (0,05 mg luteína/ml) .............................................. 140 Figura 5.13 Foto-estabilidad de los AOVE´s “CCP”, procedentes de frutos con 3 grados distintos de maduración (Datos sin enriquecer) ...................................................................................... 141 Figura 5.14 Foto-estabilidad de los AOVE´s “CCP”, procedentes de frutos con 3 grados distintos de maduración (0,05 mg luteína/ml) ......................................................................................... 142 Figura 5.15 Foto-estabilidad de los AOVE´s procedentes de frutos de 4 variedades diferentes (Datos sin enriquecer) ............................................................................................................... 143 Figura 5.16 Foto-estabilidad de los AOVE´s procedentes de frutos de 4 variedades diferentes (0,05 mg luteína/ml) .................................................................................................................. 144 Figura 5.17 Termo-estabilidad de los AOVE´s “CCP”, procedentes de frutos con 3 grados distintos de maduración (Datos sin enriquecer) ..................................................................................... 145 Figura 5.18 Termo-estabilidad de los AOVE´s “CCP”, procedentes de frutos con 3 grados distintos de maduración (0,05 mg luteína/ml) ......................................................................................... 146 Figura 5.19 Termo-estabilidad de los AOVE´s procedentes de frutos de 4 variedades diferentes (Datos sin enriquecer) ............................................................................................................... 147 Figura 5.20 Termo-estabilidad de los AOVE´s procedentes de frutos de 4 variedades diferentes (0,05 mg luteína/ml) .................................................................................................................. 148 Figura 6.1 Evolución del color con las dos adiciones de extracto de antioxidantes para cada una de las 6 muestras de aceite ...................................................................................................... 157 Figura 6.2a Cambios de claridad descritos mediante la coordenada CIELAB L* .................... 158 Figura 6.2b Cambios de croma descritos mediante la coordenada CIELAB C*ab. .................. 158 Figura 6.2c Cambios de tono descritos mediante la coordenada CIELAB hab ....................... 159 Índice de Figuras Figura 6.3a Diferencias de color para cada uno de los 6 aceites en los procesos A-B y A-C, en unidades CIELAB (E*ab) .......................................................................................................... 161 Figura 6.3b % promedios de cambio en claridad (%L*), croma (%C*ab) y tono (%H*ab) CIELAB de los AOVE´s con una primera adición de extracto (proceso A-B) ......................................... 162 Figura 6.3c % promedios de cambio en claridad (%L*), croma (%C*ab) y tono (%H*ab) CIELAB de los AOVE´s con una segunda adición de extracto (proceso A-C) ....................................... 162 Figura 6.4 Representación de los valores de frontera calculados para las 9 escalas emocionales y los 2 grupos de observadores (acostumbrados y no acostumbrados) ..................................... 166 Figura 6.5 Resultados promedio (valores z) para la emoción “Inodoro/Aromático” en los sujetos acostumbrados y no acostumbrados ........................................................................................ 169 Figura 6.6 Resultados promedio (valores z) para la emoción “Dulce/Amargo” en los sujetos acostumbrados y no acostumbrados ........................................................................................ 170 Figura 6.7 Resultados promedio (valores z) para la emoción “Rancio/Fresco” en los sujetos acostumbrados y no acostumbrados ........................................................................................ 172 Figura 6.8 Resultados promedio (valores z) para la emoción “No saludable/Saludable” en los sujetos acostumbrados y no acostumbrados ............................................................................ 173 Figura 6.9 Resultados promedio (valores z) para la emoción “No gusta/Gusta” en los sujetos acostumbrados y no acostumbrados ........................................................................................ 175 Figura 6.10 Resultados promedio (valores z) para la emoción “Artificial/Natural” en los sujetos acostumbrados y no acostumbrados ........................................................................................ 176 Figura 6.11 Resultados promedio (valores z) para la emoción “No picante/Picante” en los sujetos acostumbrados y no acostumbrados ........................................................................................ 177 Figura 6.12 Resultados promedio (valores z) para la emoción “Suave/Áspero” en los sujetos acostumbrados y no acostumbrados ........................................................................................ 178 Figura 6.13 Resultados promedio (valores z) para la emoción “Insípido/Sabroso” en los sujetos acostumbrados y no acostumbrados ........................................................................................ 179 Índice de Imágenes ÍNDICE DE IMÁGENES Página Imagen 2.1 Imágenes de las microalgas Spirulina y Chlorella ..................................................... 6 Imagen 2.2 Diferentes fotobiorreactores utilizados para el cultivo de microalgas ..................... 11 Imagen 2.3 Matraces de mantenimiento y precultivo de la microalga ....................................... 23 Imagen 2.4 Fotobiorreactores tubulares empleados para la producción de biomasa de la microalga Scenedesmus almeriensis. ......................................................................................................... 24 Imagen 2.5 Imagen de la biomasa liofilizada de Scenedesmus almeriensis ............................. 25 Imagen 2.6 Cambios que provoca la degeneración macular senil (DMAE) en la retina y sus correspondientes consecuencias en la visión humana ............................................................... 37 Imagen 2.7 Algunos productos comerciales basados en luteína. .............................................. 38 Imagen 2.8 Flor de Marigold o caléndula (Tagetes erecta) ........................................................ 40 Imagen 3.1 Imágenes de S. almeriensis tomadas mediante microscopio óptico y electrónico. 85 Imagen 3.2 Algunos de los AOVE´s empleados en las experiencias de enriquecimiento en antioxidantes: G, B, H y E ........................................................................................................... 87 Imagen 3.3 Esquema global para la obtención del extracto de antioxidantes ........................... 88 Imagen 3.4 Extracto de antioxidantes (2,3 mg/ml de luteína) en AOVE tras la eliminación de disolvente en rotavapor ............................................................................................................... 88 Imagen 5.1 Muestras de aceites irradiadas en la cabina de control de iluminación CAC 60 Verivide y detalle de la fuente de luz ultravioleta de dicha cabina .......................................................... 129 Imagen 5.2 Muestras de AOVE´s sometidas a 120 ºC en un baño termostático y detalle del termostato .................................................................................................................................. 130 Imagen 6.1 Detalle de una de las botellas utilizadas para el experimento de emociones suscitadas por el color de los AOVE´s ........................................................................................................ 153 Índice de Tablas ÍNDICE DE TABLAS Página Tabla 2.1 Superficie de terreno necesaria para producir 1 kg de proteína .................................. 8 Tabla 2.2 Agua necesaria para producir 1 kg de proteína ........................................................... 9 Tabla 2.3 Comparación de la composición de alimentos y microalgas ...................................... 14 Tabla 2.4 Aminoácidos esenciales del huevo entero, caseína y algunas especies de microalgas. (Valores en g por 100 g de proteína) .......................................................................................... 15 Tabla 2.5 Composición del medio Mann & Myers (1968) ........................................................... 23 Tabla 2.6 Distribución de carotenoides mayoritarios presentes en diversos alimentos ............. 27 Tabla 2.7 Contenido en luteína de algunas microalgas a nivel de laboratorio y escala semi- industrial ...................................................................................................................................... 41 Tabla 2.8 Composición de la microalga Scenedesmus almeriensis .......................................... 42 Tabla 2.9 Composición del aceite de oliva virgen ...................................................................... 44 Tabla 3.1 AOVE´s utilizados en las experiencias de enriquecimiento con extracto de antioxidantes procedente de la microalga S. almeriensis ................................................................................. 86 Tabla 3.2 Parámetros colorimétricos en la adición de extracto de antioxidantes sobre el AOVE “Santuario de Mágina” ................................................................................................................. 95 Tabla 3.3 Parámetros colorimétricos en la adición de extracto de antioxidantes sobre el AOVE “Hojiblanca”. ................................................................................................................................ 99 Tabla 3.4 Parámetros colorimétricos en la adición de extracto de antioxidantes sobre el AOVE “Carbonell” ................................................................................................................................... 99 Tabla 3.5 Parámetros colorimétricos en la adición de extracto de antioxidantes sobre el AOVE “Melgarejo” ................................................................................................................................ 100 Índice de Tablas Tabla 3.6 Parámetros colorimétricos de los AOVE´s originales y enriquecidos con luteína (0,1 mg/ml) ........................................................................................................................................ 102 Tabla 4.1 Parámetros de calidad, valor de p-anisidina, índice de TOTOX, y parámetros de color (a* b* y L*) de los AOVE´s sin (I) y con extracto de S. almeriensis ................................................ 124 Tabla 4.2 Composición detallada de ácidos grasos expresada en (g/100 g de ácidos grasos) de los AOVE´s sin (I) y con extracto de S. almeriensis ....................................................................... 125 Tabla 4.3 Composición de tocoferoles expresada en (mg/kg de aceite de oliva) de AOVE´s sin (I) y con extracto de S. almeriensis .................................................................................................. 126 Tabla 6.1 Coordenadas de color CIELAB (fuente D65, observador patrón CIE 1964) correspondientes a los seis AOVE´s originales (A) y sus dos adiciones de extracto de antioxidantes para obtener concentraciones de 0,05 mg/ml (B) y 0,1 mg/ml (C) ..................... 155 Tabla 6.2 Desviaciones típicas de las coordenadas CIELAB correspondientes a las tres medidas espectrorradiométricas de color realizadas para cada muestra, cuyos resultados promedio aparecen en la Tabla 6.1 ........................................................................................................... 156 Tabla 6.3 Cambios de color entre aceites puros (A), y con adiciones de extracto para lograr concentraciones de luteína de 0,05 mg/ml (B) y 0,1 mg/ml (C), en unidades CIEDE2000 (E00) y CIELAB (E*ab) .......................................................................................................................... 160 Tabla 6.4 Resultados de variabilidad inter-observador e intra-observador para las 9 emociones consideradas y los dos grupos de observadores participantes en nuestro experimento ........ 164 Tabla 6.5 Valores (Bi) para cada emoción en sujetos con tradición en el uso de AOVE´s y sin ella ............................................................................................................................................. 165 Tabla 6.6 Coeficientes de correlación de Pearson (r) obtenidos mediante los valores z para cada emoción y grupo de sujetos ...................................................................................................... 167 Abreviaturas ABREVIATURAS AIC: Asociación Internacional del Color AMD: Age Macular Degeneration ANOVA: Analysis of Variance AOVE: Aceite de oliva virgen extra CCA: Aceite de oliva virgen extra “Castillo de Canena” de la variedad Arbequina CCF: Aceite de oliva virgen extra “Castillo de Canena” de la variedad Frantoio CCP: Aceite de oliva virgen extra “Castillo de Canena” de la variedad Picual CCR: Aceite de oliva virgen extra “Castillo de Canena” de la variedad Royal CDC: Center for Disease Control and Prevention CE: Color Emotion CEE: Comunidad Económica Europea CIE: Commission Internationale de l'Éclairage CIELAB: Espacio de color L*a*b* COI: Comité Oleícola Internacional CSIC: Consejo Superior de Investigaciones Científicas DMAE: Degeneración Macular Asociada a la Edad DOP: Denominación de Origen Protegida EFA: Essential Fatty Acids e.g: exempli gratia (for example, for instance), por ejemplo EUFIC: European Food Information Council EVOO: Extra Virgin Olive Oil FA: Free Acidity Abreviaturas FAO: Food and Agriculture Organization FR: Aceite de oliva virgen extra: Fuenroble HDL: High Density Lipoproteins HPLC: High Performance Liquid Chromatography IM: Índice de Madurez LDA: Linear Discriminant Analysis LDL: Low Density Lipoproteins MUFA: Monounsaturated fatty acids OB: Aceite de oliva virgen extra: Oro Bailén OECD: Organisation for Economic Co-operation and Development OG: Aceite de oliva virgen extra: Oro de Génave p-AV: Para-anisidina PC: Principal Component PCA: Principal Component Analysis PUFA: Polyunsaturated Fatty Acids PV: Peroxide Value RMSE: Root-mean-square error (error cuadrático medio) SCOTDIC: Textile Color System SFA: Saturated Fatty Acids T: Tonelada métrica UV: Ultravioleta VIH: Virus Inmunodeficiencia Humana YI: Yellowness index 1. INTRODUCCIÓN. JUSTIFICACIÓN 1.- Introducción. Justificación Tesis Doctoral 1 1.-INTRODUCCIÓN. JUSTIFICACIÓN Actualmente existe un interés creciente en el desarrollo de alimentos funcionales, que son aquellos capaces de proporcionar efectos beneficiosos para la salud, adicionalmente a su valor nutritivo o energético. Estos productos, son usualmente alimentos tradicionales enriquecidos en uno o varios componentes, que ejercen o promueven un efecto beneficioso para la salud humana. El interés por los carotenoides ha crecido recientemente en base a estudios que sugieren el efecto protector que resulta de una ingesta adecuada de estos compuestos en la prevención y evolución de enfermedades degenerativas humanas, entre las que destacan las de tipo oftalmológico y dermatológico. En la actualidad no existen fármacos que puedan corregir estas enfermedades, por lo que la única estrategia viable es la prevención de las mismas. Sin embargo, la dosis de carotenoides recomendada para grupos de riesgo, difícilmente puede ser cubierta por modificaciones en la dieta. Por este motivo una de las vías de prevención con mejores perspectivas, es la ingesta de alimentos enriquecidos en antioxidantes. Por otro lado, es bien conocido que el aceite de oliva posee, debido a su composición química, importantes propiedades que lo hacen un alimento muy saludable y recomendado, presentando además un alto factor de digestibilidad, parámetro muy importante en alimentación. Son muchos los trabajos científicos que avalan la importancia de su incorporación en una dieta equilibrada, mostrando efectos muy beneficiosos para la salud, entre los que se pueden citar: reducción del nivel del colesterol; disminución del riesgo de infarto y de trombosis arteriales; eficacia en la lucha contra úlceras, gastritis y acidez en general; regulación del tránsito intestinal y estimulación del crecimiento óseo y prevención de muchas enfermedades degenerativas humanas. El aceite de oliva virgen extra es un alimento muy equilibrado que está constituido por una gran variedad de moléculas: compuestos hidrocarbonados, esteroles, compuestos diterpénicos y triterpénicos, alcoholes alifáticos, tocoferoles, pigmentos, clorofilas y carotenoides. Dentro de la familia de los carotenoides, la luteína y el β-caroteno, se encuentran en cantidades muy pequeñas en el aceite de oliva en su composición original, estando por debajo de los valores recomendados para la prevención de enfermedades 1.- Introducción. Justificación Tesis Doctoral 2 degenerativas humanas (por ejemplo, la Degeneración Macular Senil, DMAE). Sin embargo, es importante resaltar que por sus características y por contener pequeñas cantidades de estos carotenoides, el aceite de oliva podría constituir un medio adecuado de transporte de éstos, pues aumentar la concentración de componentes previamente existentes, no debe generar problemas de estabilidad severos, hecho que sí podría ocurrir al tratar de añadir compuestos químicos totalmente ajenos al medio receptor. En el estado actual de las investigaciones sobre el papel de antioxidantes como la luteína en la prevención de la DMAE, una de las principales preocupaciones es determinar en qué medida es digerida y adsorbida la luteína suministrada por las diferentes fuentes dietarias (estudios de digestibilidad-bioaccesibilidad). Esta preocupación se extiende a los extractos comerciales que actualmente se usan en los complementos nutricionales que contienen luteína. En este sentido, sólo productos de digestibilidad conocida y adecuada son útiles como aporte de luteína en la dieta humana. Más aún, únicamente productos de digestibilidad conocida serán útiles en futuros estudios del papel de la luteína en la prevención de enfermedades como las oculares. Así, existen trabajos que describen estudios realizados in vitro, en los que se pone de manifiesto que las matrices alimenticias ricas en grasas, como son el aceite de oliva y otras similares, pueden facilitar y/o beneficiar el proceso de bioasimilación de este tipo de carotenoides (Rangaswamy et al., 2007; Granado et al., 2009, 2010; Nidhi y Baskaran, 2011). También hay estudios de degradación térmica de carotenoides en aceites de oliva y similares, que pueden afectar a las propiedades físico-químicas y de coloración de los aceites y por tanto a su apariencia y aceptabilidad por el consumidor (Aparicio et al., 2011). En una patente previa, se ha propuesto la incorporación al aceite de oliva de diferentes carotenoides mediante el uso de la flor de Marigold (European Patent, 2006). En este contexto, la presente Memoria de Tesis Doctoral tiene por objetivo principal la obtención de nuevos alimentos funcionales basados en aceites de oliva vírgenes extra, enriquecidos con antioxidantes procedentes de microalgas marinas, para la prevención de enfermedades degenerativas asociadas al déficit de antioxidantes. Así, se ha puesto a punto la metodología necesaria para la obtención de extractos de carotenoides procedentes de la microalga marina Scenedesmus almeriensis (especie rica en luteína y β-caroteno), que han sido utilizados para enriquecer con carotenoides diferentes tipos de AOVE´s. Estos aceites constituyen un potencial medio para la incorporación de carotenoides en las dosis adecuadas al organismo humano, a través de un alimento tan importante y característico de la dieta mediterránea. 1.- Introducción. Justificación Tesis Doctoral 3 Por tanto, se persigue dotar a los aceites de un valor añadido superior al que ya de por sí tienen y se ha comprobado que el enriquecimiento con antioxidantes, mejora las características de estabilidad de los aceites frente a variables típicas de degradación en los alimentos, como son la exposición a la luz, la temperatura y el paso del tiempo. Los aceites de oliva vírgenes extra enriquecidos con carotenoides, se han caracterizado físico-químicamente, para conocer todos sus parámetros y así poder evaluar el efecto de la mejora de la fracción antioxidante en los mismos. Inicialmente se ha evaluado la concentración de carotenoides más idónea a alcanzar en los aceites ensayados realizando diferentes experimentos en los que se ha ido aumentando progresivamente la cantidad de extracto de antioxidantes adicionado. Posteriormente, los aceites enriquecidos en los nuevos antioxidantes han sido sometidos a diferentes caracterizaciones de tipo físico-químico para compararlos con los mismos aceites sin enriquecer, los cuales han sido usados como control. Así, se ha realizado un completo análisis de parámetros químicos: referentes a la calidad de los aceites (acidez libre, compuestos de oxidación primaria y secundaria, índice de peróxidos, K232, K270, p-anisidina,..), referentes a la propia composición (perfil de ácidos grasos, tocoferoles, pigmentos,….) y parámetros referentes a la bioactividad (compuestos fenólicos totales, DPPH y ABTS). En lo que se refiere a estudios de tipo físico, se han realizado monitorizaciones midiendo el color de aceites, que han permitido obtener información sobre la estabilidad de las muestras frente a las principales variables de degradación comentadas: el tiempo, la temperatura y la exposición a la luz. Adicionalmente, se ha estudiado la estabilidad de los aceites enriquecidos en función del índice de maduración del fruto y de la variedad del mismo. Otra parte de esta Memoria se ha dedicado a los estudios de emociones suscitadas por el color de las muestras y los cambios de color que sufren los aceites cuando son enriquecidos con antioxidantes. Así, se pretende conocer si estos cambios de color son aceptados y en qué medida, por los potenciales consumidores, aspecto muy importante si se quiere abordar el desarrollo industrial de la idea de negocio fundamentada en la obtención y comercialización de estos nuevos alimentos funcionales basados en aceites de oliva. Estos resultados, apoyan la idea de poder utilizar el aceite de oliva virgen extra como medio de incorporación en el organismo de las cantidades necesarias de 1.- Introducción. Justificación Tesis Doctoral 4 carotenoides, dotando al aceite de oliva de un valor añadido superior al que ya tiene de por sí y ofrecer una alternativa diferente a las actuales, en la lucha contra determinadas enfermedades degenerativas humanas. Finalmente, es importante resaltar la aplicabilidad de los resultados obtenidos, la cual produciría una línea de aceites de oliva enriquecidos con nuevos antioxidantes que vendría a sumar, tanto en estrategias de lucha contra enfermedades degenerativas humanas, así como en el desarrollo del tejido industrial y social de nuestro entorno. 2. ANTECEDENTES 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 5 En este capítulo se va a realizar un resumen del estado del arte en los principales temas que se han trabajado durante la elaboración de esta Tesis Doctoral. Así, en cada apartado se realizará una breve introducción y se notarán las investigaciones precedentes que se han tenido en cuenta a la hora de dirigir el curso de la investigación realizada. 2.1.- LAS MICROALGAS COMO FUENTE DE PRODUCTOS DE ALTO VALOR Las microalgas son microorganismos unicelulares fotoautótrofos, capaces de obtener energía de la radiación luminosa y de sintetizar sus biomoléculas a partir de dióxido de carbono y agua. Han colonizado casi todos los hábitats conocidos, aunque la mayor parte se han adaptado mejor al ambiente acuático, tanto marino como dulceacuícola. Así, los mares y los océanos contienen grandes cantidades de microalgas, estimándose que el 40% de la fotosíntesis total del planeta es realizada por estos microorganismos acuáticos, siendo claves en la dinámica del dióxido de carbono en la tierra y constituyendo la base de las cadenas tróficas (Muller y Tobin, 1986). En la actualidad representan un recurso poco explorado, ya que, de las más de 30.000 especies descritas, solo unas 50 han sido estudiadas con detalle desde el punto de vista fisiológico y bioquímico, y menos de 10 están siendo explotadas comercialmente. Los primeros estudios científicos sobre el cultivo de microalgas datan de 1890, cuando el microbiólogo holandés Beijerinck establece cultivos puros de la microalga de agua dulce Chlorella vulgaris. El primer trabajo sistemático sobre estos microorganismos, en el que se trasladaban métodos y datos de laboratorio a especificaciones ingenieriles, se realizó en la Universidad de Standford (California, 1948-1950) utilizando Chlorella como especie de cultivo. En esta misma época ya surgen en Alemania las primeras plantas de producción comercial de microalgas, en las que se producían diatomeas bajo condiciones controladas (Harder y Von Witsch, 1942). Sin embargo, la producción comercial a gran escala comenzó a principios de los sesenta cuando se comercializó Chlorella como alimento dietético en Japón y Taiwán (Tsukada et al., 1997). Paralelamente al establecimiento de los primeros procesos industriales de producción de Chlorella, otras microalgas eran también cultivadas a gran escala en diversas partes del mundo, como es el caso de Spirulina en el lago Texcoco (México), cuya producción era llevada a cabo por Sos Texcoco S.A. (Durand-Chastel, 1980). Desde entonces han surgido numerosas empresas de producción de microalgas llegando 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 6 actualmente a una producción de más de 10.000 T, principalmente de Spirulina y Chlorella (Imagen 2.1), pero también de otras especies como Dunaliella, Haematococcus y Nannochloropsis, entre otras (Spolaore, 2006). Las microalgas pueden cultivarse en reactores a gran escala bajo condiciones controladas, y su elevada velocidad de crecimiento permite obtener grandes productividades (Pulz y Scheibenbogen, 1998). El carbono fijado por las microalgas es incorporado a proteínas, carbohidratos y lípidos, de forma que a partir de la biomasa microalgal se puede obtener una gran diversidad de productos químicos (Kishimoto et al., 1994; Yanagi et al., 1995). Debido a estas razones, los procesos basados en el uso de microalgas están recibiendo un interés creciente y hoy en día se siguen investigando. Uno de los aspectos más interesantes en el campo de la biotecnología de microalgas es la explotación de la capacidad de las microalgas para generar biomasa constituida por biomoléculas complejas como vitaminas, enzimas y sustancias bioactivas de elevado valor comercial (Arad y Yaron, 1992; Apt y Behrens, 1999; Shimizu, 2000; Shi et al., 2002). Además, muchas de las moléculas que generan son específicas y no pueden ser sintetizadas por otros organismos o plantas superiores (Richmond, 1990; Bajpai y Bajpai, 1993; De la Noue y De Pauw, 1998). Spirulina Chlorella Imagen 2.1 Imágenes de las microalgas Spirulina y Chlorella. Derivado de esta composición tan rica de las microalgas, sus principales aplicaciones se centran en la alimentación humana, nutrición animal, y la obtención de compuestos de interés como carotenoides, ácidos grasos, etc. El consumo de microalgas como alimento humano se ha practicado desde antiguo, y se encuentra extendido por todo el mundo. Se tiene constancia del consumo de un tipo de algas verde-azuladas del 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 7 género Nostoc (Nostoc pruriforme y Nostoc comune) desde las primeras civilizaciones aztecas en Sudamérica. Los antiguos nativos del lago salado de Chad (África central) utilizaron la microalga Spirulina de forma regular en su alimentación. Este consumo se ha dado principalmente en especies resistentes a condiciones ambientales extremas, lo que permitía la proliferación de elevadas concentraciones en zonas geográficas determinadas, como la acumulación de Spirulina en el lago Chad (África) o en Maracaibo (Venezuela). Hoy día, las microalgas más extensamente cultivadas para fines alimenticios son especies de Spirulina y Chlorella. La microalga Spirulina se vende como alimento dietético o funcional, y se ha utilizado como alimento de alto valor proteico en México y África central. Los mayores productores de Spirulina para consumo humano son China, Taiwán, Estados Unidos, Tailandia, Japón e Israel. La microalga Chlorella se comercializa como preparado multivitamínico en Japón y Taiwán, y como alimento dietético en otros países occidentales. En cuanto a la nutrición animal, las microalgas son una importante fuente alimenticia y de aditivos en la cría comercial de muchas especies acuáticas, especialmente de larvas y rotíferos. Estos últimos son empleados en la crianza de crustáceos y peces, aunque existen otras alternativas a las algas como las levaduras y los alimentos microencapsulados (Jones et al., 1987; Heras et al., 1994; Nell et al., 1996). El cultivo de microalgas para este fin es una industria de alto valor y con un importante tamaño de mercado. Las microalgas no son solamente consideradas como fuentes esenciales de alimentación en acuicultura sino que también juegan un papel importante en el incremento de la calidad de las especies animales cultivadas. El contenido en aminoácidos, ácidos grasos, así como otras biomoléculas, influye de forma determinante en el desarrollo de larvas y bivalvos (Fujimura et al., 1972; Cohen et al., 1976; Malecha, 1983). Hoy en día existen más de 40 especies diferentes utilizadas en acuicultura, seleccionadas según su aporte nutricional y la facilidad de su producción masiva. Respecto a la producción de compuestos de alto valor, las microalgas se caracterizan por tener una composición bioquímica compleja, rica en sustancias de protección frente a factores ambientales adversos, lo que las hace especialmente interesantes para la producción de este tipo de compuestos. Actualmente existe un amplio abanico de productos de interés que se obtienen comercialmente de microalgas, como es el caso de ficobiliproteínas, carotenoides, ácidos grasos poliinsaturados y polisacáridos, empleando para ello especies como Spirulina, Dunaliella, Porphyridium, Chlorella, Scenedesmus, Muriellopsis o Haematococcus. 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 8 2.1.1.- LAS MICROALGAS FRENTE A CULTIVOS CONVENCIONALES Las microalgas, constituyen un grupo de microorganismos fotosintéticos extraordinariamente eficientes en lo que se refiere a la conversión de energía luminosa en energía química almacenada. Así, son más eficientes que las plantas oleaginosas en la captura de la energía solar, pudiendo llegar a alcanzar rendimientos fotosintéticos muy altos (hasta el 5%) con una organización celular más simple. La producción de biomasa a partir de microalgas es notablemente superior a la de los cultivos agrícolas convencionales, del orden de 50 a 200 toneladas (peso seco) por hectárea y año. Los requerimientos para su crecimiento como luz, azúcares, dióxido de carbono, nitrógeno, fósforo y potasio son bajos y tienen alta capacidad para producir sustancias como lípidos, proteínas y carbohidratos en grandes cantidades y en cortos periodos de tiempo (Brennan y Owende, 2010). Por otro lado, los cortos tiempos de generación permiten un rápido crecimiento y la rápida recuperación del cultivo en caso de que se produzca algún contratiempo o invasión del zooplancton, precisando su cultivo de una superficie muy pequeña en comparación con otros como la soja, maíz, etc. (Tabla 2.1). Tabla 2.1 Superficie de terreno necesaria para producir 1 kg de proteína (Henrikson, 1994). Cultivo Superficie (m2) Calidad del Terreno Alga Spirulina (65% proteína) 0,5 Estéril Soja (34% proteína) 16 Fértil Maíz (9% proteína) 22 Fértil Buey alimentado con grano (20% proteína) 193 Fértil 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 9 Por otra parte, las microalgas presentan la posibilidad de crecer en aguas salobres o marinas (Verma et al., 2010), e incluso con residuos orgánicos, pudiéndose así aprovechar aguas no aptas para la agricultura tradicional ya que el consumo de nutrientes que necesitan es pequeño en comparación al gran aporte que de ellos precisa dicha agricultura (como ejemplo, el cultivo de microalgas necesita una cantidad de agua cinco veces menor que los tradicionales cultivos de alfalfa y maíz) (Tabla 2.2). Tabla 2.2 Agua necesaria para producir 1 kg de proteína (Henrikson, 1994). Cultivo Litros Calidad del agua Alga Spirulina (65% proteína) 2.498 Salobre Soja (34% proteína) 8.860 Dulce Maíz (9% proteína) 12.416 Dulce Buey alimentado con grano (20% proteína) 104.000 Dulce El cultivo comercial de microalgas a gran escala comenzó al inicio de la década de los 60 en Japón con el cultivo de Chlorella, seguido por el establecimiento de mejoras en el cultivo y cosecha de Arthrospira en el lago Texcoco a principios de los 70. En 1980 ya había en Asia 46 fábricas de producción a gran escala, capaces de producir 1000 kg de microalgas (principalmente Chlorella) por mes. En 1986, la producción comercial de Dunaliella salina como fuente de -caroteno, por las empresas Western Biotechnology (Hutt Lagoon, Australia) y Betatene (Whyalla, Australia), llegó a ser la tercera industria microalgal más importante. Poco después se establecieron plantas en Israel y EE.UU., a la vez que en India comenzó la producción a gran escala de cianobacterias (Spolaore et al., 2006). La biodiversidad de microalgas es enorme, existiendo actualmente miles de especies distintas. Esa gran diversidad y consecuente variabilidad en la composición bioquímica de la biomasa obtenida de cultivos de microalgas, unida a la mejora genética y al establecimiento de tecnología de producción masiva que se han producido en los 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 10 últimos 30 años, han permitido cultivar comercialmente varias especies, siendo la producción actual de biomasa microalgal de 5.000 T (peso seco). En este sentido, el objetivo del cultivo de microalgas no es sólo la elaboración de alimentos, sino también la obtención de compuestos naturales con alto valor biotecnológico en el mercado: ácidos grasos poliinsaturados, carotenoides, ficobiliproteínas, polisacáridos, vitaminas, esteroles, antioxidantes, compuestos reductores de colesterol, etc., (Olaizola, 2003; Derner et al., 2006; Cadoret y Bernard, 2008). Con fines comerciales, las microalgas se cultivan en sistemas abiertos o en fotobiorreactores cerrados. Los sistemas abiertos presentan problemas de contaminación de cultivos y dificultad de control de las variables de funcionamiento y por estas razones la producción masiva de microalgas se lleva a cabo en fotobiorreactores cerrados que operan en condiciones controladas, con el fin de obtener productividades elevadas y una biomasa más uniforme en su composición y ritmo de producción (Imagen 2.2.). En los últimos años se han producido avances significativos en el desarrollo y diseño de fotobiorreactores cerrados, consiguiéndose sistemas más baratos, productivos y estables. Hoy en día, debido a la mejora en los diseños con la introducción de nuevos materiales y al abaratamiento de las materias primas, existen en operación reactores cerrados de gran capacidad, con elevadas productividades de hasta 2 g.L-1.día-1 (Acién et al., 1998; Pulz, 2001; Verma et al., 2010). 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 11 a) b) c) Imagen 2.2 Diferentes fotobiorreactores utilizados para el cultivo de microalgas: a) Fotobiorreactor tubular en columna de burbujeo; b) Fotobiorreactor vertical plano; c) Fotobiorreactor tubular horizontal. (Gentileza Dpto. Ingeniería Química, Universidad de Almería). 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 12 2.1.2.- APLICACIONES Durante siglos se han aprovechado limitadamente las ventajas de las poblaciones naturales de microalgas. Sólo recientemente (segunda mitad del siglo XX), se ha intensificado su estudio científico y se ha llegado a desarrollar parcialmente el potencial de la biotecnología microalgal, introduciéndose nuevos procesos y obteniéndose una gran variedad de productos de alto valor. Hoy en día una de las principales áreas de investigación en ciencia y tecnología de la alimentación, es la extracción y caracterización de nuevos productos naturales con actividad biológica, por ejemplo antioxidantes, antivirales, antihipertensivos, etc., que pueden contribuir al bienestar de los consumidores como parte de nuevos alimentos funcionales o nutraceúticos (Ruiz, 2012). En este sentido, el gran potencial de la biotecnología de microalgas se extiende a la producción de una serie enorme de productos, entre los que se incluyen alimentos saludables, productos químicos industriales y compuestos con aplicaciones terapeúticas, aunque para la mayoría de esas aplicaciones el mercado está todavía en desarrollo y el uso biotecnológico de microalgas se extenderá probablemente a nuevas áreas (Olaizola, 2003; Mendiola et al., 2008; Raja et al., 2008). Como ejemplo, cabe destacar a las cianobacterias o algas verde-azuladas, que son organismos procariotas fotosintéticos y se han venido utilizando como alimento para humanos en determinadas regiones del planeta. Así, son reconocidas como fuente de vitaminas y proteínas y como tal se distribuyen como comida saludable en todo el mundo. También es conocido que son fuente de compuestos para química fina, combustibles renovables y compuestos bioactivos que poseen propiedades antivirales, antitumorales, antibacteriales y como aditivos alimentarios (Singh et al., 2005). 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 13 Utilización en alimentación El primer uso conocido de microalgas data de hace unos 2000 años, cuando en China se empleaba la especie Nostoc para combatir la hambruna (Spolaore et al., 2006). El alga verde-azulada Spirulina, que crece espontáneamente en los lagos de Chad (África central) y Texcoco (México) entre otros, se recolecta desde tiempo inmemorial para su consumo, después de secada al sol y mezclada con granos de cereales, por los pueblos Kanenbou y Azteca. También existen referencias del consumo humano de algas verde- azuladas fijadoras de nitrógeno (como Aphanizomenon) en otros países como Chile, Perú y Filipinas. Las microalgas poseen excelentes cualidades para ser empleadas en la alimentación animal así como en la humana. La calidad de la biomasa de microalgas viene dada por la ausencia de tejidos y órganos no aprovechables, así como por el bajo contenido en materiales estructurales. Algunas especies no tienen celulosa dura en la pared celular, lo que facilita la digestión y asimilación de las proteínas por el organismo humano, y contienen cantidades favorables de ácidos grasos insaturados, muy poco colesterol y una cantidad moderada de carbohidratos, factores que reducen las afecciones coronarias y la obesidad, objetivos importantes en la sociedad actual (Durand- Chastel, 1980). Por otro lado, algunas especies de microalgas poseen un alto contenido en proteínas (pudiendo alcanzar valores de proteína bruta del orden del 50 al 70% del peso seco), carbohidratos y lípidos. Así, poseen porcentajes comparables e incluso superiores a los de otras fuentes tradicionales de proteínas (Tabla 2.3). Las proteínas de microalgas presentan un aminograma bastante equilibrado, similar al de la harina de soja o de pescado, así como al estándar de la FAO, siendo únicamente algo deficientes en aminoácidos azufrados (Tabla 2.4). Los estudios de digestibilidad llevados a cabo con distintas especies de microalgas en diversos grupos de animales (peces, moluscos, aves, rumiantes, etc.), han arrojado resultados satisfactorios. 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 14 Tabla 2.3 Comparación de la composición de alimentos y microalgas (% peso seco) (Spolaore et al., 2006; Bruton et al., 2009). MATERIA PROTEÍNAS CARBOHIDRATOS LÍPIDOS Levadura 39 38 1 Carne 43 1 34 Leche 26 38 28 Arroz 8 77 2 Soja 37 30 20 Alga Anabaena cilíndrica 43-56 25-30 4-7 Alga Chlamidonomas rheinhardii 48 17 21 Alga Chlorella vulgaris 51-58 12-17 14-22 Alga Chlorella pirenoidosa 57 26 2 Alga Eugleria gracilis 39-61 14-18 14-20 Alga Tetraselmis maculata 52 15 3 Alga Dunaliella bioculata 49 4 8 Alga Dunaliella salina 57 32 6 Alga Porphyridium cruentum 28-39 40-57 9-14 Alga Scenedesmus obliquus 50-56 10-17 12-14 Alga Scenedesmus dimorphus 8-18 21-52 16-40 Alga Spirulina platensis 46-63 8-14 4-9 Alga Spirulina máxima 60-71 13-16 6-7 Alga Synechococcus sp. 63 15 11 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 15 Tabla 2.4 Aminoácidos esenciales del huevo entero, caseína y algunas especies de microalgas. (Valores en g por 100 g de proteína). a) Durand-Chastel, 1980; b) Barbarino y Lourenco, 2005. Aminoácidos Huevo entero (a) Caseína (a) Spirulina Máxima (a) Chlorella Pyrenoidosa (a) Porphyra Acanthophora (b) Pterocladiella capillacea (b) Isoleucina 6,6 9,7 5,8 3,4 4,1 3,7 Leucina 8,8 9,7 8,3 6,0 8,1 6,8 Lisina 4,6 2,6 4,5 4,5 6,3 7,9 Metionina 3,1 3,6 1,8 2,0 1,1 1,1 Fenilanalina 5,8 3,9 5,2 7,2 4,7 5,3 Treonina 5,1 3,9 4,6 5,2 5,8 5,2 Triptófano 1,6 2,2 1,1 1,1 -- -- Valina 7,3 7,9 6,6 6,2 6,4 5,5 Por otra parte, el contenido en vitaminas y minerales se suma al interés alimenticio de las microalgas. Representan una fuente de casi todas las vitaminas esenciales (A, B1, B2, B6, B12, C, E, biotina, ácido fólico y ácido pantoténico (B5)). Además son ricas en pigmentos como clorofila, carotenoides y ficobiliproteínas (Spolaore et al., 2006). Por ejemplo, la especie Porphyridium cruentum, contiene carotenos, vitaminas, hidratos de carbono y elementos tales como sodio, potasio, magnesio, hierro, cobre, zinc, cromo, manganeso y cobalto (Rebolloso et al., 2000). La especie Spirulina platensis también contiene aminoácidos esenciales, vitaminas, sustancias minerales, ácidos grasos indispensables, polisacáridos, -caroteno y otros pigmentos (Blinkova et al., 2001). Actualmente las microalgas para alimentación humana se presentan en el mercado en diferentes formatos comerciales como tabletas, cápsulas y líquidos. También se encuentran incorporadas a pastas, aperitivos, bebidas, golosinas o chicles (Yamaguchi, 1997; Liang et al., 2004). Aplicaciones clínicas En cuanto a las aplicaciones clínicas de las microalgas, se han realizado numerosos estudios que demuestran sus beneficios terapéuticos. Así, la especie Spirulina platensis se usa como nutraceútico alimenticio por sus beneficios terapéuticos en una serie de afecciones tales como enfermedades cardiovasculares, inflamatorias, hipercolesterol, hiperglucemia, cáncer y enfermedades virales. Los beneficios 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 16 cardiovasculares de Spirulina son el resultado de sus actividades hipolipídicas, antioxidantes y antiinflamatorias (Deng y Chow, 2010). Además, produce efectos inmunoestimulantes aumentando la resistencia de seres humanos, mamíferos, gallinas y pescado a infecciones, estimulando la producción de anticuerpos y contribuyendo a la preservación de la microflora intestinal (Blinkova et al., 2001). Por otro lado, porciones sulfolipídicas presentes en los glucolípidos de algunas algas como Lyngbya, Oscillatoria, Anabaena y Spirulina, han demostrado ser efectivas contra el virus del sida (Gustafson, 1989; Blinkova et al., 2001). Estudios farmacológicos de extractos hidrosolubles de Chlorella stigmatophora y Phaeodactylum tricornutum, indican que ambas especies muestran actividad antiinflamatoria, analgésica y antirradicales libres (Guzmán et al., 2001). La especie Arthrospira aporta varios beneficios a la salud como alivio de la hiperlipidemia, supresión de la hipertensión, protección contra enfermedades renales, promoción del crecimiento del Lactobacillus intestinal y supresión de los niveles elevados de glucosa en sangre. Otro ejemplo es la especie Chlorella, que se muestra eficaz contra la úlcera gástrica, las heridas y el estreñimiento, previene la arteriosclerosis y el colesterol, reduce los lípidos en sangre y tiene acción antitumoral (Yamaguchi, 1997; Liang et al., 2004; Jong-Yuh y Mei-Fen, 2005). Alimentación animal Las microalgas pueden ser utilizadas como alimento para una gran variedad de animales, que van desde peces (acuicultura), hasta mascotas o animales de granja. De hecho, el 30% de la producción mundial de microalgas se vende para alimentación animal (Becker, 2004). Por ejemplo, la especie Arthrospira se usa como alimento para muchos tipos de animales como gatos, perros, peces de acuario, pájaros ornamentales, caballos, vacas y crías de toro. Así, aporta vitaminas naturales, minerales y ácidos grasos esenciales, mejorando la respuesta inmunitaria, la fertilidad y el control de peso, así como la apariencia externa a través de una piel saludable (Certik y Shimizu, 1999). La acuicultura es una de las áreas de mayor crecimiento en el campo de la producción de alimentos en los últimos años. Ésta va aumentando su producción cada día, tanto en cantidad como en variedad de nuevas especies, siendo una parte cada vez más importante respecto al volumen de capturas en el mar. 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 17 En este sentido, la demanda actual de pescado es más grande de la que el océano puede aportar, por lo que las predicciones sugieren que la acuicultura puede ser muy necesaria en un futuro inmediato (Arthur, 2009). La importancia del cultivo de microalgas en acuicultura estriba en la posición basal que éstas ocupan en la pirámide alimenticia. La capacidad que poseen de convertir sales inorgánicas en compuestos orgánicos con la ayuda de la luz (fotosíntesis), las hace imprescindibles en la producción de alimentos (Tamiya, 1957; Starr, 1971). En este sentido y dado que las microalgas son el punto de inicio biológico del flujo de energía a través de las más importantes cadenas alimenticias acuáticas, puede entenderse el hecho de que la obtención y manipulación de estos microorganismos, sea una parte fundamental dentro del diagrama de operaciones acuícolas. En 1999 la producción de microalgas para acuicultura alcanzó las 1.000 T (62% para moluscos, 21% para camarones y 16% para pescado) como parte de una producción mundial de acuicultura de 43∙106 T (Muller-Feuga, 2000). Las microalgas juegan un papel muy importante para el desarrollo de peces, moluscos y crustáceos, al menos durante las fases larvaria y post-larvaria. Su presencia influye también en el contenido de oxígeno y anhídrido carbónico del medio, lo cual afecta de forma directa al crecimiento de la fauna de los ecosistemas acuáticos (Pruder, 1983). Existen varias posibilidades para la utilización de microalgas en la alimentación de las larvas de peces, moluscos y crustáceos, así como de los animales adultos. Lo más usual es la aplicación directa de las microalgas a estos consumidores. En este sentido, se utilizan determinadas especies cultivadas para este fin y que resultan imprescindibles en la dieta de muchos moluscos marinos bivalvos (e.g. ostras y almejas), larvas de algunos crustáceos y gasterópodos (abalone), larvas de gambas (Penaeus y Metapenaeus), algunos peces (e.g. Tilapia y carpas), rotíferos y zoopláncton (Kanazawa et al., 1985; Lavens et al., 1995; Reitan et al., 1997; Knauer y Southgate, 1999). Aunque para algunos peces y moluscos las algas pueden no ser esenciales, el aporte de las mismas como nutriente aumenta significativamente su supervivencia, debido probablemente a que añaden un factor de crecimiento o producen una acción bactericida en el medio (Cohen et al., 1976; Malecha, 1983). Hoy en día existen más de 40 especies diferentes de microalgas de aplicación práctica en acuicultura, aisladas en diferentes partes del mundo y cuyo tamaño oscila desde unos pocos µm hasta más de 100 µm. Para su uso en acuicultura, las microalgas deben cumplir varios criterios como 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 18 facilidad de cultivo, forma y tamaños adecuados, altos valores nutricionales y digestibilidad de sus células para facilitar el acceso a los nutrientes (Brown et al., 1999). Las microalgas son incluso utilizadas en el refinamiento de la acuicultura, y así, por ejemplo, se utiliza Haslea ostrearia para dar color verde-azulado a las agallas y el apéndice móvil de las ostras (técnica francesa), lo que incrementa el valor del producto en un 40% (Muller-Feuga, 2000). Fuente de productos químicos naturales Otra importante utilidad de las microalgas es la obtención de productos químicos naturales. Las algas de tamaño macroscópico se cosechan por su contenido en polisacáridos, incluido el agar y el ácido algínico, los cuales se extraen comercialmente a gran escala. Las microalgas han desarrollado diferentes estrategias para su supervivencia en condiciones extremas de forma que, mediante simulación de estas condiciones en los sistemas de cultivo, el metabolismo celular puede dirigirse hacia la biosíntesis de las sustancias cuya producción se persigue (Gudin y Thepenier, 1986). Obtención de proteínas La obtención de proteínas a partir de microalgas fue una de las primeras aplicaciones en desarrollarse dentro de este campo, al igual que se hacía con cultivos de bacterias o levaduras, utilizados desde hace tiempo como fuentes de proteínas de origen unicelular. Hay que considerar que el contenido en proteínas de las microalgas varía en función de la especie y puede llegar a ser superior al 50% de la biomasa seca. Obtención de vitaminas Las vitaminas sintetizadas por las microalgas que pueden dar lugar a un aprovechamiento comercial, son principalmente la B12 y la vitamina E (Tocoferol). Sin embargo, son capaces de sintetizar la mayoría de las vitaminas y los contenidos observados de las mismas, son perfectamente comparables a los encontrados en otros microorganismos, como levaduras y bacterias. 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 19 Numerosas vitaminas hidrosolubles han sido detectadas en el sobrenadante de los cultivos de microalgas, pudiendo ser excretadas por estos microorganismos de forma activa como resultado de su metabolismo, o bien pasar a formar parte del sobrenadante una vez que la microalga ha muerto y su biomasa se ha desintegrado. En algunas ocasiones, la proporción de vitaminas que son excretadas al medio, puede llegar a ser muy elevada. Por ejemplo, Koptera (1970) señala que la microalga verde-azulada Anabaena hassali, excreta hasta el 94% de su contenido en biotina. La microalga Phaeodactylum tricornutum, cuenta en su composición bioquímica con determinadas vitaminas, como pueden ser la B1 y la biotina (ambas segregadas al medio), así como la B12, la cual permanece en el interior celular. Obtención de pigmentos Como organismos fotosintéticos, las microalgas contienen pigmentos antena que, bajo ciertas condiciones fisiológicas, pueden acumularse en la célula, alcanzando notables concentraciones. El principal pigmento son las clorofilas, compuestos esenciales en muchos productos diarios. Así, se usan como aditivos en productos cosméticos y farmacéuticos, pero también como biocolorantes en alimentación y tienen propiedades antioxidantes y antimutagénicas (Hosikian et al., 2010). Además de las clorofilas, los pigmentos más importantes desde el punto de vista económico son las biliproteínas como ficocianinas y ficoeritrinas, así como una gran variedad de carotenoides, de los que existen unos 400 tipos diferentes. Sin embargo, de éstos sólo se explotan comercialmente unos pocos, entre los que se encuentran: - caroteno, zeaxantina, astaxantina y luteína. Estos pigmentos tienen aplicación en las industrias farmaceútica y alimentaria como colorantes naturales, potenciadores de la pigmentación de aves de corral, en cosmética, como precursores de la vitamina A, etc. (Borowitzka, 1988). El organismo más utilizado para la producción de -caroteno es la especie Dunaliella salina con un 14% de su peso seco (Metting, 1996). La astaxantina es usada como pigmento en la industria del salmón y se extrae principalmente de la microalga Haematococcus pluvialis, donde puede alcanzar contenidos entre 1,5 y 3% de peso seco (Todd Lorenz y Cysewski, 2000). Aunque por su mayor precio no puede competir con su forma sintética, para ciertas aplicaciones como la alimentación de carpas, pollos y bremas rojos se utiliza la astaxantina procedente de microalgas por las exigencias reguladoras y por la preferencia de los consumidores hacia los productos naturales (Cysewski y Todd Lorenz, 2004). 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 20 Obtención de polisacáridos Otros productos obtenidos de las microalgas, que encuentran gran aplicación en la industria, son los polisacáridos. Las especies comercialmente más prometedoras son las algas rojas unicelulares Porphyridium cruentum y Porphyridium aerugineum, que bajo determinadas condiciones de crecimiento pueden producir cantidades importantes de polisacáridos extracelulares, constituidos por los siguientes monómeros: D-glucosa, D- y L-galactosa, 3-0-metilxilosa, 3- y 4-0-metilgalactosa y ácido D-glucurónico (Richmond, 1990). Su competencia la encuentran en las macroalgas que sintetizan polisacáridos, principalmente alginatos, carragenatos, agarosa, así como en ciertas bacterias y hongos. La particularidad desde el punto de vista químico de los polisacáridos producidos por Porphyridium es que están sulfatados, como ocurre con los carragenatos, compuestos de xilosa, glucosa y galactosa. Así, estos compuestos son considerados antiinflamatorios efectivos para uso tópico (Matsui et al., 2003). Obtención de lípidos Los lípidos contenidos en las microalgas son fundamentalmente ésteres de la glicerina y ácidos grasos, con un número de átomos de carbono comprendidos entre 12 y 24. Casi todos los ácidos grasos encontrados en los lípidos de las microalgas, están formados por cadenas moleculares lineales, con un número par de átomos de carbono. Los más interesantes comercialmente son los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA´s), en general, y los ácidos grasos esenciales (EFA´s), en particular. Los EFA´s para nutrición humana son los ácidos linoleico, araquidónico, linolénico y eicosapentaenoico. Excepto el linoleico, estos ácidos grasos son poco frecuentes en los animales y plantas superiores, estando presentes en cantidades relativamente grandes en algunas especies de microalgas. Obtención de isótopos bioquímicos estables Las microalgas son fuente de compuestos marcadores isotópicos estables. La habilidad para llevar a cabo la fotosíntesis les permite incorporar isótopos estables (13C, 15N y 2H) de moléculas inorgánicas de bajo coste (13CO2, 15NO3 y 2H2O) a compuestos orgánicos de alto valor como aminoácidos, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos. Los isótopos estables se usan para dos fines: la incorporación dentro de proteínas, carbohidratos y ácidos nucleicos para facilitar su determinación estructural a nivel 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 21 atómico y para estudios metabólicos a través del incremento de masa de los compuestos etiquetados (Apt y Behrens, 1999; Acién et al., 2003). Obtención de biocombustibles Las algas, particularmente las microalgas unicelulares verdes, se vienen proponiendo desde hace tiempo como potenciales fuentes de biofuel (Oswald y Golueke, 1960; Benemann et al., 1977). En la actualidad existen numerosos proyectos de investigación que utilizan los cultivos de microalgas para la producción de biocombustibles. Así, mediante este tipo de cultivos se obtiene biodiesel, bioetanol, biohidrógeno y biogás (Chisti, 2007; Seefeldt, 2007; Li et al., 2008). Según las predicciones tecnológicas, la tercera generación de biocombustibles derivará de las microalgas, ya que no presentan algunas de las desventajas de los de primera y segunda generación, como son la necesidad de gran superficie de cultivo y de agua (Costa y De Morais, 2011). Así, numerosos estudios argumentan que la producción de biofuel a partir de microalgas, particularmente la producción de biodiesel, es económica y medioambientalmente sostenible (Huntley y Redalje, 2007; Chisti, 2008; Brune et al., 2009; Stephen et al., 2010) aunque también existen algunos puntos de vista escépticos sobre su viabilidad (Reijnders, 2008; Walker, 2009; Van Beilen, 2010). Este tipo de investigaciones han cobrado mucha importancia, ya que, además de producir biocombustibles, suelen tener como objetivo paralelo y complementario, la reducción de problemas ambientales. Así, uno de los problemas ambientales actuales es el progresivo avance y acumulación en la atmósfera de los gases de efecto invernadero, de los cuales el más importante es el CO2. En este sentido, se están desarrollando los cultivos de microalgas y utilizando el CO2 procedente de las líneas efluentes industriales, como fuente de gas nutriente (Chang y Yang, 2003; González et al., 2009; Stephen et al., 2010). Otra aplicación cada vez más utilizada es la eliminación de compuestos químicos contaminantes en aguas residuales mediante el cultivo en las mismas de microalgas, las cuales a través de su metabolismo pueden eliminar distintos elementos como nitrógeno y fósforo (Hoffmann, 1998; Mallick, 2002; Aslan y Kapdan, 2006; Hernández et al., 2006; Hameed, 2007; De-Bashan y Bashan, 2010; Pittman et al., 2011). 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 22 Utilización en cosmética Algunas especies de microalgas son utilizadas en la formulación de ciertos productos para el cuidado de la piel, como, por ejemplo, cremas antiedad, productos refrescantes, antirritantes, regenerantes de la piel y emolientes. Entre ellas destacan Arthrospira y Chlorella (Stolz y Obermayer, 2005). También se encuentran microalgas en productos para el cuidado del cabello y protectores solares. Algunas empresas cosméticas han invertido en su propio sistema de producción de microalgas (Spolaore et al., 2006). 2.1.3.- CULTIVO Y PRODUCCIÓN DE SCENDESMUS ALMERIENSIS El alga utilizada en esta Tesis ha sido Scenedesmus almeriensis, cultivada en el Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Almería (Sánchez et al., 2008a). Para el crecimiento y mantenimiento de esta microalga se ha empleado como medio de cultivo el propuesto por Mann & Myers (1968) (Tabla 2.5), modificado para prepararlo empleando fertilizantes agrícolas comerciales en lugar de productos químicos puros. El medio Mann & Myers consta de macronutrientes, cuya adición se realiza por pesada directa de sales y micronutrientes, en los que la baja concentración obliga a preparar una disolución stock concentrada. Para la preparación del medio de cultivo se emplea agua, y una vez añadidas todas las sales, se esteriliza en autoclave a 120 ºC durante 20 minutos. El cultivo de la microalga Scenedesmus almeriensis se realiza en fase líquida, en medio de cultivo Mann & Myers, en matraces esféricos de 1 L de capacidad, cerrando la parte superior con algodón hidrofóbico para facilitar el intercambio gaseoso (Imagen 2.3). Este cultivo no dispone de control de pH y se mantiene a una temperatura de 25 ºC. El caudal de aireación empleado es de 1 L/min (1 v/v/min) y luz continua de 540 µE/(m2·s) que proporcionan dos lámparas Philips TLD W/54. Al tratarse de cultivos discontinuos es necesario renovar los mismos de forma periódica cada cinco o seis días con medio nuevo y estéril. Esta operación se lleva a cabo en una campana de flujo laminar, para evitar la contaminación de los cultivos. 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 23 Tabla 2.5 Composición del medio Mann & Myers (1968). Macronutrientes Concentración, g·L-1 MgSO4·7H2O 1,20 NaNO3 1,00 CaCl2 0,30 K2HPO4 0,10 Micronutrientes Concentración, g·L-1 Na2EDTA 0,030000 H3BO3 0,006000 FeSO4·7H2O 0,002000 MnCl2 0,001400 ZnSO4·7H2O 0,000330 Co(NO3)2·6H2O 0,000007 CuSO4·5H2O 0,000002 Imagen 2.3 Matraces de mantenimiento y precultivo de la microalga. (Gentileza Dpto. Ingeniería Química, Universidad de Almería) Para la producción de biomasa de Scenedesmus almeriensis se han empleado fotobiorreactores tubulares tipo valla de 3 m3, disponibles en la Estación Experimental Las Palmerillas (Fundación Cajamar, Almería) (Imagen 2.4). Los reactores constan de un lazo de tubo de metacrilato de 90 mm de diámetro y una longitud de 400 m, a través del cual se recircula el cultivo desde una columna de burbujeo que se emplea para la eliminación de oxígeno, refrigeración, cosechado y aporte de medio. El diámetro de la columna de burbujeo es de 400 mm y en su interior dispone de un cambiador de calor por el que se 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 24 hace circular agua fría para mantener la temperatura del cultivo por debajo del valor límite para la microalga. El fotobiorreactor está equipado con los sistemas auxiliares necesarios para su adecuado funcionamiento como bomba centrífuga para la impulsión del cultivo a través del lazo, sistema de inyección de aire para la eliminación de oxígeno, suministro de CO2 al inicio del lazo, sistema de aporte de solución nutritiva y de cosechado del cultivo, sensores de pH, oxígeno disuelto y temperatura para el seguimiento del estado del cultivo, etc. Imagen 2.4 Fotobiorreactores tubulares empleados para la producción de biomasa de la microalga Scenedesmus almeriensis. (Gentileza Dpto. Ingeniería Química, Universidad de Almería). Estos reactores se inoculan con cultivo procedente de laboratorio y operan en modo continuo a una velocidad de dilución de 0,3 día-1. Para ello, el medio de cultivo se prepara añadiendo fertilizantes agrícolas a agua de riego y filtrándola mediante ultrafiltración (0,02 micras) antes de entrar a cada uno de los reactores a un caudal de 200 L/min en las horas centrales del día. El volumen de medio de cultivo añadido desplaza fuera del reactor un volumen idéntico que sale a través de una válvula en la parte superior del reactor, a modo de rebosadero. Este cosechado se recoge en un tanque de donde se centrifuga en continuo empleando una centrífuga de cámara y discos a un caudal de 1 m3/h. Se obtiene un agua clarificada que se emplea para riego agrícola, y un concentrado de microalgas con una concentración de 200 g/L. Este concentrado se liofiliza durante 24 h, obteniéndose la biomasa seca (Imagen 2.5), que a continuación se moltura y pasa a la etapa de extracción de antioxidantes o carotenoides. 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 25 a) b) Imagen 2.5 Imagen de la biomasa liofilizada de Scenedesmus almeriensis. a) Biomasa liofilizada fragmentada en porciones sin triturar. b) Biomasa liofilizada y posteriormente molturada en molino de bolas. Los resultados obtenidos por el Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Almería (Acién et al., 2012a) demuestran que es posible la producción a gran escala de Scenedesmus almeriensis en fotobiorreactores tubulares de gran volumen. La tecnología desarrollada resulta operativa y el rendimiento del sistema se ajusta a lo predicho por los modelos desarrollados, aunque con diferencias por las variaciones entre los sistemas de cultivo utilizados. Concretamente, existe una planta semi-industrial, compuesta de 10 fotobiorreactores de 3 m3, que ha operado de forma estable durante más de un año con una productividad de biomasa de 7 T·año-1. Este sistema es similar a otro desarrollado en Alemania, que con un volumen total de 700 m3 tiene una capacidad de producción de 130 T·año-1 de Chlorella (Pulz, 1998). Ambos sistemas son de los más grandes que existen actualmente para la producción de microalgas basada en tecnología tubular, aunque se están construyendo nuevas plantas, lo que pone de manifiesto la viabilidad técnica y económica alcanzada ya con este tipo de sistemas (Ruiz, 2012). 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 26 2.2.- CAROTENOIDES-ANTIOXIDANTES 2.2.1.- GENERALIDADES Los carotenoides son compuestos tetraterpenoides, formados por ocho unidades de isoprenos y biosintetizados a partir del precursor isopentenil pirofosfato, el cual proviene del ácido mevalónico. La cadena isoprenoide de los carotenoides es obtenida por la unión de cuatro unidades de isopentenil pirofosfato, seguido de la unión de dos unidades de geranil-geranil pirofosfato para dar el primer producto de cuarenta átomos de carbono, el fitoeno (Britton y Hornero-Méndez, 1997; Oliver y Palou, 2000). Este compuesto sufre reacciones de deshidrogenación que dan lugar a la formación de licopeno. Así, todos los carotenoides se consideran derivados del licopeno por reacciones de hidrogenación, ciclización, inserción de oxígeno, y migración de dobles enlaces y metilos, entre otras (Delgado-Vargas et al., 2000). Así, su estructura presenta muchos dobles enlaces conjugados y varias ramificaciones con grupos metilo. Los carotenoides se clasifican principalmente en dos grupos: carotenos y xantófilas. Los carotenos presentan una estructura que solo contiene carbono e hidrógeno; en tanto que las xantófilas, además de poseer carbono e hidrógeno, contienen oxígeno, en forma de grupos sustituyentes como hidroxilo, carbonilo y epóxido. Adicionalmente, existen otros carotenoides de menor tamaño denominados apocarotenoides, obtenidos a partir de rupturas de los tetraterpenoides en los carbonos 6, 9, 6´ o 9´; por ejemplo, la crocetina y la bixina (Britton, 1995; Krinsky y Johnson, 2005). En general, los carotenoides en sus extremos pueden ser lineales o cíclicos; por lo tanto, diferentes combinaciones de estas características estructurales han llevado a detectar más de 600 carotenoides distintos presentes en las plantas (González, 2010). Entre los carotenoides más comunes se encuentran el β-caroteno, licopeno, cantaxantina, astaxantina, β-criptoxantina, capsantina, zeaxantina y luteína, entre otros. La Tabla 2.6 muestra los principales carotenoides presentes en diferentes alimentos (González, 2010). 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 27 Tabla 2.6 Distribución de carotenoides mayoritarios presentes en diversos alimentos (González, 2010). Alimento Carotenoides mayoritarios Aceite (Olea europaea) Luteína, β-caroteno Albaricoque (Prunus armeniaca) β-caroteno Anacardo (Anacardium occidentale) β-criptoxantina, β-caroteno Brócoli (Brassica oleracea) Luteína, luteína epóxido, neoxantina Calabaza (Cucurbita moschata) α- y β-caroteno Ciruela (Spondias lutea) β-criptoxantina Guayaba (Psidium guajava) Licopeno, β-caroteno Lechuga (Lactuca sativa) β-caroteno, luteína, violaxantina, lactucaxantina Maíz (Zea mays) Luteína, zeaxantina Mango (Mangifera indica) Violaxantina, β-caroteno Melocotón (Prunus pérsica) β-criptoxantina, luteína Naranja (Citrus sinensis) Violaxantina, β-criptoxantina, luteína, Ortiga (Urtica dioica) Luteína, β-caroteno Papaya (Carica papaya) β-criptoxantina, β-caroteno Patata (Solanum tuberosum) Violaxantina, anteraxantina, luteína, lactucaxantina Pimiento rojo (Capsicum anuum) Capsantina, capsorrubina Pomelo (Citrus paradisi) Licopeno, β-caroteno Tomate (Lycopersicum esculentum) Licopeno, β-caroteno Yema de huevo Luteína Zanahoria (Daucus carota) α- y β-caroteno En general, los carotenoides no se encuentran muy presentes en los animales, ya que estos no son capaces de biosintetizarlos; sin embargo, estos pigmentos son fundamentales en su alimentación, pues son fuente de vitamina A. Existen algunas excepciones, como es el caso de la trucha y algunos crustáceos que deben su color rojizo a la presencia de astaxantina. Los carotenoides son los responsables de los colores amarillos, anaranjados y rojos que presentan los alimentos, los tallos, las flores y hojas de las plantas, las bacterias y algunos animales invertebrados marinos (Goodwin, 1965). En los tejidos verdes se localizan en los cloroplastos, y en los tejidos rojos, anaranjados y amarillos se encuentran en los cromoplastos (Britton y Hornero-Méndez, 1997). 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 28 Los carotenoides, junto con las antocianinas y clorofilas, son los pigmentos vegetales de mayor abundancia en la naturaleza. Por su diversidad estructural y numerosas funciones, están involucrados en la fotosíntesis y previenen y protegen la salud de los seres humanos, por su significativa actividad antioxidante. También se ha demostrado que los carotenoides intervienen en la respuesta inmune y en la comunicación celular in vivo, ya que regulan la expresión de algunos genes, como es el caso de los genes que producen el γ-interferón, el cual es responsable de regular las respuestas inflamatorias e inmunes. Solo algunos de los carotenoides presentes en los alimentos son precursores de la vitamina A1, como es el caso del β-caroteno y otros carotenoides que poseen anillo β no sustituido. Esta vitamina es importante en el proceso de la visión, mantenimiento epitelial, secreción de la mucosa y reproducción (Delgado- Vargas et al., 2000). Varios estudios epidemiológicos han mostrado una relación entre el alto consumo de frutas y vegetales, y una disminución en el riesgo de contraer enfermedades degenerativas como el cáncer, enfermedades cardiovasculares y degeneración macular, debido principalmente a la presencia de compuestos carotenoides con actividad antioxidante (Su et al., 2002). 2.2.2.- IMPORTANCIA NUTRICIONAL Además de la contribución de los carotenoides al color atractivo de las frutas y verduras, destaca, por su importancia a nivel fisiológico y dietético, la propiedad de tener actividad provitamina A (Isler, 1971; Simpson, 1983). La vitamina A es esencial para la visión nocturna y necesaria para mantener sana la piel. Puede aportarse como tal vitamina, llamada retinol, como algunos análogos menos activos, o como sus precursores, los carotenoides. El retinol es un alcohol cíclico, insaturado, de veinte átomos de carbono, compuesto por un núcleo de β-ionona y una cadena lateral insaturada. En la molécula de retinol (Figura 2.1) existen cinco dobles enlaces conjugados, incluido el doble enlace del anillo de β-ionona que está conjugado con los de la cadena lateral. 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 29 Figura 2.1 Estructura del retinol. La capacidad de los carotenos para actuar como provitamina A depende de la conversión en retinol por los animales, así como de la presencia de β-ionona. Los carotenos que contienen como mínimo un anillo de β-ionona pueden convertirse en retinol en los animales. De esta forma, el carotenoide más importante al respecto es el β- caroteno, que contiene dos de estos anillos (Figura 2.2). El α- y el γ-caroteno, sin embargo, no pueden convertirse en retinol en los animales con la misma eficacia que el β-caroteno, ya que el anillo α del γ-caroteno no puede convertirse en el organismo en β- ionona, y la estructura abierta de la cadena del γ-caroteno no puede hacerse cíclica en los animales. Por esta razón el α-caroteno y el γ-caroteno se transforman en retinol con la mitad de eficiencia que el β-caroteno. La actividad biológica del anillo de β-ionona en los carotenos cesa por la introducción de un grupo hidroxilo. La β-criptoxantina, con un anillo de β-ionona sustituido por un hidroxilo y el otro intacto, tiene la misma actividad provitamínica A que el α- y γ-caroteno. La zeaxantina tiene dos anillos de β-ionona hidroxilados, por lo que no actúa como provitamina A (Meléndez-Martínez et al., 2004a). En la actualidad el término provitamina A se usa para todos los carotenoides que presentan cualitativamente la actividad del β-caroteno. Nutricionalmente el carotenoide provitamínico más importante es el β-caroteno, que se definía hasta hace poco como el que tenía 1/6 de la actividad del retinol. En realidad, resulta bastante difícil hacer una estimación exacta de los equivalentes de retinol, ya que la biodisponibilidad de los carotenoides, provitamínicos o no, depende de una serie de factores, como, por ejemplo, el tipo de carotenoide, la matriz en la que se encuentran, el procesado del alimento, interacción con otros carotenoides así como con la grasa y la fibra, estatus nutricional, edad e infección por parásitos, etc. Debido a todo ello, existe una importante controversia en torno a la utilidad de estos equivalentes. No obstante, en la actualidad, el comité que fija los niveles de ingesta de referencia (Dietary Reference Intake Committee) considera que un equivalente de retinol equivale a 12 µg de β-caroteno o a 24 µg de otros carotenoides provitamínicos. La molécula de β-caroteno es, en realidad, una estructura doble de retinol y, teóricamente, su división debería dar lugar a dos moléculas de retinol. La disparidad entre la estructura química y la actividad biológica del β-caroteno se debe, 2.- Antecedentes Tesis Doctoral 30 por una parte, a la absorción incompleta y, por otra parte, a la falta de estequiometría de la reacción, debido a la formación de metabolitos oxi